Способ хранения микроорганизмов

Способ хранения микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для хранения в музейных и лабораторных коллекциях культур микроорганизмов. Цель изобретения - упрощение способа при сохранении жизнеспособности клеток. Микроорганизмы, выращенные на агаризованной среде, переносят на полоску хроматографической или стекловолокнистой бумаги и хранят либо в холодильнике при температуре от -40 до -80°С или в жидком азоте при - 196°С. Способ позволяет успешно хранить разные культуры бактерий, актиномицетов, дрожжей. Метанотрофные бактерии и дрожжи предпочтител ьно хранить в холодильнике при температуре (-70) - (-80)°С. Преимущество предложенного способа заключается в простоте криоконсервации при сохранении 100% выживаемости клеток в течение 13 - 14 месяцев, 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1671682 A 1 (I9>SU (ш

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ fKHT СССР

1 (21) 4711531/13 (?) 30.06.89 (46) 23 ° )8 ° 91 ° Бюл. Ф 31 (71) Институт биохимии и (физиологии микроорганизмов АН СССР (72) Н.В.Доронина, А.Н.Дроздова, К.С.Лауринавичюс и I).A.Tðoöåíêo (53) 577.15(088.8) (56) Ashwood-Smith ".1.S. Preservation

of microorganisms by freezing, Ггееzedrying and desiccarion. (54) СПОСОБ ХРАНЕН1(П (1ИКРООРГАНИВМОВ (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для хранения в музейных и лабораторных коллекциях культур микроорганизмов. Цель изобретения — упрощение

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для хранения в музейных и лабораторных коллекциях культур микроорганизмов.

Цель изобретения — упрощение способа при сохранении жизнеспособности клеток.

Изобретение заключается в том, что клетки микроорганизмов, выращенные на агаризованной среде, переносят на полоску хроматогра(Ьическоч или стек— ловолокнистой бумаги. Бумагу с нахо— дящимися на ней клетками микроорганизмов помещают в стерильный пенициллиновый флакон или полиэтиленовую ампулу, которые герметически закрывают и поо мещают в холодильник (от -40 до -80 С) или в жидкий азот (-196 С) . Использование биомассы с поверхности агари(51)5 С 12 !» 1/00//(С 1 11 1/30

С 1. R 1: 0) 2 способа при сохранении жизнеспособ— ности клеток. Иикроорганизмы, выращенные на агаризованной среде, переносят на полоску хроматографической или стекловолокнистой бумаги и хранят или в холодильнике при температуре от -40 до -80 С или в жщком азоте о при †1 С. Способ позволяет успешо но хранить разные культуры бактерий, актиномицетов, дрожжей. 1етанотро(Ьные бактерии и дрожжи предпочтительно хранят в холодильнике при температуре (-70)-(-80)0С. Преимущество предложенного способа заключается в простоте криоконсервации при сохранении

1007 выживаемости клеток в течение

13-14 мес. 2 табл. эованной среды позволяет сохранить и использовать внеклеточные полисахариды, обладающие криопротекторными свой- фф ствами. Предотвращение образования кристаллов льда обеспечивается мяг-, фы ким обезвоживанием с помощью бумаги. ф

Бумага служит матриксом-носителем, (ф обеспечивающим обезвоживание, иммобилиэацию и стабилизацию клеток. Могут быть использованы различные типы хроматографической бумаги, например ватман У 1,2,3 и др., стекловолокнистые бумаги GF/F и GF/А.

Предлагаемым способом проверено хранение большого количества различных микроорганизмов (бактерий, дрожжей), среди них 120 штаммов метанотрофных бактерий родов Ifethylomonas, !

1ethylobacter, !1ethvlosinus, tlethylo—

16 716>82 с st > s, >;>1>c >l;l«<>o!to<> тру»»>>х дп»»оддержа>«>я «х!>«>><=>«t>t.

Ытаммы >><>танотро< >нюх б«ктерий, проверенные >t;t хранение предлагаемым способом, и указанные в табл . 1, хранятся в Н1><РИ AH CGCP в лаборатории

1>адиоактив«1»х изотопов.

Проверку выживаемости культур микрооргаш>змов после хранения проводят суспендир6ваиисм клеток с бумаги в питательной среде, просчетом общего числа клеток в ф t> c>tE>otta»»bm и окращенных препарат«х «ликвоты суспензии под микроскопом, и прора»>иванием равной аликвоты на твердbIx средах для выявления жизнеспособнь|х клеток, образующих колонии.

