Штамм бактерий viвriо сноlеrае сноlеrае - продуцент дермонекротического фактора

Патент 1669980

Авторы

Классы МПК

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии. Целью изобретения является штамм VIBRIO CHOLERAE CHOLERAE В - 53 - 2 - 38, стабильно продуцирующий дермонекротический фактор в больших количествах. Штамм получен при длительных пасажах в бульоне Мартена, а затем на полужидком агаре с 1%-ной О-холерной сывороткой и депонирован во ВНИПЧИ "Микроб" под NKM-107 дермотоксина на искусственных питательных средах. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

f ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР lgqg g _#_e

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4690912/13 (22) 16.05.89 (46) 15,08,91, Бюл. ¹ 30 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) О.И.Помукина и В.С.Уралева (53) 616 г 32 (088 8) (56) Бактсриальные токсины. M . 1987, с, 117 вЂ” 121. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE

CHOLERAE вЂ” ПРОДУЦЕНТ ДЕРМОНЕКРОТИЧЕСКОГО ФАКТОРА

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии.

Цель изобретения вЂ” штамм Vibrio cholerae

cholerae В-53-2-38, способный стабильно и в больших количествах продуцировать ДНФ, безопасный в режимном отношении.

Штамм V. cholerae В-53-2-38 получен при длительных пассажах типичного штамма в щелочном бульоне Мартена, а затем на полужидком агаре с 1%-ной коммерческой

О-холерной сывороткой и депонирован в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института "Микроб" под номером

КМ-107.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические. В мазках из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Граму, клетки имеют вид рамотрицательных полиморфных слегка изогнутых и прямых палочек. Подвижен при росте в 0,3 ь-ном агаре Мартена.

На щелочном агаре Мартена при 37 С через 18 ч формирует колонии правильной округлой формы диаметром 2 мм с влажной блестящей поверхностью, прозрачные, голубоватые в проходящем свете. На щелоч„„Я2„„1669980 А1 (л1)5 С 12 N 1/20, А 61 К 39/106 (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии. Целью изобретения является штамм Vibrio cholerae

cholerae В-53-2-38, стабильно продуцирующий дермонекротический фактор в больших количествах. Штамм получен при длительных пассажах в бульоне Мартена, а затем на полужидком агаре с 1 ь-ной О-холерной сывороткой и депонирован во ВНИПЧИ

"Микроб" под № КМ-107 дермотоксина на искусственных питательных средах. 1 табл. ном бульоне вЂ” помутнение с нежной пленкой.

Биохимические. Штамм ферментирует глюкозу в аэробных и анаэробных условиях с образованием кислоты без газа, а также маннит, сахарозу, крахмал. Не расщепляет арабинозу, манноэу. лактозу, не образует сероводород, ацетилметилкарбинол, образует индол, обладает лизиндекарбоксилазой и не обладает дигидролазой аргинина.

Устойчив к 30 мкг полимиксина. не агглютинирует куриные эритроциты, Фаготипические. Штамм лизируется диагностическим классическим монофагом до рабочего разведения (10 э). Фагами эльтор и ХДФ-3. 4, 5 не лиэируется.

Серологические. Штамм не агглютинируется видоспецифической О-холерной сывороткой. Сывороткой RO агглютинируется до 1/4 титра, Непостоянно агглютинируется типоспецифическими сыворотками Инаба до 1/4 титра и Огава до 1/8 титра.

Ауксотроф. Стабильно вырабатывает

ДНФ в больших количествах, максимальный титр по кожной пробе 1/128. чаще 1/64.

Пример 1. Из суточной агаровой культуры готовят густую взвесь холерных

1669980 вибрионов и по 0.2 мл засевают на 20 чашек щелочного агара Мартена (рН 7,6), на поверхность которого наложены прокипяченные в течение 30 мин кружки целлофана. Культуру на мембране распределяют равномерным раскатыванием и, не переворачивая чашки, помещают их в термастат, выращивают при

37 С 24 ч. Затем на поверхность целлофана наливают пипеткой 2 мл физиологического раствора, осторожно смывают культуру шпателем и пипеткой отсасывают в пробирку, После этого определяют концентрацию вибрионов, которая должна быть не ниже 20 млрд. в 1 мл. К взвесям культур добавляют тиомерсал натрия до конечной концентрации 1:5000, хорошо перемешивают и оставляют в холодильнике до следующего дня, . После этого проверяют на специфическую стерильность, Обеззараженный материал центрифугируют при 6000 об/мин в течение

20 мин.

