Способ получения полимерного реагента для ковалентной иммобилизации биологически активных соединений

Способ получения полимерного реагента для ковалентной иммобилизации биологически активных соединений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области химии полимеров и позволяет получить полимерные реагенты для ковалентной иммобилизации биологически активных соединений с высокой (135-265 мг/r) связывающей способностью экологически чистым способом. Это достигается радиальной эмульсионной сопо/шмеризяцией смеси 1 мае.ч. бутилметакрилата с 5,8-8 4 мае.ч. диметзкрилата диэтил енгл и кол я и 1,2-7,2 мае.ч глищ)дилметакрилага или аллплглицидилового эфира в присугстпии органического растворителя - порообразовагеля ипооерхиостно-активного вещества г растворенным в смеси 1-10 мас.% Фосфата щелочного металла на первой стадии и добавлением 75- 80% глицидилметакрилата или аллилглицидилового эфира через 0,25-1.0 ч на второй стадии синтеза 1 табл со С

СО>ОЭ СОГ>ЕТСКИХ

СОЦИ4ЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ1УЬЛИК

ГООУ/14РстГ>е>>116»Л комитет

Г1О ИЗОБРЕТЕ»ИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

Г1РИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ! о

«4 (Л

СлЗ

iC) (К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4633553/05 (22) 05.01.89 (46) 07.09.91. Б>ол. М. 33 (71) Научно-производственное обьединение

"Биолар" АН СССР (72) М.К.Клявиньш, Р.Ç.Расса, Л.Л.Штеймане, Л,C.Ðoñêà и Л,Х.Зицманис (53) 541.6.69 (088.8) (56) Патснт ФРГ

N 3427441, кл. С 08 F 2/20, опублик. 1986.

Европейский пагент

>1" 58767, кл. С 08 Г 220/54, опублик. 1982. (5 1) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНОГО

РЕЛГЕНТЛДЛЯ КОВАЛЕН1 НО!4 ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ (57) Изобретение относится к области химии полимеров и позволяет получить полимерИзобретение от»осится к химии полимеров, а именно к способу получения полимерно>о реагента для ковалептной иглмобилизации биологически активных соединений, и может быть использовано в би.отехнологии и инженерной энзимологии для создания препаратов с иммобилированными биологически активными соединениями.

Целью изобр>.>ения являегс» повы>пение связыва>ощеи способности полиме> ого реагента по отноц>еник> к биологически активнь>м соедине»иям и повышение экологической чистоты процесса.

Пример 1. Il 800 мл деминерализованной воды при перегле»>ива>сии и 50 С растворяк>г 20 г поливинилпирролидона (мол,гласса 20000 .0Г10). Г>»олученный раствор поверх>II!с I но-, > T I>3>IOI вещества вноеят 82 г ф. ., ;; »".I l!ия (10 маС.% к раствору П. . ) >1::;: г;л>пер-.гуре г.ри

„„5lU„„1675304 А1 (ч> С 08 F 2/20 220 10, С 12 N 11/08 ные реагенты для ковалентной иммобилизации биологически активны . соединений с высокой (135-265 глг/г) связ»ва>ощей способностью экологически чистым способом.

Это дости ается радиальной эмульсионной сополимеризацией сл>еси 1 мас,ч. бутилметакрилата с 5 8-8.4 мас,ч. диметакрилата диэтиленгликоля и 1,2-7,2 мас.ч. глиц>1д>ллметакрила га или аллплглицидилоного эфира в присугстг>ии opr;»ivческо>о рас > ворителя — порообразова геля и поверхностно-активного вещества с растворенным в смеси 1-10 мас. /, Фосфага щело Illo>0 металла >Ia первой ст,>дии и доб;>вле»ием 7580% глицидилл>eтакрилата или аллил>лицидилового эфира через 0,25-1.0 ч на второй стадии г:интеза. 1 табл. перемешивании сп скоростью 170-200 об/,IT>i прибавляют ис;og>I>yio сглесь мономет1 ов, состоящую из 94 мл хлорбе»зола, 29,i г (0,30 моль) диметакрилэта диэтиленгликоля, 3,55 r (0,025 моль) бутилметакрилата и 5,32 г (0,125 моль) глицидилглетакрилата.

