Способ обнаружения пероксидаз

Способ обнаружения пероксидаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно к способу выявления пероксидаз, который может быть использован при изучении структуры и функций пероксидаз, а также при разработке экспресс-методов диагностики Целью изобретения является повышение чувствительности обнаружения. Для этого полиакриламидный гель после электрофокусирования или электрофореза белков и обработки его раствором солянокислого бензидина в ацетатном буфере рН 4,7, затем 0,1 %-ным раствором пероксида водорода, обрабатывают 1,3-4,2%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, содержащим 03-0,7% сульфосалициловой кислоты в течение 2-3 с и вновь 0,1 %-ным раствором пероксида водорода. Указанные условия позволяют повысить чувствительность способа в 2-3 раза и выявить минорные пероксидазы, которые из-за малого количества не выявлялись известным способом 3 табл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

s G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ з т т (21) 4191714/63 (22) 04.02,87 (46) 07.09,91. Бюл. N 33 (71) Казахский научно-исследовательский институт земледелия им. В. Р, Вильямса (72) И, M. Савич (53) 577.15.08(088.81 (56) Кабжанова С,Б., Перуанский Ю. В, Состав и активность изозимов пероксидаз и эстераз зерна гетероэисных гибридов кукурузы. — Вестник сельскохозяйственных наук

Казахстана, 1975, N 9. с. 34, (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗ (57) Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно к способу выявления пероксидаз, который может быть использован при изучении

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии, конкретно к усовершенствованному способу выявления пероксидэз, который может быть использован при изучении структуры и функций пероксидэз, а также при разработке экспресс-методов диагностики.

Целью изобретения является повыше-. ние чувствительности обнаружения, Пример 1. Пероксидазы выделяют из

7-дневных проростков кукурузы, гомогенизируя растительный материал в 5-кратном объеме трисглицинового буфера рН 8,3, содержащем 30% сэхарозы. После настаивания в холодильнике в течение 30 мин гомогенат центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин, и надосадочную жидкость наносят в количестве 20-30 мклна гелевую пластинку.

„„SU „„1675765 А1 структуры и функций пероксидаз, а также при разработке экспресс-методов диагностики. Целью изобретения является повышение чувствительности обнаружения. Для этого полиакриламидный гель после электрофокусирования или электрофореза белков и обработки его раствором солянокислого бензидина в ацетатном буфере рН 4,7, затем 0,1%-ным раствором пероксида водорода, обрабатывают

1,3 — 4,2%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, содержащим 0,3-0,7% сульфосалициловой кислоты, в течение 2-3 с и вновь

0,1%-ным раствором пероксида водорода, Указанные условия позволяют повысить чувствительность способа в 2-3 раза и выявить минорные пероксидазы, которые из-за малого количества не выявлялись известным способом. 3 табл.

Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) проводят в 5%-ном полиакриламидном геле д (ПААГ), содержащем 2% амфолинов, с ин- 0 тервалом рН 3,5-9,5, в пластинах размером

110x110х1 мм в горизонтальном положении, Режим ИЭФ: 10 мин — 200В; 20 мин — 400В;

30 мин — 8008; 30 мин — 1200В. «4

После окончания изоэлектрофокусиро- О" вания или электрофореза пероксидаз в по- (Л лиакриламидном геле пластину толщиной 1

MMc разделенными изеферментами залиаают 0,02/,-ным раствором солянокислого о !

)Ъ бензидина, приготовленном на 0,1М ацетатном буфере рН 4,7, на 30 мин, затем гелевую пластину помещают в 0,1%-ный раствор пероксида водорода до появления синих полос изопероксидаз, После этого пластину опускают на 2-3 с в стабилизирующий раствор и вновь заливают 0,1%-ным раствором

1675765

Формула изобретения

Таблица 1 иоуюшего раствора, j, х-либо добавок

) этанол

3,3 CCI<

6 ТХУ

ХУ+ З,З ССК

<У+ 1,1 ССК

<У+ 0,7 ССК

<У+ 0,5 CCI<

<У+ 0,3 ССК

П р и м е ч а н и е: ТХУ вЂ” трихлоруксусная кислота;

ССК вЂ” сульфосалициловая кислота.

Все растворы содержат 0,1% пероксида водорода, Таблица 2

Ь ические точки изо- Площадь пика в обычных у ерментов ловиях про51 вления (спосо прототип}, см

1,70

1,49

2,04

1,57

7,2

8,3

8,8

9,1 пероксида водорода, и емкость с гелем ставят в холодильник.

Из испытанных стабилизирующих растворов наиболее эффективным оказывается

1,3 — 2,5-ный раствор трихлоруксусной кислоты, содержащей 0,3-0,7% сульфосалициловой кислоты, Обработка геля данными растворами позволяет сохранять синюю окраску пероксидаз в течение 2-3 недель, при этом гель должен находиться в темноте в холодильнике, Действие различных стабилизирующих растворов на сохранение окраски пероксидаз показано в табл. 1.

В табл. 2 представлены значения площадей пиков некоторых разделенных изопероксидаз после их сканирования с помощью денситометра, показывающие, что чувствительность предлагаемого способа, выше, чем у известного (гибрид Днепровский 247 MB).

В табл. 3 приводятся данные по соотношению изопероксидаз при сканировании геля, Из данных табл. 3 видно, что после воздействия на гель стабилизирующего раствора появляется возможность количественно замерить изопероксидазы изоэлектрическими точками (ИЭТ) 5,3; 5,7; 6,5, которые не выявляются известным способом. причем новых полос иэоферментов не образуется, изоферменты лишь на более длительное время сохраняют синий цвет.

И<-.пользование предлагаемого способа выявления пероксидаэ по сравнению с известным имеет следующие преимущества: разделенные изоферменты длительное вре5 мя сохраняют четкость и синюю окраску, а минорные пероксидазы не исчезают при хранении полиакриламидного геля, что дает возможность использовать гель длительное время в исследовательской работе (скани10 рование пероксидаз с помощью денситометра, фотографирование, определение относигельной электрофоретической подвижности отдельных компонентов), Предел чувствительности способа 10 — 20

15 пикокатал, что превосходит известный способ в 2-3 раза.

20 Способ обнаружения пероксидаз, включающий электрофокусирование или электрофорез в полиакриламидном геле, обработку его раствором солянокислого бензидина в ацетатном буфере рН 4.7, за25 тем 0,1 -ным раствором пероксида водорода, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности обнаружения, гель после обработки 0,1 -ным раствором пероксида водорода обрабатывают в тече30 ние 2-3 с 1,3-4,2%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, содержащим 0,3 — 0,7% сульфосалициловой кислоты, и вновь 0,1 ным раствором пероксида водорода.

16757б5

Таблица 3

Составитель И, Корсакова

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор M. Кучерявая

Редактор М. Бланар

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2997 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5