Способ получения комплексного соединения платины (ii) с высокомолекулярной н-днк из селезенки крупного рогатого скота марки а, обладающего противоопухолевой активностью

Способ получения комплексного соединения платины (ii) с высокомолекулярной н-днк из селезенки крупного рогатого скота марки а, обладающего противоопухолевой активностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение касается платиновых комплексов , в частности получения комплекса платины (2+) с н-ДН К (высокомолекулярной, выделенной из селезенки крупного рогатого скота марки А), обладающего противоопухолевой активностью, что может быть использовано в фармакологической промышленности . Цель - повышение активности и снижение токсичности целевого комплекса. Синтез последнего ведут реакцией цис-дихлордиаминоплатины (2+) с н-дезоксирибонуклеиновой кислотой (выделенной из селезенки крупного рогатого скота марки А при их молярном соотношении 6:4 и 78 ± 0,5°С (13-30 мин) в среде воды. В этих условиях полученный комплекс в сравнении с исходной цис-дихлордиаминоплатиной (2+) способен эффективно тормозить рост опухоли и по степени выживаемости и меньшей токсичности превосходит указанное соединение платины (LDso 51,8 мг/кг, LDioo 84 мг/кг против 11,3 мг/кг и 18 мг/кг, а степень выживаемости на 10-е сутки 100% против 80%). 2 табл. Ё О 00 ел Ч Ј

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4437541/04 (22) 06.06.88 (46) 23.10.91. Бюл. ЬЬ 39 (71) Институт физической химии им. Л.В.Писаржевского и Киевский государственный институт усовершенствования врачей (72) И,И.Волченскова, Н.Н.Майданевич, Л.И.Бударин, Е.П.Трохименко, Л.В.Кейсевич и С.А,Шалимов (53) 547.259,2 (088.8) (56) Блохин Н.Н„Переводчиков Н.И. Химиотерапия опухолевых заболеваний. — М.: Медицина, 1987, с. 95-100, Вестник АМН СССР, 1986, М 12, с. 7989.

Авторское свидетельство СССР

М 2570960, кл. С 07 F15/00,,1979.

Машковский M.Ä. Лекарственные средства.— Медицина, 1985, т, 2, с. 172.

Координационные соединения металлов в медицине.— Киев: "Наукова Думка", 1986, с. 120 — 174.

Авторское свидетельство СССР

М 2581026, кл, С 07 F 15/00, 1979.

Изобретение относится к способу получения нового комплексного соединения платины, обладающего противоопухолевой активностью.

Цель изобретения — получение нового платиноорганического комплексного соединения с более высокой активностью и более. Ы 1685944 А1 (si)s С 07 F 15/00, А 61 К 31/295 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО СОЕДИНЕНИЯ ПЛАТИНЫ (II) С BblСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ Н-ДНК ИЗ

СЕЛЕЗЕНКИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

МАРКИ А, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение касается платиновых комплексов, в частности получения комплекса платины (2+) с н-ДНК(высокомолекулярной, выделенной из селезенки крупного рогатого скота марки А), обладающего противоопухолевой активностью, что может быть использовано в фармакологической ïðîмышленности. Цель — повышение активности и снижение токсичности целевого комплекса. Синтез последнего ведут реакцией цис-дихлордиаминоплатины (2+) с 3 н-дезоксирибонуклеиновой кислотой (выделенной из селезенки крупного рогатого скота марки А при их молярном соотношении

= 6:4 и 78 - 0,5 С (13-30 мин) в среде воды, В этих условиях полученный комплекс в сравнении с исходной цис-дихлордиаминоплатиной (2+) способен эффективно тор,мозить рост опухоли и по степени выживаемости и меньшей токсичности превосходит указанное соединение платины (LDso = 51,8 мг/кг, LD

11,3 мг/кг и 18 мг/кг, а степень выживаемо- Q сти на 10-е сутки 100% против 80%). 2 табл. низкой токсичностью по сравнению с известными противоопухолевыми препаратами.

Получают предлагаемое соединение PtДН К следующим образом, Предварительно нагретые до температуры плавления нативной Д Н К (н-ДН К) водные растворы цис-дихлородиамминпла1685944 тины (II) (ДДП) и дезоксирибонуклеиновой кислоты смешиван2т а молярном соотнОшении Рт:Р = 6:4 и смесь термостатируют при той же температуре до окончания реакции, 6 и цис"PtClz(N l 13)2 + н- "ДН К +

+ 12n Н20 +((РТСБ(МНЗ)(Н2О)2)6)п ДНК+

+ 6п NH4CI (I)

Температуру плавления н-ДНК определяют спектрофотометрическим методом.

