Штамм зеленой одноклеточной водоросли сноriсysтis sp. для получения антисыворотки, предназначенной для выявления этих водорослей

Штамм зеленой одноклеточной водоросли сноriсysтis sp. для получения антисыворотки, предназначенной для выявления этих водорослей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии марикультуры и предназначено для получения диагностикума - антисыворотки, используемой для выявления клеток водорослей , паразитического симбионта мидий, симбионта, потенциально опасного для марикультуры этих молюсков. Цель изобретения - получение нового штамма зеленой одноклеточной водоросли Choricystis sp., используемой для получения антисыворотки , предназначенной для выявления этих водорослей. Штамм выделен из популяции, обладает антигенами, гомологичными таковым у десяти независимых изолятов. Получаемые при иммунизации клетками штамма Ch. sp. штаммы Ф-1-1 сыворотки характеризуются высоким выходом антител

союз соВетских социАлистических

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 1/12//С 12 R 1:80

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4682843/13 (22) 24,04.89 (46) 23.09.91. Бюл. N 35 (71) Ленинградский государственный университет (72) К.В.Квитко, Ж. Г, Кирсанова, Л.Н.Тихонова, Б.В.Громов и Ю.С.Минчев (53) 636.085.639.64(088,8) .(56) Kinzle R.A„Chee G.S, Strain — specific

differences in surface antigens of symbiotic

algae, — Microbiology, 1982, ч. 44, ЬЬ 5, р, 1238 — 1240.

Stevenson R.W., South R.G. Observations

on Phagocytosis of Coccomyxa parasitlca (coccomyxaceae; chlorococcalls) 1и

Placopecten magellaniens — J. of invertebr:

pathology, 1975, ч. 25, р. 307 — 311. (54) ШТАММ ЗЕЛЕНОЙ ОДНОКЛЕТОЧНОЙ

ВОДОРОСЛИ CHORICYSTIS SP. ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ, ПРЕДНАЗНАЧЕННОЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭТИХ

ВОДОРОСЛЕЙ (57) Изобретение относится к биотехнологии марикультуры и предназначено для полИзобретение относится к биотехнологии марикультуры и представляет собой штамм зеленой одноклеточной водоросли

Choricystis sp., используемый как антиген для получения специфической антисыворотки, позволяющей идентифицировать клетки паразитического симбионта мидии съедобной — объекта марикультуры, Цель изобретения — получение нового штамма водоросли Choricystis sp. для получения антигена, используемого при приго„„SU ÄÄ 1678829 А1 учения диагностикума — антисыворотки, используемой для выявления клеток водорослей, паразитического симбионта мидий, симбионта, потенциально опасного для марикультуры этих молюсков. Цель изобретения — получение нового штамма зеленой одноклеточной водоросли Choricystis sp., используемой для получения антисыворотки, предназначенной для выявления этих водорослей, Штамм выделен из популяции, обладает антигенами, гомологичными таковым у десяти независимых изолятов, Получаемые при иммунизации клетками штамма Ch, sp. штаммы Ф-1-1 сыворотки характеризуются высоким выходом антител (2 — 2 ) и относительно малой долей неспе11

l цифических антител, удаляемых путем истощения сыворотки антигенами известных коллекционных штаммов водорослей (216—

5, 216 — 10), При истощении суммарный титр антител снижается лишь вдвое. Высокое со- 2 держание антител удается поддерживать реиммунизацией в течение 40-45 недель. 2 ил., 3 табл, товлении антисыворотки, предназначенной для выявления этих водорослей.

На фиг, 1 и 2 изображена схема иммунизации и динамика накопления антител у жиВотных.

Штамм выделен иэ тканей мидии съедобной -ему присвоен М Ф-1-1,депонирован в коллекции водорослей ИФР AH СССР под номером Н вЂ” 253, Культурально-морфологические п риэнаки.

1678829 ка. При этом фиг. 2а характеризует реакцию 55 идентичности штаммов М вЂ” 2-1, Л-25, MКолонии зеленого цвета (на среде Бристоля с пентоноль, г/л: ИайОз 0,25; КН2РО4

0,175, К НР04 0,075; NaCI 0,025; СаС!р х х2НгО 0,025; MgS04 7Н О 0,075; пептбн

1,0; агар-агар 1,5 „в жидкой среде гомоген-. нвя суспензия, без перемешивания клетки оседают. Клетки овальные и почковидные, размер 4,6 х3,0 мкм, переноид отсутствует.

Оптимальные условия выращивания: среда Бристоля с пентоном, температура

20 — 25 С, освещение — круглосуточное, освещенность 4000 лк (лампы ДС 80).

Для выделения водоросли в чистую культуру использована минеральная среда по рецепту Болда-Бристоль (Б) с добавкой пептона, Выбор штамма для получения антисыворотки к его поверхностным антигенам осуществлен на основе комплексного морфолого-экологического критерия. В табл. 1 приведено описание части коллекции симбионта и сопутствующих мидиям водорослей.

