Способ определения связывающей емкости альбумина в сыворотке крови

Способ определения связывающей емкости альбумина в сыворотке крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа. Сущность его заключается в том, что флуоресцентным способом измеряется связывание с альбумином флуоресцирующих N-карбоксифенилимидов 4-замещенной 1,8-нафталиндикарбоновой кислоты. Для проведения анализа достаточно 0,01 мл сыворотки крови. Расход красителя 11 мг на 1000 анализов. Длительность определения не более 3,5 мин. 3 табл

СОЮЗ СОВЕ TCKMX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 6 01 N 33/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ :

О R

) м-(Ц в., Ъ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4720987/14 (22) 25.07.89 (46) 30,09.91. Бюл. М 36 (71) Научно-исследовательский институт физико-химической медицины и Научно-производственное объединение

"Монокристалл реактив" (72) Ю.И.Миллер, Г.Е.Добрецов, Б.M.Красовицкий, Л.И.Кормилова и И.Г.Ермоленко (53) 612.015 (088.8) (56) Чегер С.И. Транспортная функция сывороточного альбумина, 1975, с. 183.

Изобретение относится к способам исследования биологических жидкостей, а именно альбумина сыворотки крови, и может быть использовано для изучения других жидкостей, содержащих альбумин.

Цель изобретения — упрощение и ускорение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выявления снижения связывающей емкости альбумина, включающему добавление к разбавленной сыворотке крови веществ, специфически взаимодействующих с альбумином, последующее фотометрическое измерение параметра раствора и определение его отклонения от нормы, в качестве вещества, специфически взаимодействующего с альбумином, используют флуоресцирующие соединения (ФС) — N-карбоксифенилимиды 4-замещенной 1,8-нафталиндикарбоновой кислоты формулы

». Ы 1681266 Al (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ ЕМКОСТИ АЛЬБУМИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине.

Цель изобретения — упрощение и ускорение способа, Сущность его заключается в том, что флуоресцентным способом измеряется связывание с альбумином флуоресцирующих N-карбоксифенилимидов 4-замещенной 1,8-нафталиндикарбоновой кислоты.

Для проведения анализа достаточно 0,01 мл сыворотки крови. Расход красителя 11 мг на

1000 анализов, Длительность определения не более 3,5 мин. 3 табл, где R =- и(Снз)2, й(Сзнь)з:

R) = Н, СООН; й2 = ОН, СООН.

Часть указанных соединений известна.

Соединение, где R =- М(С >Н;)2, R> — — Н, Р2=

= СООН, получают следующим образом, К кипящему раствору 6,62 г (0,02 моль)

N-карбоксифенилимида 4-хлорнафталиновой кислоты в 100 мл диметилформамида при размешивании в течение 30 мин по каплям добавляют 10 мл диэтилами а. Нагрев реакционной массы продолжаюг 7 ч, после чего ее выливают в воду. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой. Выход 4,7 г (60%). T.ïë, 284-286ОC.

СО и ф о ! ()>

/ ъ

1681266

Найдено, %: N 6,9; С 70,8; Н 5,0, С23Н20Й204

Вычислено, : N 7,2, С 71,1, Н 5,2.

Все перечисленные ФС используются как люминесцентные красители при получении дневных флуоресцентных пигментов в производстве пластических масс. Для целей исследования биологических жидкостей их использование неизвестно, Согласно предлагаемому способу указанные ФС используются для измерения связывающей емкости альбумина, Установлено, что эти вещества в водной среде не флуоресцируют, а при связывании их с альбумином появляется интенсивное свечение, При соблюдении определенных условий по интенсивности флуоресценции можно судить о количестве связанных с альбумином молекул ФС, Вещество добавляется в раствор в избыточном по отношению к альбумину количестве. При снижении связывающей емкости альбумина уменьшается количество связанных с альбумином молекул ФС, что выражается в снижении интенсивности флуоресценции.