Для приготовления раствора ДДП используют воду, нагретую в термостате. Раствор готовят непосредственно перед началом реакции. Препарат н-ДНК растворяют в воде при комнатной температуре и раствор нагревают а термостате.

Окончание реакции определя ат спектрофотометрически по достижени:.о

УФ-спектра соедин ения P t-ДН К, хара ктериЗУЕМОГО МаКСИМУМОМ ПОГЛОЩЕНИЯ Л„с =

=268,8 + 0,1 нм и максимальным малярным коэффициентОм экстинкции Е268,8

=10000 =Ь 100 л моль " см ", Для выделения прздлагаемого вещества как индивидуального соединения в твердом виде образующийся в ходе. реакции (I) аммоний хлористый и избьгток воды удаляЮТ ЛИОфиЛЬНОЙ СУШКОЙ.

Пример 1. На сгектрофотометре

Specord М40 с использованием держателя кюветы с блоком управления температурой и программы измерений, обеспечивающей линейное возрастание температуры, определяют Т.пл. н-ДНК. Регистрируют экстинкцию как функцию температуры в диапазоне

60 — 95 С при градиенте температуры 1 С в минуту, Применяемая для получения предлагаемого соединения н-ДНК имеет Т.пл, =

=78 С, По паспортнь;м дан-ibiM прибора погрешность 0,5 С, Раствор 675 мг цис-РтС4(ИНз)р в 375 мл воды, нагретый до 78 .+ 0,5 C (концентрация раствооа 1800 мкr/ìë), добавляют к раствору 500 мг н-ДН <, в 375 мл воды (концентрация раствора 1330 мкг/мл), предварительно .нагретому до 78 4- 0,5 С с равномерным повышением температуры со скоростью 1 С а минуту, как при плавлении

ДНК. Смесь реагентов с малярным соотношением Pt:Ð = 6:4 тщательно перемешивают и выдерживают в термостате а течение

15 мин, охлаждают до температуры окружающей среды.

Пример 2, Опыт повторяют, как в примере 1, только после охлаждения реаг,— ционную смесь подвергак>т лиофильнои сушке по методике используемой в производстве сухой плазмы крови, Лиофилизацию проводят следующим образом, Раствор соединения Рт-ДНК при постоянном араще5

Д(50

55 нии охлаждают до — 40 С а течение 40 мин, а затем выдерживают при этой температуре

12 ч, После этого температуру повышают до — 20 С и образец откачивают в течение 40 ч, нагревают до 40 С и снова откачивают 26 ч, Полученное после лиофильной сушки соединение Pt-ДНК в дальнейшем хранится в закрытой стеклянной посуде а холодильнике или на воздухе, Выход продукта Pt-ДНК соответствует теоретическому.

Для экспериментальной проверки предлагаемого способа получения соединения Pt-ДН К проведено 18 опытов, восемь из которых показали положительные результаты, В положительных опытах получен продукт с параметрами УФ-спектра, характерными для предлагаемого соединения.

Результаты опытов сведены в табл. 1, где представлены характеристики оолученных продуктов в зависимости от способа их получения, а именно: выбора концентрации исходных растворов ДДП и н-ДНК, молярных соотношений компонентов, времени и температуры проведения реакции, Из табл. 1 следует, что выбор исходных концентраций ДДП и н-ДНК в пределах ошибки опыта не влияет на характеристики полученного продукта. Максимальная концентрация ДДП ограничена ее растворимостью а воде, зта величина составляет 2523 мкг/мл при комнатной температуре, Минимальная концентрация ДДП ограничена минимально возможной для хорошей спектрофотометрической регистрации концентрацией н-ДНК, которая составляет 3,0 мкг/мл.

Отклонение от соотношения Pt:Ð = 6:4, как а сгорону избытка ДДП, так и в сторону избытка н-ДНК, не позволяет получить целевое соединение Р -ДНК с указанными параметрами УФ-спектра, Время, необходимое для окончания реакции, определяют из графика зависимости

Q;,хс УФ-спектра поглощения реакционной смеси ДДП с н-ДНК от времени термостатироаания при 78 " 0,5 С. Минимальное время, которое требуется для окончания реакции, равно времени достижения УФспектра смеси ДДП с н-ДНК, характеризуемого максимумом поглощения Я„акс = 268,8 нм и Еыа,з = 10000 л моль см . Это время составляет 12,5 мин. Увеличение времени термостатирования до 30 мин не алиЯЕТ На ПЯРЯМЕТРЫ Яиакс ПРОДУКТЗ рааКЦИИ. .Из табл. 1 также следует, что температура проведения реакции существенно влияет на такой параметр продукта реакции, как

