Рекомбинантная плазмидная днк prd 100 - источник зонда для идентификации возбудителя чумы, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент рекомбинантной плазмиды prd 100

Рекомбинантная плазмидная днк prd 100 - источник зонда для идентификации возбудителя чумы, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент рекомбинантной плазмиды prd 100

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Целью изобретения является создание зонда для идентификации возбудителя чумы и ускорения идентификации чумы. Клонирован фрагмент плазмиды пестициногенности чумного микроба в кишечной палочке в составе плазмидного вектора pUC19. ДНК-зонд получают из рекомбинантной плазмиды pRD100 после гидролиза рестриктазой EcoRI и введения радиоактивной метки G PJdATP с помощью ДНК-полимеразы. Из двадцати двух исследованных видов бактерий с зондом гибридизуются только штаммы Y. pestis, включая полевочью разновидность и штаммы I серотипа Y. pseudotuberculosis. Рекомбинантная плазмида pRD100 может быть использована в качестве источника ДНК-зонда для совершенствования схемы идентификации чумного микроба и представителей I серотипа псевдотуберкулезного микроба. 2 з.п.флы, 1 табл. 00 с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

N EO

ЙИПМ9ЬИВЛИ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4669103/13 (22) 28.03.89 (46) 15.09.91 Бюл. ¹ 34 (7-1) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) О,Н.Подладчикова и Б,Н.Мишанькин (53) 575.224.2,577.2.048 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1615181, кл. С 12 N 15/31, 1989. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК

pRD 100 — ИСТОЧНИК ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ

БАКТЕРИЙ Escherichia соИ вЂ” ПРОДУЦЕНТ

РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДЫ pRD—

100 (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии, Целью изобретения являетИзобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, генетической инженерии и может быть использовано для совершенствования схемы идентификации возбудителя чумы, в том числе для тестирования штаммов полевочьей разновидности возбудителя чумы, в которых нет плазмиды пестициногенности.

Цель изобретения — создание зонда для идентификации возбудителя чумы и ускорение идентификации чумы, Для этого была создана рекомбинатная плазмида pRD100, несущая фрагмент ДНК который присутствует во всех штаммах чумных микробов.

Рекомбинантная плазмидная ДНК

pRD100 является источником зонда для,,5U„„1677059 Al

R 1:19) ся создание зонда для идентификации возбудителя чумы и ускорения идентификации чумы, Клонирован фрагмент плазмиды пестициногенности чумного микроба в кишечной палочке в составе плазмидного вектора

pUC19. ДНК-зонд получают из рекомбинантной плазмиды pRD100 после гидролиза рестриктазой EcoRI и введения радиоактивной метки fct P) dATP с помощью ДНК-полимеразы. Из двадцати двух исследованных видов бактерий с зондом гибридизуются только штаммы Y. pestis, включая полевочью разновидность и штаммы серотипа Y.

pseudotuberculosis. Рекомбинантная плазмида pRD100 может быть использована в каче- стве источника ДН К-зонда для совершенствования схемы идентификации чумного микроба и представителей 1 серотипа псевдотуберкулезного микроба. 2 э.п.флы, 1 табл. идентификации возбудителя чумы длиной

2826 п.н. и содержит — EcoRl/EcoRl — фрагмент, являющийся

ДНК вектора РИС19, размером 2689 п,н„ вЂ” EcoRl/EcoRl — 140 п.н. фрагмент плазмиды пестициногенности чумного микроба.

Плазмида неконъюгативна, амплифицируется при добавлении в культуральную среду хлорамфеникола. Синтез и накопление ДНК-зонда происходит в процессе репликации рекомбинантной плазмиды за счет репликона вектора pVC19. Штамм-п родуцент зонда получают трансформацией клеток Е,coll JM103.ïëàçìèäoé pRD 100.

Присутствие в штамме рекомбинантной плазмиды подтверждается способностью клеток образовывать неокрашенные коло1677059 нии на питательных средах с ампициллином (50 мкг/мл) и индикатором Xgal, а также продуцировать плазмидную ДНК, из которой при гидролизе рестриктазой Есо Rl выщепляется фрагмент длиной 140 п.н.

Для конструирования рекомбинантной плазмиды ДНК вектора pVC19, гидролизованного рестриктазой EcoRI, легируют с фрагментом ДНК плазмиды пестициногенности чумного микроба, Лигазной смесью трансформируют штамм Е.соИ JM 103 и отбирают клоны, не способные гидролизовать индикатор Xgal из-за отсутствия Р- галактозидазной активности.

