Способ получения растений винограда

Способ получения растений винограда

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции и генетике растений винограда. Целью изобретения является повышение выхода генетически измененных форм растений. Способ заключается в получении большого количества растительного материала путем соматического эмбриогенеза. При этом различными комбинациями вносимых в среду фитогормонов достигается расширение спектра изменчивости растений. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

llQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

flPH ГКНТ СССР (21) 4639531/13

° (22) 19.01 . 89 (46) 23.08.91. Бюл. ¹ 31 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт винограда и продуктвв его переработки "Магарач" (72) А.О.Марченко (53) 578.085.23(088.8) (56) Марченко А.О., Голодрига П.Я . и др. Соматический эмбриоидогенез в культуре ткани винограда. — Физио логия и биохимия культурных растений, 1987, т. 19 № 4, с. 408 — 411.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции и генетике растений винограда.

Цель изобретения — повышение выхода генетически измененных форм растений.

Способ состоит в том, что на первом этапе осуществляют получение каллуса из эксплантатов междоузлий растений, выращенных in vitro, на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, содержащей фитогормоны 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и БАП (Б-б-бензиламинопурин), а на втором— перенос каллуса на модифицированную среду Мурасиге и Скуга, содержащую ,фитогормоны БАП в концентрации 1 мг/л и НУК (Н-1-нафтилуксусная кислота), культивирование его до появления эмбриоидов, пересаживание эмбриоидов на упрощенную среду и формирование из них растений согласно изобретению, при этом концентрацию фитогормонов

„„Я0„„1671689 A 1 рц С 12 N 5/04, А 01 Н u/00

2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ ВИНОГР)ЦА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции и генетике растений винограда. Целью изобретения является повышение выхода генетически измененных форм растений. Способ заключается в получении большого количества растительного материала путем соматичес— кого эмбриогенеза. При этом различными комбинациями вносимых в среду фитогормонов достигается расширение спектра изменчивости растений. 2 табл. выдерживают на первом этапе: 2,4 — Д равной или большей 2 мг/л и БАП, отличную от сертоспецифичного для исследуемого генотипа значений БАПк, а на втором этапе — концентрацию НУК, равную сортоспецифычному для исследуемого генотипа значению НУКк при этом значения БАПк и НУКк определяют проб- © ным получением эмбриоидов в два этапа на модифицированных средах Мураси — ге и Скуга, содержащих на первом эта- 4Ь пе 2,4-Д в концентрации 1 мг/л и БАП 00 в различных концентрациях, а на вто- СД)

:ром — БАП в концентрации 1 мг/л и НУК в различных концентрациях и с последующим фиксированием сочетаний значений BATIK и НУКк, при которых на средах получаются эмбриоиды. Каллус получают также из листьев растений, при этом на втором этапе выращивания, а также на втором этапе пробного получения эмбриоидов выдерживают концентрацию БАП 5 мг/л.

1671689

Пример 1. !!сходю гч материалом служат растения, выращенные 1п vit lo на упрощенной среде МНР (! /4 макроэлементы, микроэлементы и Fe-хеллат по Мурасиге и Скугу, довозит 100 мг/л, тиамин 5 мл/JI nup доксин 5 мг/л, никотиновая кислота 0,5 мг/л гумат натрия 30 мг/л, сахароза 37, агар

0,87), сорта Подарок Магарача. Для получения каллуса эксплантаты междоузлий и це тие листья, разрезанные пополам перпендикулярно центральной жилке, помещают на модифицированную среду !урасиге и .Скуга, содержащую фитогормо и,i 2,4-Д в концентрации

1 мг/л и БАП (1БЛП) в различных концентрациях с шагом 0,4 мг/л, и культивируют их в стаканчиках объемом

150 мл, содержащих по 20 мл питатель- gp о ной среды, в темноте при 28 С (первый этап). Иодийикация среды заключается в удалении гидролизата казеина и увеличении концентрации витаминов (тиамин 10 мг/л, пиридоксин 1 мг/л, 25 никотиновая кислота 5 мг/л, сахароза