Добавляют 0,5 г инициатора — 2,2-азобис(изо-бутиронитрила) (ДАК) и перемешивают при 80>С, набл>одая за процессом полимеризации путегл отбора проб реакционной смеси. Гlосл» 25 I»I (образуются твепдые частицы) nI>l!;II!I >nT 15,97 г (0,36

)Ion>, глицидилметакоичл>а Реакцио»ну>О смес> перегле»>ива>от 6 . Полимер отфильтровывают, пром>, ваюг. про>лывают водой, ац> . го»огл, экс > Г>а». >!7>>» 6c>>зn чaгл. Сушат при 75 С и течен>«. 8 ч. 11Т;;>у >лют 54,20 г

>>ро >укта (выход 98

Г1ол учен»ый п1ч;дукч х;>рак геризуется с,:,, н.>цими г, . «;„-: >;.л ->л, C.одзржанис

:> .-, -.,;. рупп. 2 45 л I ic;I./ã „„->роделено по1675304

55 тенциометрическим титрованием хлористоводородной кислотой в диоксане), элементный анализ: С 60,22 ф,, Н 7,09, удельный обьем в воде 2,0 см /г. диметилформамиде

4,1 см /г, бензоле 3,0 см /г. В ИК-спектрах з имеется максимум сорбции при 1210 см

-1 (сорбция эпоксигрупп). Продукт получен в виде регулярных частиц с размером 0,0500,160 мм. Содержание основной фракции (по весу) 68оь (100-140 мкм).

Данные по примерам 2-8 приведены в таблице, где показан синтез полимерных реагентов для иммобилизации биологически активных веществ.

Пример 9, Иммобилизация белков на полученных носителях.

1,00 г носителя, полученного согласно примеру 1, суспендируют в 10 мл 0,1 н, ацетатного буфера (рН 7,5), который содержит

32 мг пеннициллинацилазы. Смесь перемешивают при 4 С в течение 24 ч. Полимер отфильтровывают, промывают, промывают

0,1 н. хлоридом натрия, водой. Хранят при+

4 С в 0,1 н. фосфатном буфере (рН 2,5). Активность иммобилизованной ацилазы 340 ед./г.

Пример 10. 1,00 г носителя, полученного согласно примеру 2, суспендируют в 10 мл 0,05 н. ацетатного буфера (рН 6,6), прибавляют 350 мг трипсина с удельной активностью 36 ед. акт./мг и перемешивают при

+ 4 С в течение 6 ч. Затем продукт отфильтровывают и на фильтре промывают водой.

На носителе связан трипсин с активностью

10672 ед. акт.

Пример 11. Иммобилизация низкомолакулярных биологически активных веществ.

К раствору 0,61 r L-фенилаланил-L-аспаргиламида в 30 мл воды добавляют 1,0 г носителя, полученного по примеру 3. Перемешивают при 20 С в течение 10 ч. Продукт фильтруют, промывают водой, ацетоном.

Сушат на воздухе. На носителе связано 0,58

r пептида (определено по аминокислотному анализу), Пример 12 (сравнительный). 2,00 г бромцианактивированной сефарозы выдерживают в 0,05 н. хлориде натрия в течение

3 ч, Затем раствор хлористого натрия отмывают 0,01 м дикарбонатом натрия и гель переносят в 50 мл 0,05 н. дикарбонатного буфера (рН 8,5), прибавляют 700 мг трипсина с уд. акт. 40 ед. акт./мг и перемешивают при +4 С в течение 6 ч, Затем продукт отфильтровывают и на фильтре промывают водой. На носителе связан трипсин 3,5 мг/г.

Пример 13 (сравнительный), 1,00 r эпоксиактивированного сферона суспендируют в 50 мл 0,05 н. бикарбонатного буфера (рН 8,5), прибавляют 350 мг трипсина с уд. акт. 40 ед. акт./мг и перемешивают при +

4 С в течение 6 ч, Затем продукт отфильтровывают и на фильтре промывают водой. На носителе связано 12 мг трипсина.

Пример ы 14 (сравнительный. известный). В 6 л колбе с термометром, насадкой

Дина — Штарка, отточным холодильником, трубкой для ввода азота, помещают 1740 г гексана, 1100 г перхлорэтилена, 9 г эмульгатора и 5 r сухого льда. При перемешивании и продувании азотом при 50 С прибавляют смесь, состоящую из 640 г метанола, 160 г воды, 240 г метиленбисакриламида, 30 r аллилглицидного эфира, 30 r глицидилметакрилата, 6 г 4,4-аэобис(4-циановалериановой) кислоты. Смесь перемешивают при 6570"С в течение 6ч. После этого реакционная смесь выдерживается при указанных условиях еще 4 ч, после чего охлаждается до комнатной температуры. Полученные частицы полимера отфильтровываются в течение

12 ч, высушиваются в вакууме при 40 С.

Активность иммобилизованной ацилозы достигает 122 ед./г.

