Способ получения мутеинов гирудина

Способ получения мутеинов гирудина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при создании фармацевтических препаратов. Цель изобретения - повышение сродства мутеинов к тромбину и упрощение способа. Для этого с помощью фрагмента ДНК, в котором кодон для аминокислоты в 47 позиции природной формы гирудина заменен на кодон для лизина или аргинина, конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК pTG197 или pTG1980 и трансформируют ими реципиентный штамм дрожжей S cerevlsial TGVI sp.4. В результате получают штаммы, продуцирующие мутантныи гирудин. 3 абл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 и 15/15

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Ь (21) 4203831/13 (22) 30.11.87 (31) 86 16723 (32) 01.12.86 (33) FR (46) 23;10.91. Бюл. f4 39 (71) Трансжен С.А. (FR) (72) Майкл Куртни (GB), Эрик Дегриз (BE),, Жерар Луазон (FR) и Ив Лемуань (BE) (53) 575.224.2.577,2(048)(088.8) (56) Заявка М 2562088, кл. С 12 и 15/00, 1985. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТЕИНОВ ГИРУДИНА

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при создании фармацевтических композиций.

Цель изобретения — повышение сродства мутеинов к тромбину и упрощение способа.

Пример 1. Конструкции различных вариантов гирудина-2 (Г2) мутагенезом In

vitro.

Для осуществления направленного мутагенеза In yltro фрагмент ДН К клонируют в репликативную форму фага, геном рекомбинантного фага выделяют и подвергают гибридизации с синтетическим олигонуклеотидом, который несет мутированную последовательность. Этот олигонуклеотид служит затравкой синтеза комплементарной нити, Полученную таким. образом двунитевую ДНК используют для трансформации бактерий, которые будут продуцировать фаг, несущий искомую мутацию.

Плазмида pTG720 представляет вектор экспрессий гирудина в Е.coll, Плазмиду

<„SU „„1687032 АЗ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано при создании фармацевтических препаратов. Цель изобретения — повышение сродства мутеинов к тромбину и упрощение способа. Для этого с помощью фрагмента ДНК, в котором кодон для аминокислоты в 47 позиции природной формы гирудина заменен на кодон для лизина или аргинина, конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК pTG197 или

pTG1980 и трансформируют ими реципиентный штамм дрожжей S,cerevisial TGÈ sp.4.

В результате получают штаммы, продуцирующие мутантный гирудин. 3 =:àáë. рТ6730 получают из pTG720 путем присоединения сайта EcoR1 за кодирующей последовательностью гирудина.

Фрагмент Cia1-ЕсоР1 покрывает всю область, кодирующую гирудин, без несколь1 ких 5 -концевых кодонов. Этот фрагмент

Cla1-EcoR1 клонируют между сайтами Асс1 и EcoR1 фага М13, называемого М13Т 131.

Фаг, происходящий из M13TG131 и содержащий последовательность гирудина, назван M13TG1919.

Синтезируют три олигонуклеотида, каждый из которых способен составить пару с последовательностью 5 — ГТАЦАЦЦГААЦНЦТГАААГ-3 в M13TG1919, кроме ее центральной области, которая соответствует желаемой мутации. Посл едовател ь ности этих нуклеотидов являются следующими:

TG435 51 — ЦТТТЦАГГГТГЦГТТГТАЦ вЂ” 3,.

TG436 5 -ЦТТТЦАГГТТТЦГГТГТАЦ вЂ” 3, TG437 5 -ЦТТТЦАГТГЦГЦГТТГТАЦ-3 .

Эти олигонуклеотиды предназначены для осуществления замещения кодона ААЦ

1687032 (асн) в MIÇÒ1919 на ЦАЦ(гис) или ААА(лиз), или ЦГЦ(арг) соответственно, 120 пмоль каждого олигонуклеотида фосфорилируют в 100 мкл реакционной среды и примерно 20 пмоль фосфорилировенного олигонуклеотида гибридиэуют с 1 смоль однонитевой ДНК фага М13Т1919.

После гибридизации смеси обрабатыва. ют полимеразой Кленова и лигазой фага 14 и используют для трансфекции штамма

E.coil 71/18 (пил ). Отбирают клетки, которые образуют ионы медленного роста, колонии пересеиввют на полную среду, переносят на бумагу 540 для отбора кле;ок, имеющих мутирован ные фаги, Отбор осуществляют гибридизацией с олигонуклеотидом — затравкой, Таким образом получают три новых фага, имеющих искомую мутированную псследовательность:

M13TG1921 (асн - - - арг), M13TG1924 (асн —: гис) и Ч13ТО1925 (асн - .лиз).

