Способ получения антигенов карбофоса

Способ получения антигенов карбофоса

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к иммунохимии (иммунобиотехнологии) и может быть использовано для получения антител к карбофосу, а также в иммуноанализе. Целью изобретения является повышение специфичности и антигенной активности. Новый ряд производных карбофоса, обладающий новым комплексом свойств, позволяет использовать их в качестве антигенов для получения антител, специфичных к карбофосу, и в иммунохимических способах определения карбофоса и его производных. Получение соединений данного класса осуществляют путем синтеза хлорангидрида карбофоса и конъюгирования его с высокомолекулярным носителем, содержащим аминогруппы. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (н)ю G 01 И 33/531

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ )л

О

О

О

00 (21) 4441575/13 (22) 15,06.88 (46) 15.08,91. Бюл. М 30 (71) Восточно-Сибирский технологический институт (72) Г.Л.Тумуров, С.Д.Жамсаранова, Б.Б.Дзантиев и В.Б.Сандаков (53) 632.95 (088.8) (56) J,lmmunol, Methods, 1982, ч,53, М 1, р.103 — 108.

Fut. J.lmmurlopharmacology. 1983, v.5, М 3. р.211 — 218, Fut. Arch. Allergy, 1970, ч.37, Рв 1, р.1—

13. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ

КАРБОФОСА

Изобретение относится к иммунохимии (иммунобиотехнологии) и может быть использовано для получения антител к карбофосу, а также в иммуноанализах: иммуноферментном и радиоиммунном способах определения карбофоса и его производных, Цель изобретения — повышение специфичности и антигенной активности.

Получение соединений данного класса осуществляют путем синтеза хлорангидрида карбофоса и коньюгирования его с высокомолекулярным аминосодержащим носителем.

1.1. Этерификация малеинового ангидрида: р

С вЂ” С g-60-65С СН - СООН и о+с,н ан—

С вЂ” С 2ъ Сн-СООСзН

0, Ж, „1670608 А1 (57) Изобретение относится к иммунохимии (иммунобиотехнологии) и может быть использовано доля получения антител к карбофосу, а также в иммуноаналиэе. Целью изобретения является повышение специфичности и антигенной активности, Новый ряд производных карбофоса, обладающий новым комплексом свойств, позволяет испольэовать их в качестве антигенов для получения антител, специфичных к карбофосу, и в иммунохимических способах определения карбофоса и его производных, Получение соединений данного класса осуществляют путем синтеза хлорангидрида карбофоса и коньюгирования его с высокомолекулярным носителем, содержащим аминогруппы. 1 табл.

Малеиновый Абсолютный Полуэфир ангидрид спирт малеи новой кислоты

1.2, Получение монокарбофосной кислоты реакцией присоединения диметилдитиофосфорной кислоты по двойной связи к полуэфиру малеиновой кислоты: (CH30) Р5Сн — СООН

II + (Сй О) Р ll

5 ь сн СООсдн

CH-C0OH +

СН -СООС Hs S 5 Сн - СООн

ll 1 (Ся 0) PSCH-COOC H

Иэомеры монокарбоновой кислоты при

20 — 22 С в течение 3 дней.

1,3. Получение хлорангидрида:

1670608

5 СН2-COOC2H) и + SOCt— (СН О)2РЬ СИ вЂ” СООН

ФО

1=60 66 С $ СН2 С-01

ll I (СНЗО)2РБСН вЂ” СООС2Н

Диметилформ амид

2. Получение конъюгата карбофос - R

S СН2 — СООС2Н5

1 + (НН2)ф п (CH)O)2P S CH — COCi

S СН2 — СООС2Н5

-3» II I (ин)„В (СИЗО)2Р С11

Пример 1, Получение хлорангидридов монокарбофосных кислот.

К 24,5 г расплавленного малеинового ангидрида (0,25 М) в 4-горлой колбе с обратным холодильником, нагретой на водяной бане до 50 — 55 С, по каплям приливают при непрерывном перемешивании 11,6 г абсолютного спирта (0,252 М). Температуру поднимают до 60 — 65 С и выдерживают 2 ч.

После охлаждения полуэфир малеиновой кислоты нейтрализуют насыщенным раствором карбоната катрия до рН 7,0 — 7,1.

Примесь среднего эфира мапеиновой кислоты удаляется 3-кратной экстракцией серным эфиром по 100 мл, Водный раствор подкисляют концентрированной серной кислотой до рН 3,0 и полуэфир экстрагируют 100 мл эфира 3 раза, Эфир из экстракта отгоняют водоструйным насосом и процедуру очистки полуэфира повторяют еще раз.

Продукт обезвоживают прокаленным сульфатом магния. Показатель преломления чистого полуэфира ю = 1,4548 -1,4550, Если показатель преломления продукта отличается от показателя чистого продукта, очистку повторяют еще раз. Выход полуэфира

30,4 г (84,4%), К 36 г 96,6 диметилдитиофосфорной кислоты (ДДФК) (0,22 М) в 30 мл бензола на водяной бане при перемешивании в течение 20 мин прикапывают 28,8 r полуэфира малеиновой кислоты (0,2 М). Реакционную смесь оставляют на 3 дня, периодически встряхивая колбу, Избыток ДДФК (3,16 г) нейтрализуют 10%-ным раствором бикарбоната натрия (16,6 мл). Нижний водный слой экстрагируют 10 мл бензола. Бензольные растворы объединяют, Бензоп отгоняют под вакуумом. Показатель преломления пп = 1,516. Выход монокар20 бофосфорной кислоты 49,8 r (80,84%).