Формула изобретения

Способ получения полимерного реагента для ковалентной иммобилизации биологически активных соединений путем радикальной эмульсионной сополимеризации глицилидметакрилата или аллилглицидилового эфира с моновиниловым сомономером и сшивающим агентом в присутствии органического растворителя — порообразователя в среде водного раствора поверхностно-активного вещества, о т л и ча ю шийся тем, что, с целью повышения связывающей способности полимерного реагента по отношению к биологически активным соединениям и повышения экологической чистоты процесса. в качестве моновинилового сомономера используют бутилметакрилат, в качестве сшивающего агента — диметакрилат диэтиленгликоля, к водному раствору поверхностно-активного вещества добавляют 1-10;/, фосфатов щелочных металлов от массы раствора, причем в начале сополимеризации в реакционную смесь вводят 20-25 мас. глицидилметакрилата или аллилглицидилового эфира от их общего количества при массовом соотношении бутилметакрилат: диметакрилат диэтиленгликоля: глицидилметакрилат или аллилглицидиловый эфир, равном 1;5,88,4;1,2-7,2, и через 0,25-1,0 ч вводят остальное количество глидицилметакрилата или аллилглицидилового эфира. и (и

CO (Г) и

-:т

Х .0 х Ф

Ц о

<О а

О О

О»

r ю

Й Л

lO

О о» о

О) D

Ю

<" ! сп (-.

О)

С» с! (Э

I l. г: (; г-. и гJ (и м с»

Г (\ (:)

Г 4

Ю а ь

rd Ю о х

Х 4)

Ц о л а о г -т

Ю

Cl

Ц о

Ql

IO

О о

CO

in in со

П <О

in

in ((о

ГЧ

<т) ) (L

Г (Ю о с»! (Г\

-т с»

ГГ) (0

Г(Г\ а. и

Г \

L с«0 о а г

О. о д т а

Э

Х а

C)

c J

< (т

CJ

СГ) (» г(1 (l»

О, »<(;

Ю

Ю

СО

Х

e o

Ц о

Х

Э а о

ln

О(in

Г 1 с

О

<и (и г» и.е и с

О»

Г!

_#_ 0.т

Г )

ГС)

Ю

0О ) сч

СГ

C) и

<и (<и

0 П

< 4 сп,О <1 J

)C 3

О) П а=о

Ql и <о с

° О

n (-;

in 3

E.:г- о

in

I I

С)

C. .СО

c( (В.1 (и о

О» <

<О

01 Т и и

< 4 и о <и (1 с

О\ х

Э

IO а о

Г4

-т

< l

-с

rI

c-- 0l

CG и и

О0 -0

Ю

Ю

00 а т Х о

-т о о (и

«Ю с; ( о п а (О (Х и с4

C)

Ю,О

< J о

Х с о

Х J

Х х

Э (» о

О о

Ю о

) .) л

О

Э (1 а

О)

I

Г, Ef

X Э (- Ф J о э

Х х а <0

<О О) Х

CQ О»= о о х

Х) Ю <О

Х

cQ o

Х Х <»4

Х К

Ф о а О= о xr г. и

C)

4о а

О) Г4

Е 00

О4 с

C) <а г 4

О!

<О

ОС

0 ю с-1 г(<Ч

P (y) ОС

Ю т

Ю

l1 <

Г1 (I

3 о

< о а3

Н г е о

С Э

5 а о

Ос

<Ч

in

С)

<4

)»

° С

1

< х

Х

С (О

<- сч 5

Г) < \

g и х а

)с <»

Cd 0 Ql

X г1

01 о а

Ql

Е о

X о

X ( г!

QI

I;— о с

E (( г, г( г) Ф (О !

Э i ).

Г; Ii) г, и

in с

<О Хn (I (- Ю

00 и Х

» г!

1I

3 о

lr4 <о

:.) а о

О) Г ()

Э

5. Х к а о г а

Э

<<О л 5

Г)

I< I

Г

<4

О С

Х э с. с» (C

Х

K г

Э 4 lc о J

1ь/5304

Г

t;

7 г с, s

r с7 гс7

i с t

С7

:C л .7 J.

7;

1 I.7

7.

7 CO г t

Г с - t С 7 гс

Г

Г 7

) и г;

t г

7. 7 о о сс7 .7 .7 г7

Г7

С г с с

- Г С> С.Г

С!

i .Ю С7

Г;

С7 о О. Г с! г!..Г 7

i !.З 1 7 г

t г;

С7

У.

Г!

Сс

7 г7 с с

77

-.Г г

I i

Ci

C. и с! t гс гс

Ct

ГГ

СГ

17

7, с,й

t ,7

r, t:

t: с; г Г гг7 с 7 77

2 .СГ

7 F

7; - С 7