Для осуществления способа сыворотку крови разводят в 100 — 2000 раэ буферным раствором с рН 7,4 +. 0,2, добавляют раствор ФС (в любом растворителе, в котором

ФС имеет предел растворимости не менее

1 мМ) в концентрации 2400/Х вЂ” 3600/X мкМ, где X — разведение сыворотки крови, и измеряют интенсивность флуоресценции полученного раствора в области максимального свечения.

Аналогичным образом обрабатывают стандартный раствор альбумина. Результат измерения выражают как процентное отношение интенсивности флуоресценции ФС в исследуемом образце к интенсивности флуоресценции ФС в стандартном альбумине.

Это отношение и есть связывающая емкость альбумина (СЕА). Выявляют снижение

СЕА у пациента, если данный показатель меньше нижней границы нормы. 3а нижнюю границу нормы принято значение СЕА, равное 85 .

Интервал разведения сыворотки крови ограничен тем, что при массивной гипербилирубинемии билирубин поглощает 10 — 12 флуоресцентного света ФС при разведении сыворотки в 100 раз. Поэтому меньшее разведение сыворотки будет давать большую погрешность. Разведение сыворотки более чем в 2000 раз требует 2 — 3-ступенчатой процедуры, что усложняет способ. Интервал рН буферного раствора соответствует интервалу рН крови больных.

Предельное количество молекул, которое может связать альбумин, т.е. его свяэы5

55 вающая емкость,,определяется при избыточном добавлении ФС. Избыточной концентрацией ФС для любой сыворотки крови является концентрация больше 2400/Х мкМ, где Х вЂ” разведение сыворотки, Но при увеличении ФС более 3600/Х мкМ становятся существенными явления экранировки света. Поэтому интервал концентраций ФС, применяемый в предлагаемом способе,—

2400/Х вЂ” 3600/Х мкМ.

Изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. Чтобы показать, что ФС специфичен к альбумину в сыворотке крови, разделяют 8 образцов сыворотки крови на альбумины и глобулины при помощи полиэтиленгликоля. Фракцию альбуминов разводят в буферном растворе(10 мМ трис.kCI, рН 7,2) e X = 100 раэ, добавляют 1 MM раствор ФС(R = й(СНз)2, R1= СООН, Й2 = ОН) в диметилсульфоксиде до конечной концентрации 3600/Х = 36 мкМ и измеряют интенсивность флуоресценции при длине волны

530 нм (возбуждение при 420 нм). Затем добавляют в этот же раствор глобулины, интенсивность флуоресценции практически не изменяется. Если же вместо глобулинов (или вместе с ними) добавить альбумин, то интенсивность флуоресценции возрастает пропорционально количеству альбумина.

Это говорит о том, что в цельной сыворотке крови практически весь флуоресцентный свет от молекул ФС, связанных с альбумином. Флуоресценция в буферном растворе в десятки раз меньше, чем в растворе белка.

Таким образом, ФС позволяет в сыворотке крови измерять характеристики именно молекул альбумина.

Пример 2. В табл, 1 приведена зависимость интенсивности флуоресценции ФС (R = й(С2Н5)2, R> = H, Rz = COOK) от

его концентрации в разведенных (Х = 2000) сыворотках крови с разным количеством альбумина. Для разведения использован буферный раствор: 10 мМ трис.kCI, рН 7,6.

В интервале концентраций 2400/X—

3600/X мкМ интенсивность флуоресценции

ФС не зависит от его количества, а отражает только характеристики исследуемого объекта, Пример 3. Измеряли СЕА предлагаемым способом и с помощью способа-прототипа в сыворотках крови 20 здоровых доноров и 22 больных с синдромом гипербилирубинемии и с гнойно-септическими заболеваниями.