37, агар 0,87). Через 30 дн образовавшийся каллус с каждого варианта переносят на каждый вариант среды второго этапа, содержащих разные кон- 3р центрации НУК и 2БАП в концентрации ! 1 мг/л (в случае каллуса из междо— узлий) и 5 мг/л (в случае каллуса из листьев) . Для образования эмбриоидов из эмбриогенного каллуса междоузлий значение концентрации 2БАП в среде второго этапа должно быть меньше

2 мг/л, а из змбриогенного каллуса листьев — больше 2 мг/л. Далее продолжают культивировать при тех же ус- p ловиях до появления эмбриоидов. При этом определяют концентрации 1 БАП и НУК, обеспечивающие индукцию эмбриоидогенеза для данного гетотипа, т.е.

БАПк и НУКн. Для сорта Подарок Мага- 45 рача они были равны БАПк 2 мг/л, НУКк

2 мг/л.

Для получения генетически измененных растений эксперимент повторяют с тем отличием, что среды первого этапа содержат 2,4-Д в концентрации, большей или равной 2 мг/л, и 1БАП, в концентрациях, отличных от БЛПк, т.е. в случае сорта Подарок Магарача при 2,4-Д 2 мг/л + 1 БАП 1 мг/л; при 2,4-Д 3 мг/л + 1 ЬАГ! 0,5; 1; 1,5;

2,5; 3,5; 4 и 5 мг/л. В средах второго этапа используют НУК в концентрации 2 мг/л и 2 БАП 1 мг/л в случае каллуса из междоузлий, или 2 БЛП

5 мг/л в случае каллуса из листьев.

Для пол.чения растений эмбриоиды переносят в стаканчики на среду М!!Р, выдерживают в холодильнике четыре недели при 4 С и затем продолжают о культивировать в помещении с освещением 2000-3000 лк (лампы Л 1-40) при

16 ч светопериоде и гемпературе 25

27 С.

У 707. полученных растений обнаружены отклонения по количеству семядолей вплоть до их отсутствия, 857 семядолей с нарушениями генетического характера, деформированы. В зависимости от используемой концентрации

1 БАП установлены различные нарушения дифференцированных листьев и апикального доминирования, изменение формы дифференцированных листьев и образование соцветий у растений 1п ч1 го; различие в окраске побегов, размеров листьев и вызревание лозы. Установлена корреляция между использованной концентрацией 1 БЛП и проявлением специфической изменчивости — образование соцветий у сомаклонов in vitro получение растений со специфической формой листа. Опыт повторяют три раза при исходной концентрации 1 БАП, при этом измененные признаки (форма листа и образование соцветий) воспроизводились и сохранялись у вегетативного потомства in vitro.

Пример 2. Растения выращивают по методике известного способа через соматический эмбриоидогенез также, как в примере 1, но берут только эксплантаты междоузлий растений сорта

Подарок Магарача и в средах первого этапа используют фитогормоны 2,4-Д в концентрациях 1, " и 3 мг/л и 1 БАП в концентрации 2 мг/л . Из 100 выращенных растений 5 растений имеют не- ° значительные физиологические и морфофизиологические различия — по приросту, количеству междоузлий, приобретению осенней окраски листа и размерам листьев. Наблюдают спонтанное образование растений — регенерантов с определенным типом изменчивости от опыта к опыту.

Пример 3. По методике примера 1 в средах первого этапа используют фитогормоны 2,4-Д в концентрации

° 1 мг/л и 1 БАП в концентрациях, отличных от БАПк, .2 мг/л. Образование эм45

16716 бриоидон из калпуса на втором этапе не наблюдают.