Е и,a. Для получения предлагаемого соединения Р -ДНК термостатироаание реакци16859 14 онной смеси надо вести при 78,0 ч: 0,5ОС. так как только в указанном интервале температур достигается значение Е яя,8 =

=10000 ч= 100 л моль см

Приведенные данные позволяют заключить, что смешение предварительно нагретых до температуры плавления н-ДНК водных растворов ДДП и н-ДНК при молярном соотношении Pt: Р = 6:4 и термостатировании реакционной смеси при этой температуре в течение времени, необходимого для окончания реакции, позволяет получить соединение, характеризуемое формулой ((PtCI(NHg) (H20)2)g}n ДНК с описанными физико-химическими и биологическими свойствами. Отклонение от указанных параметров способа получения: соотношения реагентов, температуры и времени проведения реакции, не дает воэможности получить предлагаемое соединение с укаэанными характеристиками, Вновь синтезированное химическое соединение Pt-ДНК представляет собой биологически активное вещество, которое способно эффективно тормозить рост опухоли при меньшей токсичности, чем у

ДДП. Оно отличается от ДДП по виду токсичности, лимитирующей дозу препарата, по таким показателям биологической активности, как степень угнетения роста опухоли, не уступает ДДП. а по выживаемости животных превосходит ДДП.

Предлагаемое соединение Рт-ДНК как индивидуальный препарат представляетсобой мелкокристаллическое порошкообразное вещество желтого цвета, Оно устойчиво в водном растворе и на воздухе, способно в течение года храниться без изменения свойств при комнатной температуре и в холодильнике. его состав и строение установлены элементным анализом и физикохимическими исследованиями в водном растворе и в твердом виде.

Элементный анализ,мелкокристаллического образца подтверждает состав синтезированного целевого соединения Pt-ДНК.

Найдено, : Рт 38,46; CI 7,38; C 15,61; N

9,36; Н 3,09; P 4,67, Вычислено, : Р1 38,11; CI 6,94; С 15,25;

N 9,58; Н 2,97; Р 4,17, Рассчитанная исходя из молекулярной массы соединения Рс-ДНК и массы мономерной единицы этого полимера, имеющей эмпирическую формулу (РсС1(й Нз) (H20)2j5 С39 Н49 Оз2 й15 Р4 среднестатистическая величина и составляет 1900 90. Следовательно, в среднем примерно на 1900 нуклеотидных квартетов

ДНК, состоящих из пар аденин-тимин, rya5

55 нин-цитозин, приходится примерно

11400 платиносодержащих комплексов (Р С (Инз) (Н2О)2 .

УФ-спектр поглощения водного раствора Pt-ДНК имеет максимум поглощения при

268,8 нм, в то время как свободная н-ДНК в том же растворителе максимально поглощает свет при 258,0 нм. В расчете на 1 моль нуклеотида молярный коэффициент поглощения соединения Pt-ДНК Егяя,я =

=10000 л моль см, а свободной ДНК

Егия,о = 7000 л . моль см. Смещение

- 1 максимума поглощения в длинноволновую область на 10,8 нм у соединения Pt-ДНК по сравнению с нативной ДНК говорит о том, что ДНК в соединении находится в связанном состоянии благодаря образованию ковалентных связей между атомами платины (II) и донорными атомами азота оснований

ДНК. Повышение интенсивности поглощения, т.е. гиперхромный эффект, при этом составляет около 30%, что свидетельствует о сильных конформационных изменениях двойной спирали ДНК при присоединении металла.

Идентичность УФ-спектров поглощения соединения Pt-ДНК, полученного в растворе, и выделенного в индивидуальном состоянии, указывает на одинаковый химический состав вещества в растворе и в твердом виде. Об этом же свидетельствуют одинаковые результаты биологических испытаний вещества, приготовленного в растворе или выделенного в чистом виде, Однако после выделения препарата как индивидуального соединения его водорастворимость понижается. Так растворимость мелкокристаллического порошка Pt-ДНК при 20 С в воде составляет всего 0,0027;, что в 125 раз меньше максимально достижимой концентрации соединения в водном растворе. Поэтому при биологических испытаниях индивидуального соединения PtДНК оно вводилось животным в виде водной суспензии.

Водный раствор индивидуального соединения практически не проводит электрический ток, что говорит о незлектролитной природе Pt-ДНК.