С другой стороны повторяют тот же тип эксперимента с олигонуклеотидом Т434 последовательности 5 -АТТГТААЦТЦТТСТТСТà — 3 . Зтот олигонуклеотид гибридизуют с последовательностью 5—

ЦАГААГААТАТТТАЦААТ, локализованной в области 3 последовательности, кодирую1 щей Г2 с неспаренным триплетом, предназначенным для замены кодона ТАТ(тир ) на ба)

ГАГ(глу), Таким образом получают мутированный фаг, соответствующий М13ТО1922

63

Пример 2.:-. амещение фрагмента

Pstl-Н!пб ill и (0,6 т.п,о.) в pTG1828 на мутированный фрагмент.

Плаэмида pTG1828 несет последовательность, кодирующую гиридин, которой предшествует последовательность гена полового ферромона-альфа дрожжей MFL все это под контроль промотора РОК, Последовательность УН и гирудина проходят стадию синтеза и созревания в дрожжах, таким образом продуцированный гирудин находится в культуральной среде.

Зту плазмиду используют для получения последовательностей мутированного гирудина вместо нативного гирудина.

Гидролиз рестриктазами Pstl u Hindlll

PTG1828 высвобождает пять фрагментов размером примерно 3,8; 1,9; 1,5; I,I и 3,6 т,п.о. соответственно. Последний фрагмент содержит только сдин сайт Асс1 и один сайт

EcoR1. Область, ограниченная этими двумя сайтами содержит вс о последовательность гирудина без нескольких 5 -концевых кодонов. Фрагмент Hlndlll — Pst 0,6 т.п.о. вставлен между сайтами l- 1М И и PstI вектора который не имее1 ни сайта Есой1, ни сайта

Асс1, Таким образом плаэмида pTGI960 име ет один сайт Асс 1 и один сайт EcoRI, лока лизованные в начале и конце последовательности гирудина, Большой фрагмент ДНК, иэ последовательности гирудина, очищают в геле и смешивают с продуктом переваривания AccI—

EcoRI репликативной формы каждого из мутированных фагов, описанных в примере 1, чтобы реконструировать комбинацию пропро-гирудин с новыми вариантами Г2, полученными направленной мутацией.

Отобоаны четыре новых плазмида: pTG1963 (асн - арг), pTG1964 (тир - глу), рТ1965

15 (асн -> гис) и рТО1966(асн лиэ), которые отличаются от pTG1960 только мутированными кодонами, Зти последовательности, несущие мутированные кодоны, могут быть выделены в

20 виде фрагментов Pstl — Hlndlll и повторно клонированы в вектор pTG1826 вместо исходного фрагмента Pst1 — Hindi li.

Таким образом получают четыре новых плазмиды: pTG1977 (асн — арг), pTG1978

25 (тир -- глу), pTG1979 (асн -> гис) и pTG1980 (асн4" --- лиэ), которые отличаются от

pTG1828, описанной выше, только мутацияПример 3. Клетки дрожжей TGVlsp4

30 трансформируют с помощью ДНК pTG1977, pTG1978, рТО1979,.р TG1980. Трансформанты получают в каждом случае и получают четыре штамма ТОИзр4 pTG1977, ТОЧ!зр4

pTG1978, ТОИзр4 pTG1979 и TGVlsp4

35 pTG1980, Сравнивают продуктивность по гирудину этих четырех штаммов и ТОН!зр4 рТО 1828.

Засевают 20 мл культуры, после 48 ч выращивания при 30 С клетки центрифуги40 руют (5000 об/мин, 5 мин) и анализируют надосадочные жидкости.

Культуру TGVIsp4 pTG881 (плаэмида, не несущая последовательности, кодирующей

Г2) используют в качестве контроля, 45 Активность надосадочных жидкостей оценена по их ингибирующему действию на активность тромбина (протеолитическая активность на синтетический субстрат).

Установлено, что ингибирующее дейст50 вие производимое вариантами арг" и лиз 7, не меньше действия нативного Г2.

47

Варианты глу и гис обладают несколько меньшим ингибирующим эффектом.

Пример 4. Ингибирование действия

55 тромбина.

