Способ определения антитромбопластиновой активности биологически активного вещества

Способ определения антитромбопластиновой активности биологически активного вещества

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии и клинической фармакологии . Целью изобретения является повышение специфичности, ускорение и упрощение способа за счет выполнения In vitro. Определяют In vitro свертывания бестромбоцитарной субстратной плазьы с коммерческим тромбопластином после его предварительной инкубации в течение 4-10 мин при Зб,5-37,5°С, в качестве контрольной пробы используется тромбопластин без инкубации с биологически активным веществом и по разнице между временем свертызачг.я в опасной и контрольной пробах СУДРТ об антитромбопластиновой активности 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5п s G 01 N 33!4:", ГОСУДАРСТВЕН(ЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. (21) 4666893/14 (22) 27.03.89 (46) 07,09.91, Бюл. t4 33 (71) Киевский научно-исследовательский институт фармакологии и токсикологии . (72) Ю.Н.Максимов, Г.Н,Липкан, С.Я.Кубраченко, Л.С.Мхитарян и Н.Н,Колотилов (53) 612,115(088,8) (56) Урбанюк К.Г. Влияние некоторых лекарственных средств на свертываемость крови у больных сердечно-сосудистой патологии. — Врачебное дело. 1971, М 2, с.18. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТРОМБОПЛАСТИНОВОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЦЕСТВА

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии и клинической фармакологии.

Целью изобретения является повышение специфичности, ускорение и упрощение способа эа счет выполнения in vitro.

В способе используют следующие реактивы: стандартный тромбопластин, 1%ный раствор (производство Львовского

НИИ гематологии и переливания крови, содержащий белок концентрации 8 г/л, или производства кооператива "Диагностикум" при Львовском НИИ гематологии и переливания крови, содержащий белок концентрации 7 г/л), 100 мг сухого тромбопластина растворяют в 10 мл физиологического раствора при постоянном растирании при 40 — 45 С, раствор фильтруют. Иэ него готовят 0,04%-ный раствор тромбопластина путем соответствующего разведения физиологическим раствором:,..."-0„:, 1675767 Al (57) Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии и клинической фармакологии. Целью изобретения является повышение специфичности, ускорение и упрощение способа эа счет выполнения In

vitro. Определяют in vitro время свертыва ия бестромбоцитарной субстратной плазмы с коммерческим тромбопластином после его предварительной инкубации в течение

4 — 10 мин при 36,5 — 37,5 С, в качестве контрольной пробы используется тромбопластин без инкубации с биологически актиьным веществом и по разнице между временем свертывания в опасной и контрольной пробах судят об антитромбопластиновой а;-,тивности. 3 табл.

1 мл 1%-ного раствора тромбопластина + 4 мл физиологического раствора — 0,2%-ный раствор; 1 мл 1%-ного разведения + 4 мл физиологического раствора — 0,04%-ный раствор.

Используют также 0,2770/,-ный раствор хлористого кальция, 1,34%-ный раствор щавелевокислого натрия.

Бестромбоцитарную субстратную плазму готовят из цельной донорской крови (стабилизированной 1,34%-ным раствором щавелевокислого натрия в соотношении 9;1) путем центрифугирования ее в течение

10-30 мин при 3000 об/мин с тем, чтобы при добавлении к ней 0,1 мл 0,277%-ного раствора хлористого кальция время свертывания ее составляло в среднем 120 с (контроль 1).

Смесь равных частей (no 0,5 мл) стэндартного тромбопластина 0,04%-ного раствора и изучаемого препарата (вещества) 1675767 инкубируют втечение5-6млн при 37 ч 0„1 (: (опытная гроба), Контроль 2 — стандартный раствср тромбопластина 0,047, на физиологическом растворе.

К 0,1 мл 0,277 Д-ного раствора хлористого кальция добавляют 0,1 мл 0,04 4-нога раствора стандартного тромбопластина и через 10 с инкубации при 37 С приливают

0,1 мл бестромбоцитарной субстратной плазмы. Отмечакл время образования сгустка (контроль 2), К 0,1 мл инкубационной "меси стандартного тромбопластина с изучаемым препаратом (веществом) добавляют 0,1 мл

0,277 g,-ного раствора хлористого кальция и через 10 с инкубации при 37 С приливают

0,1 мл бестромбсцитарной субстратной плазмы, Отмечают время образования сгустка (опыт). По разнице между временем свертывания субстратной плазмы со стан. дартным раствором тромбопластина (контроль. 2) на физиологическом растворе и тромбопластина, предварительно инкубированного с фармакологическим или токсическим веществом, судят об антитромбопластиновой активности последних, так как вещества, обладающие антитромбопластиновой активностью, удлиняют время свертывания субстратной плазмы, вызванное добавлением чистого тромбопластина, Пример 1. Для определения антитромбопластиновой активности lо предлагаемому способу готовят рабочий раствор стан:дартного тромбопластина 0.,04 7,, содержащего в 0,5 мл его объема концентрацию О 2 мг/мл, и О 2% раствора кокарбоксилазы, 4G мг препарата растворяют в 10 мл физиологического раствора, 0,5 мл которого смешивают с соответствующим объемом тромбопластина. Смесь инкубируют при 37 +. 0,1 С в течение 5 — 6 мин, Затем после введения инкубационной смеси в бестромбоцитарную субстратную плазму регистрируют время образования сгустка, Результаты анализа показывают, что препарат кокарбоксилазы обладает выраженным антитромбопластиновым действием в условиях прямого взаимодействия препарата со стандартным тромбопластином, о чем свидетел ьствует удлинение (e 3 раза) времени свертывания плазмы с 33 с (в контрольной пробе после добавления чистого тромбопластина) до 99 с.