Изменение в ИК-спектрах соединения

Pt-ДНК по сравнению со свободной ДНК указывают, что металл в соединении Pt-ДНК связывается не только с азотистыми основаниями ДНК, но и с атомами кислорода фосфатных групп. Полосы при 1090 и 1240 см 1 соответствуют валентным колебаниям фосфодиэфирных мостиков ДНК, полосы в области 1500 — 1700 см — валентным колебаниям групп С=С, C=N, С=О азотистых оснований, полосы в области 3100-3700 см валентным колебаниям групп C-H, N-H, О-Н, входящих в состав ДНК и молекул воды.

Кроме того, при 340 см наблюдается валентное колебание Рт-CI, а при 1320 см — деформационное колебание N-Н координированной молекулы ИНз.

По данным термического анализа твердый образец соединения Pt-ДНК при нагревании до 200 С теряет две молекулы воды на один атом платины. Высокая температура, необходимая для удаления молекул воды, свидетельствует о вхождении молекул воды во внутреннюю координационную сферу платины.

Спектры отражения твердого соединения Pt-ДН К имеют значения коэффициентов спектрального отражения й(,4) в экстремальных точках отличающиеся от значений

R для pic-PtCI2(NHa)2,. Для Pt-Днк к2 б,з =

=4,60; Вззз,з = 12,3; R4oo,б = 22,4; Кби,4 = 60,1, а для Цис-PtCI2(NHa)2 242,2 = 9,7 R26s,т =

=13,6; ЙЗЗЗ,З = 1G 4, 834Q =- 17,10; В414,6

=14,80; 6514,4 = 50,57, Спектры отражения подтверждают, что взаимодействие цисPtCI2(NHa)2 с н-ДНК сопровождается изменением состава координационной сферы платины за счет замещения одного иона хлора и одной молекулы аммиака фрагментами ДНК.

Данные элементного анализа, вискоэиметрии, кондуктометрии, УФ- L1 ИК-спектров поглощения и спектров отражения свидетельствуют о том, что синтезированное соединение дейс| вительно в ы со Ko м олекуля рное вещество — хлороамминодиакваплатина (II), связанная с дезоксирибунуклеиновой кислотой в соотношении РсР =- 6;4, формулы gPtCI (ЙНз) (Н2О)2)б}п ДНК. где o = 1900 + 90, Предлагаемое новое химическое соединение представляет собой высокомолекулярное платиносодержащее вещество, которое не менее эффективно, чем ДДП, тормозит рост опухал I, не менее токсично M повышаег процен.r выживаемости животныхх.

В табл. 2 представлены результаты исследований токсичности и противоопухолевой активности н-ДНК, ДДП и предлагаемого соединения, полученного в растворе и индивидуально.

Опыты проводили на мышах и крысах обоих полов, Токсичность изучали на группах животных из половозрелых нелинейных мышей весом 30,0 "= 2,0 г, прошедших карантин 20 дн. (в каждой группе было по 10 животных). Препараты вводили трехкратно внутрибрюшинно с интервалами в 2 ч по v,5

55 мл. Инъекции ДДП и н-ДНК детали в водном растворе, соединения Рт-ДНК вЂ” в виде водного раствора и водной суспензии, Суммарные дозы составляли для ДДП 8; 16 и 18 мг/кг, для ДНК 20; 40 и 60 мг/кг, а для соединения Pt-ДНК34; 68 и 84 мг/кг. Через

24 — 48 ч после введения препаратов отмечали количество погибших и выживших животных в каждой группе, Расчет токсической дозы (ЛДбо) проводили по известной методике. Летальную дозу, ЛД1оо, определяли экспериментально.

В результате проведенных опытов установлено, что для ДДП ЛДбо равно 11,3 мг/кг, ЛД оо равно 18 мг!кг, а для соединения PtДНК ЛДбо равно 51,8 мг/кг, ЛД1оо равно

84,0 мгlкг независимо от формы введения.

ДНК оказалась нетоксичной даже в дозе 60 мг/кг. Из сравнения приведенных величин следует, что токсичность соединения PtДНК в 4,6 раза ниже, чем токсичность ДДП.

Согласно гистологическим исследованиям гибель животных, получавших токсические дозы препаратов, обусловлена различными причинами, При введении ДДП наблюдается нефроз разной степени выраженности и дистрофия внутренних органов.