Штамм Е.coll — продуцент рекомбинатной плазмиды депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН

СССР под номером BKM CR — 310 О.

Штамм ВКМ CR — 310 0 характеризуется следующими признаками, Морфологические признаки.

Клетки имеют вид грамотрицательных коротких полиморфных палочек размером

1-2 х 0,3 — 0,5 мкм, Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на различных питательных средах; на arape Хоттингера или

LB(pH 7,1 — 7,2) образуют серые гладкие блестящие мутные колонии диаметром 2 — 3 мм, на жидких средах — равномерную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут при 4 — 45 С, оптимум рН среды 6,8 — 7,5; ферментируют с образованием кислоты и газа глюкозу, арабинозу, галактозу, маннозу, не ферментируют лактозу, нуждаются в пролине, тиамине, лизируются кишечными фагами i4 и Т7, штамм устойчив к ампициллину и стрептомицину.

Пример 1. Клонирование фрагмента плазмиды пестициногенности в кишечной палочке в составе плазмидного вектора

pVC19, Плазмиду пестициногенности чумного микроба (pYPI) выделяют из стационарной жидкой культуры штамма Y,pestls 556/106

Опеп.

10 мкг плазмидной ДНК гидролизуют в течение 1 ч при 37 С рестриктазой Mspl (30 ед.) в 300 мкл буфера; содержащего 10 мМ трис-НО (рН 7,6), 10 мМ Мд CI2, 50 мМ NaCI.

Полноту гидролиза контролируют электрофорезом 1/20 части реакционной смеси в

5 -ном полиакриламидном геле (ПААГ), Реакцию останавливают прогреванием при

100 С в течение 10 мин и ДНК осаждают из

0,3 M ацетата натрия (рН 5,5) этанолом, Осадок растворяют в 100 мкл воды, добавляют

20 мкл 50 -ного глицерина с маркерными

55 красителями и подвергают электрофорезу в пластине 5 g,-ного ПААГ для разделения фрагментов ДНК, полученных в результате

Mspl — гидролиза плазмиды, После окрашивания ПААГ бромистым этидием из геля вырезают фрагмент ДНК длиной 280 п.н. и элюируют его из геля 400 мкл раствора, содержащего 0,5 M ацетат аммония, 0,01 М ацетат магния, 0,17, SDS, 1 мМ ЭДТА. После элюации ДНК осаждают дважды этанолом из 0,3 M ацетата натрия (рН 5,5).

Mspl-фрагмент плазмиды p YP I клонируют по EcoRI — сайту вектора pVC19 после заполнения "липких" концов у вектора и фрагмента с помощью ДНК-полимеразы

Кленова в присутствии четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов. В результате легирования по "тупым" концам по краям фрагмента должны появиться два сайта узнавания рестриктазы FcoRI, позволяющие вырезать фрагмент из плазмиды.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pRD100 проводят следующим образом, 1 мкг вектора pVC19 гидролизуют рестриктазой ЕсоЮ (5 ед.) в течение 1 ч при 37

С в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ трисHCI, (рН 7,6), 10 мМ MgCIj., 150 мМ NaCI.

Полноту гидролиза контролируют электрофорезом аликвоты реакционной смеси в

0,87;-ном агарозном геле. После инкубации смесь прогревают при 100 С 5 мин. и ДНК осаждают из 0,3 М ацетата натрия (рН 5,5) эта нолом.

Для заполнения "липких" концов, образованных при гидролизе рестриктазами, вектор и фрагмент в эквимолярных количествах смешивают в буфере следующего состава: 10мМ трис-HCI (рН 7,6), ",0 мМ МдС, 150 мМ NaCI, добавляют дезоксирибонуклеотиды (d АТР, dGTP, dCTP, dTTP) до концентрации 100 мкМ и 80 ед. фрагмента Кленова

ДНК-полимеразы 1. После 20 мин инкубации при 15 С реакцию останавливают прогреванием при 100 С в течение 5 мин и ДНК осаждают этанолом из 0,3 М ацетата натрия (рН 5,5), Легирование вектора и фрагмента проводят в 30 мкл буферного раствора (50 мМ трис-HCI, рН 7,6, 10 мМ MgC4, 0,5 мМ АТР, 5 мМ дитиотрептол) с помощью ДНГ-лигазы фага Т4 (30 ед.). После 6 ч инкубации при 15

С реакцию контролируют электрофорезом аликвоты (1/10 ч) в 0,8 Р-ном агарозном геле.