Пример 2, Для определения антитромбопластиновои активности этиловогс спирта пп предлагаемому способу готовят рабочий раствор зтанола концентрации

0.02 г/мл, 0,5 мл обьема ко горого смешива45

50 тромбопластина) до 47 с указывает на умеренный антитромбопластиновый эффект феноптина в условиях прямого взаимодействия препарата с тромбопластином.

В табл.1 представлена сравнительная характеристика известного и предлагаемого способов.

Влияние температуры и длительности инкубации реакционной смеси препарата унитиола с тромбопластином на время свертывания бестромбоцитарной субстратной плазмы (с), и == 22 показано s табл.2.

Достоверность различий определяют по отношению к контролю (контролем для чистого тромбопластина на физиологичеют в 0,5 мл 0,04,-ного раствора стандартного тромбопластина, содержащего в этом объеме чистого вещества 0,2 мг/мл. Смесь инкубируют в течение 5-6 мин при 37 + 0,1 С.

5 Затем смесь вносят в бестромбоцитарную субстратную плазму и регистрируют время образования сгустка.

Результаты анализа показывают, что этиловый спирт обладает прямым антитром10 бопластиновым действием, о чем свидетельствует удлинение времени свертывания плазмы от 33 с (в контрольной пробе после прибавления чистого тромбопластина) до

59 с.

15 Пример 3. Для определения антитромбопластиновой активности препарата унитиола по предлагаемому способу готовят реакционную смесь из 0,5 мл ампульного препарата унитиола (концентрации 5$, 2G 5 мл) с 0,5 мл стандартного тромбопластина (концентрация 0,2 мг!мл), Смесь инкубируют в течение 5 — 6 мин при+37 + 0,10С. После добавления инкубационной смеси в бестромбоцитарную субстратную плазму

25 регистрируют время ее свертывания.

Результаты анализа свидетельствуют о наличии выраженного антитромбопластинового эффекта унитиола — время образования сгустка с 33 с (в контрольной пробе с

3G введением чистого тромбопластина) удлиняется до 94 с.

Пример 4, Для выявления антитромбопластиновой активности препарата фенотипа по предлагаемому способу готовят

35 смесь из 0,5 мл ампул ьного препарата феноптина(концентрации 2,5 мг/мл) и 0,5 мл

0,04 -ного раствора стандартного тромбопластина, содержащего 0,2 мг/мл чистого вещества, Смесь инкубируют в течение 5 — 6

40 мин+37 +. 0,1 С, после чего смесь вносят в, бестром бо цита рн ую субстратную плазму.

Регистрируют время свертывания плазмы.

Удлинение времени свертывания плазмы с 33 с (a контроле с введением чистого

1675767 в то время как в известном способе об антитромбопластиновой активности судят косвенно.

Простота вып,.лнения предлагаемого

5 способа позволяет испольэовать его как для экспресс-оценки существующих препаратов на наличие (отсутствие) антитромбопластиновых свойств, так и для скрининга новых химических соединений с гемостазо10 активной направленностью.

Формула изобретения

Способ определения антитромбопластиновой активности биологически активного вещества путем определения времени

15 свертывания плазмы в опытной и контрольной пробах, отличающийся тем что, с целью повышения специфичности и ónðoщения способа за счет выполнения ln vitro, определяют время свертывания бестромбо20 цитарной субстратной плазмы с коммерческим тромбопластином после его предварительной инкубэции в течение 4 — 10 мин при 36.5о э

37,5 С, в качестве контрольной пробы используют тромбопластин без инкубации с

25 биологически активным веществом и по сравнению с временем свертывания в опытной и контрольной пробах судят об антитромбопластиновой активности, ском растворе служит бестромбоцитарная субстратная плазма, время свертывания которой 122 й9,0с.

Как видно из табл.2, положительный эффект препарата унитиола проявляется в условиях инкубации его с тромбопластином в температурном (+36-38 С) и временном (410 мин) диапазонах.

Влияние температуры и длительности инкубации реакционной смеси этанола с тромбопластином на время свертывания плазмы (с), n - 24 показано в табл.3.

Как видно из табл.3, этанол при прямом взаимодействии с тромбопластином оказывает антитромбопластиновый эффект в условиях инкубации реакционной смеси s температурном диапазоне 36-38 С в течение 4-10 мин выдержки., Такйм образом. определение антитром бопластиновой активности биологически активных соединений по предлагаемому способу имеет ряд преимуществ по сравнению с известным: позволяет получить в условиях in vitro легко .воспроизводимые и достоверные результаты путем однократного измерения в течение 30-60 мин. По разнице с контрольной пробой результаты активности можно выразить количественно, .30

Таблица 1

Показатели

Способ известный и е лагаемый

Низкая

Высокая

В условиях целостного организма (in чЬа) Ин витро

Да

Нет

16 дней-месяцы

30 — 60 мин

Большое (исчисляемое граммами) 4-6

0,1-0,2

Нет

Низкая

Да

Высокая

Специфичность определения

Условия проведения измерений

Использование лабораторных животных

Время, необходимое для получения конечного результата

Количество используемого препарата

Число выполняемых анализов

Количество плазмы, необходимое для получения результатов анализа, мл

Возможность получения достоверного результата при однократном измерении

Восп оизво имость

Минимальное (миллиграм- . мы) Таблица 2

Стат !

Каэ гел M

Wl

Р

Таблица 3

Ста

1ока тел

Составитель Т. Ковалева

Редактор M. Бланар Техред M.MîðãeHòàë Корректор О, Кундрик

Заказ 2998 Тираж 389 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1". 3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Произеодстз*нно-издательский коисинат "Патент", г. Ужгород, уа. Гагарина, 10 I