Примеси в изолятах водорослей четко идентифицированы по сочетанию признаков: округлая форма (!/д 1,2), прототрофHocTb и быстрый рост, отсутствие бобовидных клеток, На границах микроареалов распространенности паразитического симбионта гетерогенность по патогенности не должна существовать, так как в неспособствующих заболеванию условиях поражения могли вызвать лишь клоны с максимальной вирулентностью.

Изолят выбран из банки вблизи фарватера. Изолят Ф-1 был очищен от сопутствующих бактерий, колонии его были единообразны и один из субклонов (Ф вЂ” 1 — 1) выбран в качестве типичного для штамма, который далее сохраняли пересевами с проверкой на типичность. По ряду признаков морфологии — это типичный симбионт (табл, 1), а по редкости встречаемости паразита в мидиях — максимально вирулентный (одна зараженная особь на 150 моллюсков), Примеры использования штамма для получения диагностикума приведены в табл. 2 и 3 и на фиг. 1 и 2. На фиг. 1 представлен ход иммунизации и динамика накопления антител у животных ММ 2, 3, 4, при этом стрелки вниз обозначают иммунизацию, стрелки вверх — реиммунизацию. На фиг. 2 представлена разная степень иден тичности антигенов водорослей по реакции преципитации с антисывороткой к. штамму

Ф-1 — 1 с указанием шифра штаммов (подробная их характеристика приведена в табл. 2), буквой С обозначена антисыворот5

53/1 М вЂ” 77/11, а фиг. 26 — реакцию неидентйчйости, отсутствие антигенов в гомогенатах клеток штаммов M — 42/1, М вЂ” 15/2 и гетерологичность антигена у СА1 — 362.

Размножение клеток штамма Ф вЂ” 1-1 производят на плотной среде Б с добавкой

15 г агар-агар на 1 л и 1. r.ïåïòîíà при освещенности 4000 лк (от люминесцентных ламп) и температуре 20 — 25 С. Через неделю после посева на чашке Петри появляется сплошной газон водорослей — колонии зеленого цвета. При суспензировании этих клеток образуется гомогенная взвесь, без перемешивания они быстро оседают.

Для инъекции суспензии клеток в стерильном забуференном физрастворе (PBS) с рН 7,0-7,5 (на 1 л H20:8,75 r NaCI; 0,53г

КН РОд, 2,28 г NazHP04 12НрО) готовят с таким расчетом, чтобы концентрация клеток составила 10 кл/мл, Кроликов иммунизируют еженедельно в течение месяца, вводя подкожно 1,2 мл суспензии Choricystis sp. шт. Ф вЂ” 1 — 1. Инъекции делают в шести точках (no 0,2 мл) вдоль позвоночника, по три с каждой стороны.

Получена специфическая антисыворотка с высокой активностью (2 — 2""), Титр антител в сыворотке определяют методом предельных разведений по реакции агглютинации с клетками штамма Ф вЂ” 1 — 1. Во всех случаях иммунные сыворотки имели достаточно высокий титр антител после 3 — 4 прививок один раз в неделю. В известных способах нужного титра антител достигают после десяти и более недель иммунизации.

Это позволяет считать, что штамм Ф вЂ” 1 — 1 обладает высокой антигенной активностью (фиг, 1), Проведение теста двойной радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони показало, что доминирующая пара антиген-антитело одна, так как выявлена лишь одна полоса .преципитации. Этот результат соответствует результатам теста на агглютинацию, Гомогенаты чужеродных штаммов не давали полос преципитации или имели четко гетерологическую полосу(фиг. 2). Обработанные антисывороткой клетки- штамма Ф-1-.1

Choricystis sp. в реакции непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) дали яркое специфическое свечение.

При лабораторной проверке выявлена сходная морфология штамма Ф-1-1 и водорослей рода Соссомуха, но иммунологическая характеристика поверхностных антигенов в реакции НИФ: агглютинации и двойной радиальной иммунодиффузии по

Ухтерлони показала их негомологичность (табл. 2).

1678829

Таблица 1

Шифр штамма, дата изоляции

Размеры клетки, мкм

И ндекс 1/д

Частота бобовидных клеток, Потребность в пептоне; итоговая характеристика длина (i +.5) Ширина (d+ S) M-2-1, 1984

M-11, 1985

M-42, 1986

M-Мз, 1986

M-77, 1986

Л-25, 1986

Ф-1-1, 1986

Ф-1-1, 1986

Ф-1-1

3,2+0,72

3,3++ 0,60

3,1:"0,67

3,1 +.0,63

2,0 -0, 14

2,0:"0,4+

3,0 0,79

2,3":0,55

3,6+0,62

5,3 -1,26

3,8+0,62

4,3+1,07

4,3 +.1,11

3,7+0,54

3,8 1,20

4,6+1,44

4,5 -1,15

6,3+1,18

19

19

44

+, симбионт

1,7

1,2

1,4

1,4

1,9

1,9

1,5

1,9

1,8 —, примесь

+, симбионт п

I

II

I

П

I

+, симбионт

Н

1

Н

73

Из табл. 2 видно, что антисыворотка, полученная при иммунизации кроликов клетками штамма Ф-1-1, реагирует лишь с клетками симбионтов, в том числе выделенных из морских животных (губка, мидия).

