Рекомбинантная плазмидная днк рrд 6 - источник зонда для тестирования представителей рода francisella, штамм бактерий еsснеriснiа coli, содержащий рекомбинантную плазмидную днк рrд 6 - источник зонда для тестирования представителей рода francisella

Рекомбинантная плазмидная днк рrд 6 - источник зонда для тестирования представителей рода francisella, штамм бактерий еsснеriснiа coli, содержащий рекомбинантную плазмидную днк рrд 6 - источник зонда для тестирования представителей рода francisella

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, генетической инженерии, биотехнологии и может быть использовано для обнаружения представителей рода FRANCISELLA методом молекулярной гибридизации. Цель изобретения - создание штамма E. COLI, содержащего рекомбинантную плазмиду с фрагментом ДНК, комплиментарным видоспецифическому участку хромосомной ДНК FRANCISELLA TULARENSIS. Плазмида является источником зонда для обнаружения франсисел. Сконструирован штамм путем введения в E. COLI JM 103 с помощью генетической трансформации искусственно полученной рекомбинантной плазмиды PRD 6 с фрагментом ДНК, комплементарным видоспецифическому участку хромосомальной ДНК туляремийного микроба. Плазмида является источником ДНК-зонда для обнаружения франсисел. Штамм депонирован в Музее живых культур Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института "Микроб" под номером E. COLIJM 103PRD 6 КМ 7. 1 табл.

СОЮЗ COBETCKMX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1669981 А1 ((9) () 1) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР ® НИ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4644591/13 (22) 07.01,89 (46) 15.08,91, Бюл. М 30 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) Л.В.Романова, Н.В.Павлович и Б.Н.Мишанькин (53) 575.224.2:577,2 (048) (088.8) (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК

pRD6 — ИСТОЧНИК ЗОНДА ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА FRANCISELLA, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, СОДЕРЖАЩИЙ РЕКОМБИНАНТНУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК pRD6 — ИСТОЧНИК ЗОНДА

ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ

РОДА F RAN C IS E LLA (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии, генетической инженерии, биотехнологии и может быть использовано

Изобретение относится к медицинской микробиологии, генетической инженерии, биотехнологии и может быть испольэовано для обнаружения представителей рода Francisella методом молекулярной гибридизации.

Цель изобретения — создание штамма

Е. coll, содержащего рекомбинантную плаэмиду с фрагментом ДНК, комплементарным видоспецифическому участку хромосомальной ДНК Francisella tularensls. Плазмида является источником ДНК-зонда для обнаружения франсисел, Для достижения поставленной цели конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК

pRD6, содержащую репликон вектора pUC19, по Есо Rl-caéòó которого встроен фрагмент (s()s С 12 N 15/31; С 12 0 1/68 для обнаружения представителей рода

Franclsella методом молекулярной гибридизации. Цель изобретения — создание штамма Е. coll, содержащего рекомбинантную плаэмиду с фрагментом ДНК, комплементарным видоспецифическому участку хромосомной ДН К Franclsella tularensls. Плаэмида является источником зонда для обнаружения франсисел. Сконструирован штамм путем введения в Е. coll IM 103 с помощью генетической трансформации искусственно полученной рекомбинантной плазмиды

pRD6 с фрагментом ДНК, комплементарным видоспецифическому участку хромосомальной ДН К туляремийного микроба. Плаэмида является источником ДНК-зонда для обнаружения франсисел. Штамм депонирован в

Музее живых культур Всесоюзного научноисследовательского противочумного института "Микроб" под номером Е. coll IM 103

pRD6 КМ7. 2 с. и. ф-лы, 1 табл.

ДН К длиной 790 п,о., комплементарный специфическому участку хромосомальной ДНК

Francisella tularensis, Плазмида неконъюгативна, амплифицируется при добавлении в среду хлорамфеникола.

Рекомбинантная плазмида pRD6 дли ной 3476 п.о.. содержит целый репликон вектора pUC19 длиной 2680 п,о,,по Есо Rlсайту которого встроен фрагмент ДНК длиной 790 п,о, (имеющий 3 сайта расщепления по AIuI и один сайт по Cfog, комплементарный специфическому участку хромосомальной ДНК Franclsella tularensis, ДНК-зонд синтезируется в процессе репликации рекомбинантной плазмиды эа счет репликона pUC19.