Лигазной смесью (1/10 ч) трансформируют штамм Е.соИ. После трансформации культуру высеивают на агаризованную среду LB, содержащую 50 мкг/мл ампицилли1677059 на, 40 мкгlмл индикатора Р -галактозидазной активности Xgai и 240 мкг/мл индуктора

/3-галактозидазы ИПТГ (изопропил- /3-Д-тиогалактопиранозид). Через 14 — 20 ч на чашках вырастают колонии трансформантов.

Рекомбинантные клоны отбирают по отсутcTBvIIo P -галактозидазной aKTNBHocTN, поскольку у них нарушается способность синтезировать Р-галактозидазу из-за сдвига рамки считывания фермента при встраивании в векторную плазмиду фрагмента

ДНК длиной 280 п..о.

Из клеток рекомбинантных клонов была выделена плазмидная ДНК, Анализ плаэмидных ДНК осуществляют с помощью рестриктаз Mspl u EcoRI. Для этого по 1 мкг плазмид разных клонов гидролизуют рестриктазами, как описано выше, после чего подвергают гидролизат электрофорезу в

5 -ном ПААГ, Все рекомбинантные клоны содержат фрагмент 280 п.п., который, помимо двух EcoRI-сайтов на концах фрагмента, имеет дополнительный EcoRI-сайт, расщепляющий его на два равных фрагмента, После гидролиза рекомбинантной плазмиды рестриктазой и релегирования гидролизата получают рекомбинантную плазмиду pRD100. Гидролиз, релегирование и анализ рекомбинантных клонов проводят как описано выше.

Секвенирование рекомбинантной плазмиды pRD100 модифицированным методом

Максама и Гилберта показывает, что она содержит фрагмент ДНК длиной 140 п.о., в структуре которого имеется последовательность, содержащая открытую рамку считывания 35 кодонов неизвестного белка, кодируемого плазмидой пестициногенности чумного микроба, Пример 2, Использование рекомбинантной плазмиды pRD100 в качестве источника ДНК-зонда для идентификации чумного микроба, Штамм-продуцент рекомбинантной I плазмиды pRD100 получают трансформацией плазмидной штамма Е.coli JM 103 по методу Кохена. Из стационарной жидкой культуры продуцента выделяют плазмидную ДНК, Для получения радиоактивного зонда

5 — 8 мкг плазмиды pRD 100 гидролизуют 1 ч при 37 С рестриктазой EcoRI в 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН

7,6, 10 мМ MgCIz, 150 мМ NaCL Полноту гидролиза контролируют электрофорезом аликвоты (0,2 мкг) реакционной смеси в

0,8 g -íoì агароэном геле. K реакционной смеси добавляют 3 мкг (аз Р) d АТР с удельной активностью 3000 ки/Ммоль, 2 мкл 5 мМ d ТТР и 1 мкл (5 — 7 ед,) фрагмента

Кленова ДНК-полимеразы 1. Смесь инкубируют при комнатной температуре 10 мин, добавляют 20 мкл 50 -ного глицерина с

5 красителем бромфеноловым синим и подвергают электрофорезу в пластине 5 -ного

ПААГ для отделения фрагмента от вектора и не включенного в ДНК (сР Р) d ATP. Положение фрагмента в геле определяют после авторадиографии в течении 20 — 40 мин. Меченый фрагмент вырезают из геля и элюируют 0,3 M ацетатом натрия (рН 5,5) в течение

2 ч при 65 С, К элюату добавляют 10 мкг тРНК-носителя и 2,5 объема 96 ь-ного этанола для осаждения ДНК. Осадок растворяют в 100 мкл дистиллированной воды, прогревают при 100 С в течение 10 мин и используют в качестве зонда для гибридизации колоний видов бактерий, Клетки разных видов микроорганизмов, выращенные на агаризованных питательных средах, наносят на нитроцеллюлозный фильтр с помощью стеклянных палочек, 3атем фильтр помещают на фильтровальную бумагу, смоченную 0,5 NaQH, на 5 — 10 мин, Для нейтрализации фильтр помещают на 10 мин на фильтровальную бумагу, пропитанную раствором 0,2 М трис-HCI (pH 7,5) и 1 M

NaCI. После 5-минутного просушивают на воздухе фильтр погружают на 15 мин в раствор 300 мМ NazHPOq и 50 ЭДТА (рН 6,8).