Пример 4. По методике примера 1 в средах первого этапа исполь5 зуют фитогормоны -«4 Д в концентрации 3 мг/л и 1 БАП в концентрации

0«5 и 5 мг/л. Образование эмбриоидов имеет место. 307 растений-регенерантов, полученных при использовании 10

1 БАП (5 мг/л), имеют специфическую форму листьев и у 107. растений образуются соцветия. Специфическая форма листа сохраняется при вегетативном размножении, вплоть до десятого черен- 15 кования in vitro Результаты воспроизводятся в повторных экспериментах, в случае использования 1 БАЛ в кон— центрации 5 мг/л. До 307 растенийрегенерантов, полученных при использовании 1 БАЛ (0,5 мг/л) имеют измененную форму зубчиков листа, до 207 укороченные междоузлия и другие признаки, свойственные полиплоидным растениям.

Пример 5. По методике примера 1 в средах первого этапа исйользуют фитогормоны 2,4-Д в концентрации

3 мг/л и 1 БАП-БАПк 2 мг/л. Образование эмбриоидов из каллуса имеют место на втором этапе. Полученные растениярегенеранты (100 шт.) визуально ничем не отличаются от исходной формы.

Пример 6. По методике примера 1 в средах второго этапа для кал- 35 луса из листьев используют НУК 2 мг/л и 2 БАП 0,5 и 1 мг)л« а для каллуса из междоузлий НУК 2 мг/л и 2 БАП 3 и 5 мг/л. Образование эмбриоидов не наблюдают. 40

Пример 7. По методике примера 1 в средах второго этапа для каллуса йз листьев используют НУК 2 мг/л и 2 БАП 5 мг/л, а для каллуса из междоузлий НУК 2 мг/л и 2 БАП 1 мг/л.

Полученные результаты соответствуют результатам примеров 1 и 4.

П р и и е р 8. По методике примера 1 в средах второго этапа для каллуса из листьев и межпоузлий исполь- 50 зуют Ьитогормоны НУК в концентрации, отличной от НУКк (2 мг/л), и 2 БАП

1 мг/л (в случае каллуса из междоЯ9 узлий) и 2 БАП 5 мг и (и с. уч,з г,з. луса из листьев). Образование эмбрноидов не наблюдают .

В табл. 1 предстаяленьi комб| на вп регуляторов роста, исспедояа нные т я разных генотипов винограда. В табл.2 представлены комбинации регуляторов роста, необходимые дпя получения амбри оидов .

Способ применим как один нз .этапов клеточных технологий дпя повышения их эффективности — получение массива измененных форм из единичных гибридных, мутантных илн реконструированных растений и отбора наиболее удачно экспрессируемых геномов.

Формyлaизoбретени я

Способ получения растений виногра— да, включающий получение калпуса из эксплантатов на модифицированной среде Мурасиге — Скуга в присутствии

6-бензиламинопурина и 2«4-дихпорфенилуксусной кислоты, перенос каллуса и культивирование до образования эмбриоидов на модифицированной питательной среде Мурасиге — Скуга в присутствии 6-бензиламинопурина ио -нафтилуксусной кислоты и последующий пере1 нос эмбриоидов на питательную среду для формирования растений, о т л ич а ющи и с я тем, что, с целью повышения вь«хода генетически измененных форм растений, в качестве эксплантатов используют междоузлия или листья, каллус получают в присутствии 2,4дихлорфенилуксусной кислоты в количестве не менее ? мг/л и 6-бензиламинопурина в количестве, отличном от специфичного для данного генотипа, образование эмбриоидов из эмбриогенного каллуса мелдоузлий осуществляют в присутствии 6-бензиламинопурина в количестве 1 мг/л и о .-нафтилуксусной кислоты в количестве, равном специфичному для данного генотипа, а при использовании в качестве эксплантатов листьев количество 6-бензиламинопурина в питательной среде дпя образования эмбриоидов устанавливают равным

5 мг/л.

1671689

Таб.тица 1

Содержание регуляторов роста, мг/л

Среды для формирования эмбриоидов из каллусных культур

Среда для индукции каллусных культур

Листья

Междоузлия

Сорт Подарок Магарача !