Пример 1. Чистую культуру .1ethy1omonas methanica 12 abrpavptttatoT 20 на косяках с агаризованной средой (27 агар« "Д«фко"), следующего состава, г/л дистиллированной воды): KNO

1,0; HgSOq 7Н О О, ; СаС1 0,0?;

Na>HPO4 5Н<0 1,5; !clizp?? 0,7; ????><

>t7H 0 0,1; fpClz ° 4Н О 0,03; СоС12 >< кбн20 О, ; С«С12 5Н20 0,1; NiC12 6EEZO

<>,д?; Р1аМо04 3,03. рН среды 6,9-7,1.

Среду стерилизуют при 1 атм в течение 30

1 ч. Выращивание проводят в вакуумном эксикаторе, заполненном смесью метана и воздуха (1:1).

Петлей переносят клетки с косяка на полоску стерильной бумаги ватман

У 1, помещенную в стерильный пенициллиновый флакон. Флакон закрывают резиновой пробкой и помещают в холодильник (-70)-(-8<))0 C.

Анализ выживаемости метанотрофов через 13 мес хранения показывает, что за это время ч жизнеспособность баю терий полностью сохраняется, загрязнение культуры посторонней микро<»лорой не наблюдается. Бактерии начинают 45 расти через двое суток после перенесения полоски бумаги на влажную твердую среду или через трое суток при перенесении полоски бумаги в пробирку с жидкой средой.

Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но выращивают культуру

;1ethy1ncoc thermophi1us, а для хранения используют стекловолокнистую бумагу GF/> . Через 13 мес жизнеспо55 собнасть клеток полностью сохраняется.

П р и и е р 3. Способ осуществляют по примеру 1, но выращивают культуру

ilethy1o!>act<>r chroococcum, а для хра«ения испо»ьзу><>т xt><»t;» <»;> < ку><> бумагу ватман >> 3 . .Жи «>е<..«особность клеток полностью сохраняется в течение 13-14 мес.

Пример 4. Способ <>существляют по примеру 1, но выращивают культуру Hethylocystis echinoides а для хранения используют стекловолокнистую бумагу GF/А и хранят «ри температуре жидкого азота (-196 С). Выживаемость клеток после замораживания сохраняется близкой к 100Х.

Пример 5. Pseudomonas stutzeri ВКИ В-975 выращивают в течение суток на МПА при 30ОС. Далее способ осуществляют по примеру 1, но хранят при -40 С. Жизнеспособность клеток о полностью сохраняется через 14 мес.

Пример 6. Hethylophilus glucuseuxidans BKN В-1607 (ограниченно-факультативный метилотроф) выращивают на минеральной агаризованной (2Х агара "Дифко") среде следующего состава, г/л дистиллированной воды: КН РО4, 2,0; (NH4)tS04. 2,0;

l4gS04 7HgO 0,175; FeS04 7Н О О, >02. рН доводят до 7,2 раствором NaOH стерилизуют при 1 атм 30 мин, Перед эастыванием в стерильную среду вносят

0,5Х (o6/об) метанола. Выращивание проводят при 30 С. Далее способ осуществляют по примеру 1. Жизнеспособность клеток через 13 мес хранения близка к 100Х

Пример 7. Escherichia coli

К802/PILL 435 (1ig Т4) (продуцент ДНКлигаэы фага Т4) выращивают на МПА в течение суток при 30 С. Далее способ о осуществляют па примеру 1. Через

13 мес жизнеспособность клеток и биохимическая активность сохраняются.

Пример 8. Gandida methylica

ВКИ Y-2356 выращивают на сусло-агаре при 29 С в течение суток. Далее споо соб осуществляют по примеру 1. Выживаемость клеток через 14 мес хранения близка к 100Х.

Пример 9. Культуру Streptomyces aureofaciens АТСС 10762, NRLL 2209 (продуцент хлортетрациклина) выращивают в течение 2 сут при 29 С на среI де, содержащей, г/л: глюкоза 4, 0; дрожжевой экстракт 4,0; мальтэкстракт

10,0; агар 12,0, рН 7,2. Для осуществления консервации проводят полоской бумаги по культуре íà агаре (снимают реплику), с помощью пинцета переносят бумагу в стерильный флакон, закрывают

Способ хранения микроорганизмов, предусматривающий выращивание культуры на агаризованной среде и последующее замораживание при температуре от. -40 до -196 С, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа при сохранении или повышении степени жизнеспособности клеток, перед замораживанием культуру помещают на хроматографическую или стекловолокнистую бумагу.