Используют варианты гирудина, очищенного до 95, и чистый человеческий тромбин, имеющий процент активности, измеренный титрованием активных центров, аавный 92 g>. Концентрации тромбина оди1687032

Антитромбическую активность двух вариантов гирудина и стандартного гепарина изучают на модели Весслера на кроликах и на крысах с тромбопластином как тромбогенным агентом и на модели стаза у кролика. Лекарство вводят кролику внутривенно путем непрерывной перфуэии большого объема.

=9 наковы во всех измерениях и равны 5,5 10

M. Реакцию проводят в буфере состава: 0,05

М натрий, рН 7,9, 0,18 M KCI и 0,1 ПЭГ при

37 С. В течение 2 мин проводят преинкубацию для тромбина и гирудина, потом реак- 5 цию запускают в ход с субстратом.

В табл, 1 приведены величины, определенного экспериментально, количества гирудина, необходимого для ингибирования

957 такого же количества человеческого 10 тромбина (5,5 10 9 М).

Таким образом, ясно, что требуется примерно в четыре оаза меньше гирудина Г2 — . арг и Г2 — лиз, чтобы ингибировать то же

47 4 количество человеческого тромбина, в срав- 15 нении с гирудином Г2, Следовательно, предлагаемые варианты обладают значительно улучшенными ингибирующими свойствами по отношению к тромбину. 20

Пример 5. Фармакологическое изучение двух вариантов гиоудина — рекомбинантных Г2 и Г2 — Лиз в сравнении со а стандартным гепарином.

Цель изучения, 25

Оценить два варианта рекомбинантного гирудина и сравнить их антитромбическую эффективность со стандартным гепарином.

Экспериментальные условия. 30

Антитромбическую специфическую активность двух рекомбинантных гирудинов в физиологической сыворотке определяют по ингибированию протеолитической активности тромбина на хромозные. 35

Антикоагулирующую активность двух гирудинов сравнивают in vitro s плазме крысы и кролика по продолжительности тромбинового времени и эффекту анти-Ила хромогенным методом. 40

Кинетику плаэматического исчезновения гирудина после внутренней инъекции большого объема наблюдают путем измерения влияния анти-Ила с помощью тромбинового времени и хромогенным методом с 45 помощью калибровочных кривых.

Полученные плаэматические концентрации после 30 мин непрерывной внутривенной перфуэии у кролика определяют по тем же методикам. 50

Модель Весслера на кролике.

Используют самцов новозеландских кроликов, весящих 2,5-3 кг. После анестезии с помощью внутривенной инъекции пентобарбитала натрия (30 мг/кг) каннилируют левую сонную артерию и изолируют две яремных вены, накладывают две слабые лигатуры на каждую из них на расстоянии 2,5 см одна от другой. Затем кролики получают или физиологическую сыворотку или раство- ры гирудина или гепарина непрерывной перфузией в течение 30 мин при расходе 2,5 мл/ч. За 2 мин до конца перфузии берут пробы артериальной крови, чтобы определить содержание антикоагулянтов в плазме.

За 1 мин до конца перфузии делают инъекцию человеческого стандартизованного тромбопластина в дозе 600 нг/кг точно в течение 30 с в аорту через сонную артерию, Спустя 30 с перфузию прекращают и образуют застой крови, сжимая лигатуры двух сегментов вен в течение 15 мин, Вскрывают яремные вены и извлекают тромбы, промывают в физиологической сыворотке и взвешивают после тампонирования на фильтровальной бумаге.

Модель Весслера на крысе.

Используют самцов крыс Сираг-Доулей (СД вЂ” СОВ) весом примерно 300 г. После анестезии пентобарбиталом натрия интраперитонеальным путем (30 мг!кг) и срединной лапаротомии высвобождают нижнюю полую вену на 1 см из почечного перекрестья.

Накладывают две гибкие лигатуры на расстоянии 1 см, Испытуемые образцы, разбавленные физиологической сывороткой, вводят внутривенно одним объемом дозой 1 мл/кг за 5 мин 40 с или за 1 мин (гепарин) до реализа-. ции венозного стаза. За 40 с до этого стаза вводят тромбогенный агент в дозе 25 мг/мл/кг в вену пениса в течение 30 мин.

Через 10 с после окончания инъекции созда- ют стаз, зажимая обе лигатуры, сначала проксимальную, затем дистальную. Состояние стаэа выдерживают в течение 10 мин, потом тромб извлекают, погружают в 0,38$-ный раствор цитрата, сушат на бумаге досуха и взвешивают на следующий день после сушки втечение 1 ч при 50 С.

Модель тромбоза для застоя крови у кролика.