1-1; 2+ Б-О, 5

Н-1; 2; 3+Б « -1-5, И - 0,5-2,5+Б-1, 1-1,2 +Б +Б -0,1.

0,5-3

Д вЂ” 1+ Б-2

Н вЂ” 2+Б-1

Н-2+ Б-1

7

-5

Н -0,5-3+Б-5

4.

Н в5+Б 1)2;3;7

Н-1) 5+Б-5

Н-1, 5+Б-5

% ,l, 1+Б Оэ1 Оэ5 6

Д-1+ Б-4, 5

Л-2; 3+ Б-4, 5

+Б 434

11

Сорт Крымская жемчужина

Н -0,5-3+Б-1

Vitis monticol,а Buckl.

Н -Q,5-3+Б-5

+ 1-1+Б -0,1; 0,5-6

4 13

D-1+Б -О, 1; 0,5-6

М

D-3+ Б-2, 5

Н -0, 5-3+ Б-5

Н-3+Б-5

14! даг но концентрации 0,5 мг/л.

Uar uo концентрации 1 мг/л.

Таблица2

Содержание регуляторов роста, мг/л

Опыт

Среда для индукции эмбриогенных каллусных культур

Среда для получения эмбриоидов из эмбриогенных каллусных культур

Листья

Меидоузлия

Сорт Подарок Магарача

Н-2+Б-О 5 1 в ю

Н-2+Б-0,5; 1

Н-2+Б-0,5; 1

2

4

Н-2+ Б-3;

Н-2+Б-3 э

Н-2+Б-З;

Н-2+Б-5

Н-2+Б-5

5; 7; 8; 9

5; 7

5; 7

1 5;2,5; Н-2+Б-1

7

Н-1) 5; 2+Б-5

Н-1) 5+Б-5

Н-2+В-5

Л 2+Б-О,1;n,9;1,2;1,9;3

Сеянец Магарач № 100-74Н-2+Б-5

1-5

Н-1,5+Б-3;5

Н-1, 5+В-5

Н вЂ” 1, 5+Б-5, (- 1+ Б-4, 5

I--2, 3+Ь-4, 5

Л вЂ” 1+Б-4,3;4,7

1О

11

D-2+ i -1; 2

;1-1+8 -3,5-6

q-3+ Б +-И, 1, О, 5-5

Д-4+Б,2; 3

Д-1, 5+Б-1, 1-1; 2+Б-1,7; 212

Д-2+Б-О 7 Иэ9 1,2

1,9

Д-1+Б-2 1-2; 3+ Б-2

Д-2+ В-1

Д- i, 5+ Б-1

Д-3+Б-0,5;1;

3,5;4;5;

Д-4+Б — 2

„1-4+ Б-З

;(-1+ Б-1, 7

Сеянец Магарач ¹ 100-74-1

Н-1 2+Б-О 5

1 Ф

Н-1; 2; 3+ Б -1-5

Н -О, 5-2, 5+Б-1; 5

4%

Н-"+Б-7 8 9

1 1 1

Н-2+Б-5; 7

11-2+ Б-5

Н-2+Б-5

Н -0,5-3+Б-5

4.

Н-2+ Б-5

Н-2+ Б-5

Н-2+Б-5

1671689

Продолжение табл.2

Содержание регуляторов роста, мг/л

Опыт

Листья

1еждоузлия

Д-1+ Б-3

Н-О, 5; 2+ Б-5

Л 1р3+Б 2 5

Н-3+Б-5.

Составитель В.Демкин

Техред М.Дидык Корректор М.Самборская

Редактор И., авербах

Заказ 2803 Тираж 364 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

Среда для индукции эмбриогенных каллусных культур

Греда для получения эмбриоидов иэ эмбриогенных каллусных культур

Сорт Крымская жемчужина

H-0 5 2+Б-1

Vitis monticola Buckl.