1669981

Штамм-продуцент зонда получают трансформацией Е. со!! 1И103 плаэмидой

pRD6. Рекомбинантная плаэмида выделяется из продуценга на стационарной фазе роста с выходом 2-3 мг/мл, Штамм-продуцент плазмиды pRD6 Е.

coll IM103 pRD6 KM характеризуется следующими признаками, Морфологические, Клетки штамма в мазках 18-часовых культур имеют вид грамотрицательных коротких полиморфных палочек размером 1 — 2 х 0,3 — 0,5 мкм, Неподвижны. На

LB-агаре в течение 18 ч при 37 С образуют колонии серовато-белого цвета. В бульоне через 18 ч вызывают помутнение среды, образуют на дне осадок. Устойчивы к ампициллину (100 мкг/M/l) и стрептомицину (100 мкг/мл).

Культуральные признаки и физиологобиохимические. Нуждается в п ролине,тиамине. Штамм ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, арабиноэу, галактозу, манноэу, Не ферментирует лактоэу. ЛиЭируЕтея кишЕчными фагами Т7 и Я .

Клетки штамма авирулентны для белых мышей и морских свинок при подкожном, аэрозольном и внутриконъюнктивальном заражении.

Получение плазмиды pRD6 и штамма

IM103 рй06 КМ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование плазмиды pRD6.

Хромосомальную ДНК туляремийного микроба выделяют методом щелочного лизиса с последующей обработкой фенолом и осаждением ДНК этанолом.

1 мкг вектора pUC 19 гидролизуют рестриктаэой EcoRI (5 ед.) в течение 1 ч при

37 С в буфере, содержащем 50 мМ трисHCI, рН 8,0, 10 MM MgClz, 50 мМ NaCI.

Полноту гидролиэа контролируют электрофорезом аликвоты (1/10 ч.) рестрикционной смеси в 0,8;ь-ном агарозном геле, Реакцию останавливают при 70 С (10 мин ) и ДНК осаждают из 0,3 M ацетата натрия (рН 4,8) этанолом. Хромосомальную ДНК туляремийного микроба гидролизуют EcoRI аналогично (3-4 мкг), Плазмидную и хромосомальную ДНК лигируют в 50 мкл буфера (50 мМ трис-HCI, рН 7,6, 10 мМ MgCly, 0,5 мМ

АТФ, 5 мМ ДДТ) в течение 10 ч при 10 С

ДНК-лигазой (фаза Т4), Реакцию контролируют электрофореэом в 0,8)ь-ном агароэном геле (1/10 ч,). Таким же количеством лигазной смеси трансформируют штамм Е, coll IM 103.

Выбор штамма обусловлен тем, что в присутствии pU C 19 он способен синтезировать фермент j3-ãàëaêòoýèäàýó эа счет комплементации дефектного хромосомального гена N-концевым фрагментом гена, находящегося на плазмиде, Эта способность штамма не проявляется в присутствии рекомбинант5 ной плаэмиды со встроенным по EcoRI ñàéòó фрагментом ДНК, длина которого не кратна трем, вследствие сдвига рамки считывания

j3-галактозидаэы. Клоны с такими рекомбинантными плазмидами, не обладающие /310 галактозидаэной активностью, могут быть отобраны на индикаторной среде с хромогенным субстратом X-gal по отсутствию голубой окраски.

Клетки культуры Е.coll !М 103, транс15 формированные лигазной смесью, высеивают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл X-gal и 240 мкг/мл индуктора-галактозидаэы ИПТГ (изопропил- j3-D-тиогалактопиранозида), Через

20 14-20 ч при 37 С на чашках вырастают голубые и белые колонии трансформантов.

Из отобранных белых рекомбинантных клонов выделяют плазмидную ДНК, которую затем анализируют рестриктазами.

25 Пример2.

1. Получение штамма-продуцента плазмиды pRD6.

Плазмидой pRD6 трансформируют штамм Е. coll IM 103, в результате чего пол30 учают продуцент плаэмиды pRD6. Плаэмидную ДНК выделяют из 500 мл стационарной культуры штамма Е. coll IM 103 pRD6 методом Бирнбойма и Доли.

2. Получение радиоактивного зонда для

35 видоспецифического определения франсисел.

Для получения зонда 10 мкг плаэмид-. ной ДН К гидролизуют в объеме 100 мкл рестриктазой EcoRI (20 ед.) в течение 1 ч при

40 37 С в буфере, содержащем 50 мМ трисHCI, рН 8,0, 10 мМ MgClz, 100 мМ NaCI.