Используют самцов новозеландских кроликов весом 2,5 — 3 кг. После анестезии путем внутривенного вливания 30 мг/кг пентобарбитала натрия канюлируют левую сонную артерию и изолируют две яремные вены, на-каждую иэ них накладывают две слабые лигатуры на расстоянии 2,5 см друг от друга. Затем кроликам вводят или физи10

50 алогическую сыворотку, или растворы гирудина, или гепарина непрерывной перфузией в течение 30 мин при расходе 2,5 мл/ч.

За 2 мин до окончания перфузии делают отборы артериальной крови, чтобы определить плазматическое содержание антикоагулянтов. После прекращения перфуэии создают состояние стаза, зажимая четыре, лигатуры (сначала проксимальную, затем дистальную). Стаз coxpàíÿàT 2 ч, потом вскрывают яремные вены и извлекаюттромбы, промывают в физиологической сыворотке и взвешивают после тампонирования на бумажном фильтре.

Результаты.

Для каждого препарата маточного раствора с концентрацией 1 мг/кг специфическая антитромбиновая активность обоих вариантов гирудина по отношению к человеческому и бычьему тромбинам приведены в табл.2.

Специфическая антитромбиновая активность варианта гирудина Г2 составляет

+/-15000 АТЕ/мг и для варианта Г2-Лиз

47 составляет +/-19000 АТЕ/мг. Эти специфические активности превышают ожидаемые.

Специфическая активность идентична для человеческого и бычьего тромбинов.

Антикоагулирующая активность в плазме крысы и кролика эквивалентна при малых концентрациях обоих гирудинов.

Активность варианта Г2-Лиз значительно

4т выше при более высоких концентрациях.

Количество остаточного тромбина в плазме, определенное с помощью хромогенного субстрата, сравнивают после добавления обоих гирудинов до 60 АТЕ/мл, Для лучшей нейтрализации следов остаточного тромбиl на вариант Г2-Лиз 17 является более эффективным, Это выражено в оазнице значений

К.

Кинетика исчезновения обоих гируди нов в плазме после внутривенной инъекции большого объема оказывается сравнимой при определении ее хромогенным методом, но несколько различается три определения ее по тромбиновому времени (габл.3).

Гирудины исчезают согласно двум экспонентам. На первой фазе (распределение) с ериодом полураспада, равным 3 мин„исходное количество за 5 мин снижается до

60)(для обоих гирудинов, На второй фазе период полураспада равен 16 мин, для

Г2-Лиэ и 28 мин для Г2, если расчет ведут с учетом тромбинового времени, и 28 и 30 мин соответственно, если используют хромогенный метод. Стандартный гепарин исчезает согласно одной экспоненциальной фазе, период полураспада равен 9 мин.

Концентрации двух вариантов гирудина в плазме, полученные после 30 мин непрерывной перфуэии внутривенно кролику, находятся в прямой зависимости от перфузируемых доз (см. табл,4), Антитромбиновые эффекты.

На основании фармакологических анализов видно, что при непрерывной перфузии кролику ваоиант рекомбинантного гирудина Г2-Лиз имеет более высокую антитромбиновую активность, чем Г2 и гепарин, Фармакокинетика обоих вариантов гирудина является идентичной.

Исследования показывают, что геморрагическая опасность у кроликов или время кровотечения у крыс, получивших Г2-Лиз ниже, чем у получивших стандартный гепарин, для каждого вида животного при эквивалентных дозах для модели тромбоза.

Таким образом, изобретение позволяет получить рекомбинантные мутанты гирудина, обладающие высоким фармакологическим эффектом.

Формула изобретения

Способ получения мутеинов гирудина, предусматривающий получение фрагмента

ДНК, кодирующего гирудин с помощью сайтспецифического мутагенеэа, конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей мутеины гирудина„путем клонирования фрагмента в вектор, трасформацию полученной ДНК штаммов-реципиентов, культивирование трансформированных штаммов, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения сродства мутеинов к тромбину и упрощения способа, получают фрагмент ДНК, в, котором кодон для аминокислоты в 47 позиции природной формы HU2 заменен на кодон для Lys или Arg, конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК, pTG197 или pTG1980, а в качестве реципиента используют Sachomicus

cerevisiae TGVI sр4, 10

1687032

Таблица 1

Таблица2

Таблица 3

*ТТ вЂ” тромбиновое время.

**SC — хромогенный субстрат

Таблица 4

Составитель Т.Забойкина

Техред М,Моргентал Корректор М.Максимишинец

Редактор Е.Папп

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул, Гагарина, 101

Заказ 3612 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5