Для этого к 0,01 мл сыворотки крови добавляли 2 мл буферного раствора (10 мМ трйс.HCI, рН 7,4) и 0,03 мл 1 мМ раствора

ФС (R = й(СНз)2, В1 = Н, R2 = COOK) в диме1681266

Таблица 1

*F1 и F2 — интенсивности флуоресценции

ФС в сыворотках крови, разведенных в Х раз, с содержанием альбумина соответственно 51 и 34 г/л. тилформамиде, перемешивали и измеряли интенсивность флуоресценции раствора при 550 нм (возбуждение при 420 нм) в кювете 1 см на медицинском флуориметре

ФМ-Ц-2. Конечное разведение сыворотки Х

=200, концентрация ФС3000/200=15мкМ.

Способ измерения СЕА при помощи красителя конго красного (прототип) известен.

Параллельно аналогичным образом обрабатывают стандартный 5%-ный раствор альбумина. СЕА выражают в виде процентного соотношения интенсивности флуоресценции ФС (предлагаемый способ) или оптической плотности конго красного (прототип) в исследуемом образце и в стандартном альбумине, Полученные данные представлены в табл. 2.

Как видно, среднее снижение СЕА весьма значительно (в 2,5 раза) в этой группе больных и получается практически одинаковым при измерении обоими методами: известным (прототип) и предлагаемым. Однако предлагаемый способ намного проще и быстрее.

Интервал измерений СЕА для здоровых людей составляет 85-111%, тогда как в группе больных — от 20 до 82%, В связи с этим величину 85% целесообразно считать нижней границей нормы, Сравнение предлагаемого способа со способом-прототипом по числу и длительности стадий представлено в табл. 3.

Таким образом, по способу-прототипу из 1478,5 мин затраты времени на проведение операций составляют 8,5 мин — почти в

2,5 раза больше, чем по предлагаемому способу, причем для инкубирования проб требуется 30+ 1440 мин.

Предлагаемый способ не требует больших объемов крови (достаточно 0,01 мл сыворотки), сложного оборудования и дорогостоящих реактивов. Способ позволяет определить такой важный параметр, как связывающая емкость альбумина. Предла5 гаемая методика, не уступая прототипу по точности выявления снижения СЕА, значительно сокращает время проведения и упрощает анализ, позволяет проводить его в автоматическом режиме. При этом для вы10 полнения 1000 анализов достаточно 11 мг флуоресцентного соединения.

Формула изобретения

Способ определения связывающей емкости альбумина в сыворотке крови путем

15 добавления к разбавленной сыворотке вещества, взаимодействующего с альбумином, с последующим измерением количества получаемого продукта и сравнением его уровня с контрольной сывороткой, 20 отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, в качестве вещества, взаимодействующего с альбумином, используют соединение общей формулы

25 где R — й(СНз)г: М(СгН5)г:

35 R1 — Н, СООН;

Вг — ОН, СООН, сыворотку крови разбавляют в 120-2000 раз, соединение добавляют в концентрации

2402/X — 3600/Х мкМ, где X — разведение

40 сыворотки, и измеряют интенсивность флуоресценции в области максимума свечения полученного раствора.

1681266

Таблица 2

*) Среднее +. ошибка среднего

Таблица 3

Стадии и о есса

Длительнасть, мин

0,5

0,3

0,2

2,0

0,5

3,5

0,5

0,5

30,0

Составитель А. Агуреев

Редактор Л, Веселовская Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор С. Шевкун

Заказ 3310 Тираж 390 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

По предлагаемому способу

1. Разведение сыворотки крови

2. Добавление ФС

3. Перемешивание

4. Измерение интенсивности флуоресценции относительно эталона

5. Оценка отклонения от нормы

Всего:

По способу-прототипу

1, Приготовление рабочего раствора красителя

2. Добавление раствора красителя к сыворотке

3. Инкубирование при 37 С

4. Добавление насыщенного раствора хлористого натрия

5. Перемешивание

6. Инкубирование при 37 С

7. Перемешивание

8. Фильтрование

9, Разведение

10, Измерение оптической плотности

11. Оценка отклонения от нормы

Всего:

0,3

0,2

1440,0

0,2

5,С

0,3

1,0

О.5

1478.5