Полноту гидролиза плазмидной ДНК проверяют электрофореэом аликвоты рестрикционной смеси в 0,8 -ном агароэном геле. К

45 гидролизату добавляют 3 мкм (pjdATP c удельной активностью 3000 кл/ммоль, по 2 мкл dTTP, dGTP с концентрацией 5 мМ/мл и 1 мкм(5-7 ед.) фрагмент Кленова ДНКполимеразы 1, Смесь инкубируют при

50 комнатной температуре 5-10 мин и после добавления 20 мкл 50 -ного глицерина с красителями разделяют электрофорезом в

5;4-ном полиакриламидном геле. Положение вырезанного из плазмиды фрагмента

55 ДНК определяют авторадиографией геля в течение 20 — 40 мин, Меченый фрагмент вырезают и элюируют из геля 0,3 М ацетатом натрия в течение 2 ч при 65 С. ДН К осаждают добавлением к элюату 10 мкг т-PHK-но1669981

Рглпг>се!!л tularensis

FraïñiseIIa с.nuviri

Fcc l>r r i cl> i a col i

Г< гс>п>л р< с<>с

Р< гс»>л pse>nlo >hercu los is (:> rc>nia enreruculitic1 (:< гс>п>л ! ncentii

t; гс>ч>л >п<>гп»л е.cl>!<глг усе >lu>n плл пегие>ппсл

Pacteuãå!Ià mu1tusiOa

К1<.hciе!Iл pneumuniл

Л!ел!>л nec iaecnlas

Рг»< еис»u I!tat!a

iIasillus subtil>s

Iп nolle рлглгур!»

shin I I л t crii

1! г и « I I,> и> < i t e n s i s

Пг<>< > 11,< a!>urtus

"r r<.lla c>ic!

2Ü

;.»< >п >

St repro<

Sr >phyla<

l ><л сcuc ру р< пеп

> гuc лпгеus сителя и 2,5 объемов 96 -ного этанола.

Осадок растворяют в 100 мкл дистиллированной воды и используют в качестве зонда при гибридизации колоний после 5-минутного прогревания при 100 С.

3. Использование зонда для гибридизации колоний разных видов микроорганизмов.

Клетки разных видов микроорганизмов наносят на нитроцеллюлоэные фильтры

СЫНПОР с помощью стеклянных палочек, Лизис клеток и гибридизацию при 65 С с зондом проводят следующим образом.

Фильтры с нанесенными на них колониями помещают на фильтровальную бумагу, смоченную 0,5 í. NaOH,è выдерживают 510 мин при комнатной температуре, Для нейтрализации фильтры помещают на фильтровальную бумагу (10 мин), пропитанную раствором 0,2 М трис-H Cl (рН 7,5), 1 М NaCI.

После 5 мин и росушивания на воздухе фильтры погружают на 15 мин в раствор, содержащий 300 мМ NaCI, 25 мМ йарНРО4, 50 мМ

ЭДТА (р 6,8). Затем фильтры высушивают при 800 в течение 2 ч.

Проводят гибридизацию, Высушенные фильтры помещают на 1 — 2 ч в раствор для предгибридизации, состоящий из 6 х SSC, 02;ь SDS, 5 х Denchardt, 100 мкг/мл ДНК из спермы лосося (однократный раствор SSC:

150 мМ NaCI. 15 мМ цитрата натрия; однократный Denchardt: фикол 0.01 ь, бычий сывороточный альбумин 0,01 g,, поливинилпирролидон

0,01 ). Иэ этого раствора фильтры переносят в раствор для гибридизации, состоящий иэ 4 х SSC, 0,2 SDS, 2 х Denchardt,100 мкгlмл ДНК лосося, к которому добавлен 1 мкг меченого зонда. Гибридизацию проводят при 65 С в течение 16 ч. Затем фильтры отмывают 2 раза по 30 мин при 65 С раствором, содержащим 2 х SSC, 0,2 SDS, и высушивают при 65 С. После авторадиографии фильтров регистрируют те штаммы, которые гибридиэуются с зондом.

Результаты гибридизации приведены в таблице, Как видно из таблицы, с зондом гибридизуются только представители рода

Franclsella, что позволяет испольэовать зонд для видоспецифического определения франсисел.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

pRD6 — источник зонда для тестирования бактерий рода Franclsella размером 3476 п.о. и содержащая ДНК вектора pUC 19, размером 2686 п.о.; EcoRI — EcoRl-фрагмент

ДНК хромосомы F, tularensls штамма 10/15 размером 790 п.о.; сайты рестрикции: 3 сайта расщепления по А!и1и однин сайтпо CfoI: генетические маркеры: amp -устойчивость к ампициллину.

2. Штамм бактерий Escherlchla coll КМ

7. содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pRD6 — источник зонда для тестирования бактерий рода Francisella.