Видимо клетки симбионтов имеют сходные антигены, Для устранения неспецифических антител использовали истощение антисыворотки гетерологичными антигенами (табл. 3) клеток штаммов 216 — 5 и 216 — 10, обладавших довольно высоким титром (2) антигенов и дававших положительную реакцию

НИФ. Истощение проводят путем двукратного суспензирования 10 клеток в 1 мл сыворотки (предварительно разбавленной в 6 раз) в течение 1 ч п ри 37 С. После истощения титр неспецифических антигенов падает практически до нуля, так как исчезала положительная реакция НИФ, а суммарное количество антигенов уменьшилось наполовину.

Таким образом, наблюдается соответствие между результатами двух различных серологических тестов, а в тесте НИФ истощенная поливалентная сыворотка служит более точным индикатором гомологии поверхностных антигенов, хотя при комплексном анализе (табл. 1) идентификация была

5 безошибочной, Специфичность серологических признаков коллекционных штаммов позволяет использовать реакцию НИФ для выявления клеток водорослей, серологически родст10 венных симбионтам мидий, в пробах морской воды и в смывах с поверхности (или в гомогенатах) мидий в различных участках

Кандалакшского залива.

Антисыворотка к поверхностным анти15 генам клеток штамма Ф вЂ” 1 — 1 может служить диагностикумом для идентификации симбионта и изучения степени родства водорослей рода.

20 Формула изобретения

Штамм зеленой одноклеточной водоросли Choricystis sp. ИФР N -Н-253 для получения антисыворотки, предназначенной

25 для выявления этих водорослей.

1678829

Штамм Таксон

4,9 + 1,3

Симбиоит мидии

1,6

5 ° 9 >O,Ь 1,!

Фикобионт лишайника

Симбионт мидии

То же

1,7

Л-25 и-53/I

1,8

+++

1,6

++++

++++

1,8

И-42/l

1,2

Сопутствующие choriсувс3.8

1,3

Шарообразные

М-15/2 То же

О

То же

p.Coccomyxa

1>5

О

2 >

1,8

1>8

+/2,0

2,2

+++

1,6

++++

1,4

Р.chlorella и Ankistrodesmus из CALVE коллекции водорослей ЛГУ (Г1) О О

826

Ch.sarakiniana

Симбионт губки

Шарообразные

827

828

То же

Шарообразные

То же

185

192

829

2 +/»

252

Овальные заостренные на концах

Anki8rrade8slUs сопчо1с1ов Свободноживущие

А.falkacus

A.ïàïïîâå1åïå

То же

Il

Овальные

То же

254

+/362 A,.sp.

Таблица 3

Ф I-f Charicyscis sp.

49,84 Coccomyxa sp.

И-2-1 Choricysris sp.

И-53-! Choricyscis sp.

М-77/ 11То же

2 16-2 С.chodarii.

216-4 С.mucigena

?16-5 С.ре1сigerae

216-6 C.pelrigerae

? 1Ь-9а C. simplex

216-10 C.soforinae bisparae

216-1 С.arvenensis

Та же

Ch,sp.

Ch,1uceî÷ir dis

Ch.all ipsoidea

Ch.vulgaris

Симбконт мидии

То же

Мутант симбиоита

Свободиожинущие

Мэ коллекции Гетингенского университета (10) То же

Фикобионт ли>пайиика

Фикобионт лишайника

То же

Симбионт инфузории

Фикобионт лишайника

Эпифит лишайиика

То же

Пища для устриц

Свободиоживущие

То же

Симбиоит инфузории

Свободиоживущие иэ ила в Якутии

++++

++++

++++

++++

2

2

29

29

23

2

23

2»

5, 3 г1,3

3,7Т 0,1

4,4+ 1,2

3,8 21,2

4,19 0,9

3,1 е 0,9

3,3+ 1,1

6,3 9 1>2

7>6+1,1

7,6r1,2

8,0 +1,1

9,4 1,5

7,6 i 1,5

7,1 1,2

1678829

Qã

Ф 1.1

Q7>

Редактор Н, Яцола

Заказ 3182 Тираж 361 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

2з

21

2 1 08 10 . Ж 18;: 82, B. ;:Г6 50 М .78 42 ФЕЕ

НЕбелц иммунизации

6Ll8. 1

Составитель P. Андреева

Техред М,Моргентал Корректор Т. Малец