Для постоянства кожной пробы берут бесклеточный супернатант, Кожную пробу ставят на взрослых кроликах весом не менее 2,5 кг с белой здоровой кожей без крупных родимых пятен.

Накануне постановки опыта тщательно выбривают кожу животного на боках и спине.

Исследуемый материал титруют в физиологическом растворе двукратно от 1/2 до

1/128. Каждое разведение вводят строго внутрикожно, дублированно в два участка кожи в обьеме 0,1 мл туберкулиновым шприцем. Расстояыие между уколами не менее 3 см. Параллельно ставят контрольные пробы с физиологическим раствором, содержащим тиомерсал натрия в том же разведении, что и в опыте.

Первый учет результатов проводят через 24 ч. В положительных случаях на месте инъекции образуется эона некроза, которая распологается в центре папулы с эритемой.

Если она имеет диаметр 2-4 мм, реакция оценивается как слабоположительная, 5-10

45 мм вЂ” положительная и более 10 мм вЂ” резко положительная, Поскольку размеры зоны некроза не всегда удается определить достаточно четко, кролику вводят внутривенно

2 -ный раствор синьки Эванса из расчета 1 мл на 1 кг веса кролика как контрастирующее вещество, Последующий учет результатов проводят через 3 ч. В зону некроза синька не проникает, и она четко видна на фоне окрашенной кожи. В отрицательных случаях образуется папула с эритемой без эоны некроза, Воэможность выявления ДНФ зависит в известной мере от реактивности кроликов, поэтому рекомендуется использовать для опыта не менее двух особей.

Заключение о способности этого штамма продуцировать ДНФ дается на основании обнаружения его в кожной пробе при использовании укаэанных методик в титре не ниже 1/16.

В качестве контроля используют холерный штамм V. cholerae 569 В, Результаты приведены в таблице, Пример 2. Суточную агаровую культуру штамма КМ-107 засевают во флаконы емкостью 100 мл с 10 мл бульона Мартена (рН

7,6). Посевная доза 100 тыс. м.к. на 1 мл среды, Посевы выращивают при 37 С трое суток, затем культуры вибрионов убивают тиомерсалом натрия до конечной концентрации 1:5000 и далее поступают так, как описано в примере 1.

Очищенный препарат дермонекротического фактора может быть использован для дальнейшего выяснения его роли в патогенезе холеры, обусловленной типичными и измененными штаммами холерных вибрионов, при конструировании вакцинных препаратов, для получения на его основе диагностикумов и антисывороток.

Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae cholerae

KM 107 -продуцент дермонекротического фактора.

1669980

I 1

1 I

1 4Ч

1 43

Ч \ an

I Л

О О! I

I Л

CO CO

С С

4Ч N

О О

N 4Ч

C CO .Ч

CO C4 СЧ

lC и а

In (\ н

4 \

1 1

4 \ Л

an an

3Л

О Л /\ ln

С \

1 1

О О

ГЧ N

О О

N N Ф

\ Ъ

I 1

O CO

СЧ 1 4

О О

N N CO

\ \

1 1

4 л

СЧ N

4 л

4Ч N

Т I4

С 4 N N л т

N N

N 1 1

40 IC

41 l4

1 Cl

4 4

C В

an 0 О

1 ° О а ) In

C CO

0 Оа

) И

CO C

О 0

441

Э 4I

III O1 Э

44 4 14

Э I

° 4Ч °

О 1 р

Л 41 д

Ц ln ц

С! 4О

Ii г

Э 1

О 1

\ ц an

) Ф

4 Ъ й

44 Э

4I ? а в

4I Э

Р О4

I4 Э

4 °

1 1 1 1 I 1 1 1

1 1 1 I 1 1 1 1

1 1 I 1 1 1 I

1 4 I 1 1 I 1 1

1 W 1 1 I 1 1 1

CO 4О I 1 1 1 I 1

Ф Ф 1 1 1 1 1 I

О О

4Л и \ I I I 1

О О О О л л 4ч 44 I 1 1 1

О О О О

1 I » «! 1

4 Ъ 41 О 4Ч

4 4 I I Ф CO N N I I и и и

Cl 4I

IC и 14

Э ?

11 О и и х

М ЭЭ и О и О и

t! и

44 и

Э О

4l t:

4I CI

0 14

О а

С -Э и

l4 О и Э