В 4-горлую колбу с механической мешалкой и обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой, содержащую 20,6 с

55 монокарбофосной кислоты (0,116 M), 1 мл диметилформамида в качестве катализатора и 50 мл бензола, при перемешивании прикапывают 5,4 мл хлористого тионила в

20 мл бензола, Молярное соотношение реагентов 1:1,1. Температуру реакционной среды осторожно повышают до 60 С и выдерживают 2,0 — 2,5 ч. Бензол и избыток хлористого тионила отгоняют водоструйным насосом при 60 С в течение 2 ч. Полученный продукт — маслянистая прозрачная жидкость буро-коричневого цвета.

Вычислено, %: P 9,66; S 19,99; CI 11,05

Найдено, %: P 9,75; S20,,74: :CI 10.9.

Пример 2. Получение антигенов карбофоса. а. Конъюгат карбофос — человечий сывороточный альбумин.

5 г человечьего сывороточного альбумина (ЧСА) растворяют в 100 мл 0,1 M натрийфосфатного буфера(рН 8,0) при помешивании на магнитной мешалке, добавляют 20 мл ацетона, К раствору по каплям приливают 0,5 мл хлорангидрида карбофоса в 5 мл ацетона, рН среды, контролируемое рН-метром, поддерживают в пределах 7,6 — 8,0 добавлением 1

М NaOH. Среду выдерживают на водяной бане 2 ч. Коньюгат осаждают добавлением

49,0 r сульфата аммония (80%-ное насыщение). Осадок коньюгата переносят в диализный мешок и диапизируют против физиологического раствора (0,11 М NaCI).

Получают 80 мл раствора конъюгата (60 мгlмл белка). Число карбофосных остатков на 1 молекулу ЧСА, определенное с помощью 2,4-динитрофторбензола, составляет 12 — 16. б. Коньюгат карбофос — ДНК.

0,118 г натриевой соли ДН К из селезенки крупного рогатого скота растворяют в 40 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера и денатурируют добавлением концентрированного NaOH до рН 12,0 — 12,5. К раствору добавляют 20 мл ацетона и рН понижают раствором HCI (1:1) до 8,0. После охлаждения на водяной бане до 4 С к раствору ДНК по каплям добавляют 0,1 мл хлорангидрида карбофоса в 3 мл ацетона, рН среды поддерживают на уровне 7,7 — 8,0 добавлением

1 М NaOH с помощью рН-метра. Реакционную смесь выдерживают на водяной бане при перемешивании магнитной мешалкой в течение 2 ч, В таблице представлены характеристические данные Н К-спектров.

Пример 3, Применение и свойства антигенов карбофоса.

Иммунизацией животных (кроликов) конъюгатом карбофос - ЧСА получают антисыворотки по одной из известных мето1670608

Формула изобретения

Способ получения антигенов карбофоса, включающий синтез активированного производного и конъюгацию его с высокомолекулярным носителем, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения специфичности и антигенной активностИ, в качестве актиоированного производного используют хлорангидриды монокарбофосных кислот, а коньюгацию ведут в 0,1 Н К-фосфатном буфере, содержащем 20 — 35ф ацетона при молярном соотношении носителя к активирован ному производному 1:12-1;18.

Составитель Д,Папковский

Редактор Л.Веселовская Техред М.Моргентал Корректор О.Кравцова

Заказ 2748 Тираж 390 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 дик. Синтезированный антиген и антисыворотки, полученные с помощью данного антигена, исследуют методом ИФА.

В 8 лунок (1 ряд) 96-луночной иммунологической полистироловой плашки вносят по 0,2 мл раствора 1 мкг/мл по ДНК (конт- 5 роль на перекрест иммуногенной части конъюгата с антисывороткой). В остальные — по 0,2 мл конъюгата карбофос — ДНК в

НФБ в той же концентрации. Плашки инкубируют в течение ночи при 4 С и отмывают 10

3 раза 0,01 M натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 М NaCI и 0,05 ный детергент — тритон Х-100 или твин 20 (ТФБ). В отмытые лунки вносят антисыворотки по схеме: 15

123456

А002468

В002468

С002458

Е2 13579 20

F 213579

G213579

Н2 13579 где Π— ТФБ;

1 — антисыворотка, полученная с по- 25 мощью конъюгата по прототипу;

2 — антисыворотка против карбофоса в разведении 1: 200;

3 — 9 — антисыворотка против карбофоса в разведении 1: 200, содержащая соответ- 30 ственно 100000; 10000; 1000,...1; 0,1 нгlмл карбофоса, После инкубации с антиеидовыми антителами, меченными пероксидазой, и пероксидаэным субстратом получены следующие 35 результаты:

123456

АО О 4 1 2 4

В004124

С004124

00 О 4 1 2 4

ЕО 0 1 1 3 4

F001134

G0 О 1 1 3 4

Н001 134 где Π— окраска отсутствует;

1 — 4 — степень окрашенности (от почти бесцветного до ярко-желтого цвета).

Иэ данных иммуноферментного анализа следует, что синтезированный антиген не связывается с антителами, полученными иммунизацией животных коньюгатом по прототипу, Антитела, полученные с помощью синтезированного коньюгата, специфичны к карбофосу и могут быть использованы в иммунохимических методах анализа карбофоса и его производных,