При введении соединения Р -ДНК в почках отмечены незначительные изменения: небольшой отек стромы, зернистая дистрофия канальцев, единичные мелкоочаговые кровоизлияния, но имеет место выраженная дисплаэия клеток эпителия кишечника. нарушение его регенераторной функции. сокращение количества митозов, Однако энтеротоксичность поддается коррекции в большей степени, чем нефротоксичность, Противоопухолевую активность каждого иэ препаратов оценивали из экспериментов, проведенных на пяти группах животных (в каждой группе по 10 животных), Белым беспородным крысам весом 150-200 г под кожу бедра трансплантировали 2 . 10— в — 2 10 xr åòîê перевивного штамма лейко1о за Швеца. Животные первой группы служили для контроля, вторая группа получала н-ДНК, а третья, четвертая и пятая группы— соответственно ДДП, и соединение Pt-ДНК, полученное в растворе и в чистом виде. Препараты вводили внутрибрюшинно трехкратно; первый раз — на 4-6 сут после трансплантации опухоли, т.е. в период логарифмической фазы ее роста; второй и третий раз — с интервалами 24-28 ч соответственно, Суммарная доза ДНК составила 18 мг/кг, ДДП 8,1 мг/кг, соединения Pt-ДНК 17 мг/кг.

Противоопухолевую активность оценивали по следующим покаээтВлям фиэиолО"

1685944

Таблица 1

Характеристика полученного и о кта

Характеристика способа

Опыт макс нм

Е2ы,e, л мОль х хсм

Время проведения реакции, мин

Температура проведения реакции,о

Молярное соотношение РсР

Концентрация исходов, мкг/мл ных аство н-ДНК

ДДП

9980

268,8

268,9

268,8

268,7

268,8

267,8

268,2

268,5

268,6

10

78

78

78

78

78

78

78

78

6:4

6:4

6:4

6:4

6:4

5:4

6:3

6:4

6:4

1330

27

1800 гической активности: по объему опухоли (V), степени угнетения роста опухоли (T/Ñ) и выживаемости животных на 10-е сутки (ВЖ).

Необходимые расчеты производили по. следующим формулам: 5

Ч (смз) = 4/3 л R3 R = где m>, mz и тз — три взаимно перпендикулярных измерения опухолевого узла;

Тl C (%) = o" 100, /кон гдеЧко и V« — объем опухоли в контрольной группе и у опытных животных, соответственно;

ВЖ (%) А 100

N где А — число живых животных на 10-е сутки после трансплантации опухоли;

N — число животных в данной группе.

Экспериментально найденные значе- 20 ния величин Ч, Т/С и ВЖ приведены в табл.

2, Анализ данных, представленных в табл, 2, показывает, что свободная ДНК, хотя и не токсична, но и не тормозит рост опухолей. 25

Препарат ДДП тормозит рост опухоли на

78% по сравнению с контролем. В то же время при его введении выживаемость животных на 10-е сутки падает на 20%. Соединение Pt-ДНК независимо от формы 30 введения тормозит рост опухоли по сравнению с нелечеными животными íà 84%, а по такому показателю, как выживаемость животных, превосходит ДДП на 20%.

Сравнительный анализ данных, приве- 35 денных в табл. 2, позволяет заключить, что предлагаемое соединение по уровню противоопухолевой активности, определяемому такими показателями, как объем опухоли и, 40 степень угнетения роста опухоли, не уступает ДДП. По такому показателю, как процент выживаемости животных превосходит ДДП.

Кроме того, предлагаемое соединение менее токсично, чем ДДП.

Таким образом, создание высокомолекулярного соединения на основе комплекса платины (И) и н-ДНК привело к получению вещества с ценными свойства: противоЪ опухолевой активностью при низкой токсичности. По этим свойствам предлагаемое соединение выгодно отличается от используемого в клинике лекарственного препарата ДДП, превосходя или будучи сопоставимо с ним по показателям физиологической активности.

Такие свойства делают предлагаемое соединение перспективным в качестве Основы для создания препаратов, эффективHblx для лечения злокачественных опухолей.

Формула изобретения

Способ получения комплексного соединения платины (И) с высокомолекулярной н-ДНК из селезенки крупного рогатого скота марки А, обладающего противоопухолевой активностью, взаимодействием соединения платины с органическим лигандом в водной среде при нагревании, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью получения соединения с более высокой активностью и более низкой токсичностью, в качестве соединения платины используют цис-дихлородиаминоплатину (I I), а в качестве органического лиганда — н-дезоксирибонуклеиновую кислоту, выделенную из селезенки крупного рогатого скота, марки А при их молярном соотношении 6:4 и процесс ведут при (78,0 0,5) С в течение 13 — 30 мин.

1685944

Продолжение табл. 1

Характерист

Таблица 2

100

Редактор Н.Яцала

Заказ 3574 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 тра тво о! группе тных (к ль) 15,0 40

Составитель О. Смирнова

Техред M,Моргентал Корректор M.Шароши,,