После этого фильтр высушивают при комнатной температуре, а затем прогревают при 80 С в течение 2 ч. Предгибридизацию проводят в течение 1 — 2 ч в растворе, содержащем 2 х SSC.0,2 / SDS, 5 х Denhardt, 100 мкг/мл ДНК из молок лосося (однократный

SSC: 150 мМ NaC!, 15 мМ цитрат Na, однократный Denhardt 0,01% фиколя, 0,017; бы40 чий сывороточный альбумин, 0,01% поливинилпирролидон), Из этого раствора фильтр переносят в раствор для гибридизации (4 х SSC, 0,27; SDS, 2 x Denhardt, 100 мкг/мл ДН К лосося), к которому добавляют приготовленный, как описано выше, зонд, Гибридизацию проводят при 60 С в течение

2 — 14 ч, после чего фильтр отмывают 2 — 3 раза при комнатной температуре, а затем при температуре гибридизации 1 ч, Высушенный при 60 С фильтр авторадиографировали в течение 12 — 36 ч с использованием усиливающих экранов, Результаты гибридизации разных видов микроорганизмов с зондом, полученным из плазмиды pRD100, приведены в таблице.

Как следует из таблицы, зонд гибридизуется со всеми штаммами чумного микроба, а также с представителями I серотипа Yersinia

pseudotuberculosIs (полевочья разновид1677059 ность), К тому же, так как зонд иэ плазмиды короче, чем в прототипе, скорость гибридизации с ним в 4-5 раз меньше, чем в прототипе РЕК 7, Формула изобретcния

1. Рекомбинантная плаэмидная ДНК

pRD100 — источник зонда для идентификации возбуждения чумы размером 2826, п.н., содержащая; — EcoRl/EcoRl — фрагмент, представляющий собой ДНК вектора pVC19, размером

2686 п.н; — EcoRl/-EcoRI — 140 п,н. фрагмент плазмиды пестициногенности чумного микроба; — системы рестрикции:

-два участка расщепления рестриктазы

EcoRI, расположенных на расстоянии 140 п,н, друг от друга; — два участка расщепления рестриктазы

Pvuli, один из которых находится на расстоянии 90 п,н. против часовой стрелки от левого EcoRi-сайта, другой — на расстоянии

232 п.н, по часовой стрелке от правого

EcoRI-сайта; — генетические маркеры: — ген Р -лактамазы, обеспечивающий резистентность к ампициллину (Ар"); N-концевая часть гена -галактозидаэы из Е.coll, инактивированная в результате встраивания чужеродного фрагмента, обеспечивающая фенотип IGC .

2. Способ конструирования рекомби5 нантной плазмиды pRD100, заключающийся в том, что вектор pVC19 обрабатывают рестриктазой EcoRI и смешивают с фрагментом длиной 280 п.н., выделенным иэ плазмиды пестициногенности чумного

10 микроба с помощью Mspl; вектор и фрагмент обрабатывают ДНК-полимеразой

Кленова в присутствии четырех дезоксинуклеоэидтрифосфатов и легируют ДН К-лигазой Т4, рекомбинантными плаэмидами

15 трансформируют штамм Е.coll JM103 и отбирают клоны, устойчивые к ампициллину и не обладающие Р -галактоэидазной активностью (IBC ), из которых выделяют рекомбинантную плазмиду, гидролизуют ее

20 EcoRI, повторно легируют и трансформируют TOT æå штамм, из ампициллинустойчивых ас штаммов выделяют рекомбинантную плазмиду pRD100, содержащую 140 из 280 п.н. Mspi — фрагмента плаэмиды пестицино25 генности чумного микроба.

3. Штамм бактерий Escherlchia соП— продуцент рекомбинантной плазмиды

РЮ100.

1677059

Вид микро

Yersinia pesris

Yersonia pseudoruderculosis (I серотип) 30

Yer s inia ps cud o rub ercul o si s (II-VI с) 70

Yersinia encегоcolirica

Yersinia krisrensenii

Yersinia frederiksenii

Yersinia inrermedia

Escherichia соli

Salmonella pararhyphi

Shigella dysenreriae

Shigella flexneri

Kledsiel1a pneumoniae

Proteus nilgaris

100

Pseudomonas aeruginosa

Alcaligenes fаеса1is

Pasreurella multocida

Francisella fularensis

Brucella melirensis

Vibrio cholerae

Vibrio alginoliricus

Vibrio parahaemoliricus

Aегоmonas anaегоgenes

Составитель Е.Кузнецова

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор С.Черни

Редактор M.Öèòêèíà

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3083 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5