Таблица 1

Число циклов заМикроорганизм мораживания — оттаивания с сохранением жизнеспособности

l4ethylomonas methaпдса штаммы 12 ° 23, 68 Не менее 6

1(> 71(>k гермст(1>(1(>> нробк(711 и хранят при (— 70)— (-80) С. Ж(1.(п(снос(бн(7(ть клет(>к через 8 мес хранения бл((зка 1; 1007.

Пример 10. Культуры метанотр(7>1>н((х бактерий хра нят пр(1 (— 70) л (-80)" Сна хроматографической бумаге ватман Р 1. После хранения при (-70) (— 80) С в теч(ние двух недель бактериальные клетки выперживают 1 ч при 10 комнатной температуре, затем помещают их в холодильную камеру на неделю.

Пикл замораживание — оттаивание повторяют 6 раз. Клетки сохраняют жизнеспособность не менее 6 циклов оттаивания — замораживания.

Результаты устойчивости метанотроф— ных бактерий к повторным циклам замораживания — оттаивания приведены в табл. 1.

Таким образом, при хранении предлагаемым способом клетки не теряют кизнеспособность в случае многократного их оттаивания и повторного замораживания.

Пример 11. Для сравнения выживаемости микроорганизмов при использовании известного и предлагаемого способов консервации бактерии выращивают на агаризованной среде в оптимальных для каждой культуры условиях. Бактериальную взвесь в (17изиологическом растворе или его смеси с криопротектором, содержащую 2 10 клеток/мл, или полоски бумаги (GF/А) с 35 нанесенной на них,биомассой, заморакивают в полиэтиленовых ампулах объемом 2 мл. После кратковременного (15 мин) пребывания в жидком азоте образцы деконсервируют на водяной ба- 4О о не при 37 С. Количество выживших бактерий в образцах определяют по числу сформировавшихся микроколоний на агаризованной среде при культивировании в оптимальных условиях. При заморажи- 45

11а )(иl! Ila б ч 1.(а (> (7б>(Н (. f :(7711>(г с T lf(> f;. t —

Тс>К прОсчить(нают пос7(E с ус 116. Ilд((р(>11(1 пия бактерий с бумаги в г торил(,1(у>> жидкую среду с помощью камеры 1 оря(— ва под микроскопом, и количест(((м(знеслособн((х клеток определяют л(7с lt прорашивания полученной суспен:1ии на

arapIIaoIIafIfIoII среде по числу кn! In(Ill(1.

Полученные результаты обрабатывают статистическ.1.,117còîâåðí(7ñòü pacчето(1 составляет 957.

В табл . 2 приведены результаты исследований по выживаемости микроорганизмов в процессе консервации известным и предлагаемым способом.

Преимущество предлагаемого elf(7coба по сравнению с известным заключается в простоте процедуры консер(7ации (отсутствие криопротекторов и специальных установок по криоконсервации) при сохранении высокой выживаемости (до 1007) в течение 13 — 14 мес хранения даже у тех культур микроорганизмов, которые не могли быть законсервированы ни одним из известных способов. Кроме того, предлагаемьп способ удобен для хранения культур не только в крупных коллекциях, но и в лабораторных условиях и на производстве. формула изобретения

167 1682

Продолжение табл.1

Methylobactdr vinelandii штаммы 30, 87 Не менее 6 .1ethylobacter

chroococcum штаммы 72,90

Methylobacter bovis штамм 98 Не менее 6

:fethylococcus ther—

mophilus штаммы 104, 108, 112 Не менее 6

Hethylococcus capsulatus штаммы

113, 114, 121

Не менее 6

Не менее 6

Таблица2

Выживаемость, . от контроля

1Мкр оор ганиэмы

Замораживание в фиэ. на растворе

98,1+2,1 О

- Methylomonas methanica 12 0

Methyl obac i l lu s methanolovorus BKM В-1447Д 0

Metholophilus glucoseoxidans BKM В-160 7Д

Mithylobacterium organophilum АТСС 27886 д

Escherichia coli ВКМ

В-1449Д

Bacillus subtilis ВКМ

В-501 T

97,5 3,0 0

99, 1+4,0 О

20,1 4,5 ?3,?+3,2 18,1+3,4

51, 8 -4, 6 60, 4+3, 6 58, 8+ 2, 6

8О, 3 4, 1 79,6+3,6 76,8л4, 1

1003 0

100,0

100,0

15,9 -5, 1

47, 1+4,4

Составитель В.Соина

Текрел M.Дидык Корректор С . Пекмар

Редактор H.Ðîãyëè÷

Заказ 2803 Тираж 361 Подписное

ВНИП1И Государственного комитета по иэобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 3"5, Раушская наб., д. 4/5

Проиэводственно †издательск комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101