Способ получения солеустойчивых клеточных линий люцерны

Способ получения солеустойчивых клеточных линий люцерны

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и может использоваться в клеточной селекции люцерны при создании нового исходного материала. Целью изобретения является повышение солеустойчивости растений. Способ состоит в том, что из листьев получают каллус, из которого получают суспензию клеток, которую в течение 3-4 ч облучают ультрафиолетом , затем промывают 3-4 раза стерильной питательной средой и переносят на селективную питательную среду, в качестве селективного агента используют смесь хлорида и сульфата натрия в количестве 1,25-1,67% при соотношении солей 1:1 по осмотическому давлению. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4727751/13 (22) 07.08.89 (46) 30,10,91. Бюл. ¹ 40 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт кормов им.В.Р,Вильямса (72) В.В.Мазин и Б.А.Тургунбаева (53) 578.085.23 (088.8) (56) Croughan Т.P. et.al. Selection of a NaCI

tolerant line of cultused alfalfa cells.Crop.Sci, 1978, ч.б, ¹ 18; р.959, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ ЛЮЦЕРНЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и может испольИзобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и может быть использовано в клеточной селекции при создании нового исходного материала, в частности в клеточной селекции люцерны.

Цель изобретения — повышение солеустойчивости растений.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве исходного материала используют среднеазиатские сорта люцерны.

В качестве эксплантата берут листья, растения предварительно стерилизуют в 0,1 ном растворе диоцида, Каллусную культуру получают на среде Гамборга В5, содержащей дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4—

Д) 8 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК)

0,5 мг/л, кинетин (КИН) 8 мг/л. Клеточную суспензию получают на жидкой питательной среде с фитогормонами 0,5 мг/л 2,4-Д и

0,5 мг/л КИН. Полученную клеточную суспенэию подвергают ультрафиолетовому облучению, которое проводят в асептических

„„5Ц „„1687139 А1

Целью изобретения является повышение солеустойчивости растений. Способ состоит в том, что из листьев получают каллус, из которого получают суспензию клеток, которую в течение 3 — 4 ч облучают ультрафиолетом, затем промывают 3 — 4 раза стерильной питательной средой и переносят на селективную питательную среду, в качестве селективного агента используют смесь хлорида и сульфата натрйя в количестве

1,25 — 1,67 при соотношении солей 1:1 по осмотическому давлению, 4 табл, условиях в чашках Петри на расстоянии 1520 см от источника облучения с длиной волны 304-410 нм. После облучения клетки промывают 3 — 4 раза питательной средой при рН 5,8 с последующим определением их жизне- и эмбриогенной способности, Клеточную суспензию с жизнеспособностью выше 30 переносят на селективную питательную среду, содержащую комплекс солей. Суспензию, выдерживающую высокие концентрации комплекса солей, культивируют 3-4 пассажа по 25-30 дн, после чего получают эмбриоиды и растения-регенеранты.

Способ иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Для мутагенного воздействия УФ-облучения используют суспензии, содержащие не менее 800 тыс.клеток в 1 мл с жизнеспособностью 85-95 Если в суспенэии имеются клеточные агрегаты, то их предварительно отфильтровывают через сетку для получения гомогенных клеточных

1687139

Таблица!

Время об- Количество лучени, живых клеч ток в 1 мч

Х от контроля ичество Х от конт86 4

78 г,!

6453,9

30+2,6

15215, 6

76„4,1

38+2,5

Эмбриогеннан ткань

95,5

81,О

71,О

ЗЗ,0

113

56

Кдиннчные клетки

90+1, 6

1З4 З,5

1ОО

100

Контроль

Та блиц а 2 -: Т

Ко нцентПри обработке

Бее обработки УФ

ПрВ ме! содержание соли (рация солей NaC1, Na Ю...Z

Х NaC1

Ns S0

Индекс аиэнесл роста 1 собность

Инде рост иа неспообность, Х атм.

L. т

2, 9 М,5 78

0,35:0,70 3,3 0,4 70

0,49:0,97 3,4 0,3 81

0,70:1,38 1,0 0,6 39

7,0т0,5

Некров

78

ЗН

24

Некроа

Ко нтооль

1,46 г

6,5

11 суспензий, которые разливают по 15 мл в чашки Петри в условиях асептики. Промывку повторяют 3 — 4 раза, После этого определяют жизнеспособность и эмбриогенную способность (табл.1). 5

Пример 2. После облучения промытые клетки переносят в селективную питательную среду Гамборга 88, содержащую смесь солей сульфата и хлорида натрия (табл,2).

Как видно из табл,2, ультрафиолетовые 10 лучи повышают жизнеспособность клеток люцерны, Наиболее высокий индекс роста и жизнеспособность на 25-е сутки культивирования наблюдают при облучении и концентрации солей 1,5% что в 2,1 раза выше, 15 чем у необлученных клеток, а при концентрации соли 1 индекс роста и жизнеспособность практически не отличаются от контроля. При концентрации солей 2% жизненная функция клеток ингибируется. Та- 20 ким образом. ультрафиолетовое облучение увеличивает выход клеток, устойчивых к действию комплекса солей, fl р и м е р 3. Для доказательства интервальных значений приводится табл,3, где 25 ингибирование жизненных функций культуры ткани люцерны наблюдается при соотношении солей от 0,42:0,83 до 0,56: 1I,11 или от

1,25 до 1,67%.

Пример 4, Облученные ультрафиоле- 30 товыми лучами клетки промывают в стерильной питательной среде в условиях асептики. Действие кратности промывок в стерильной питательной среде при рН 5,86,0 на плотность и жизнеспособность кле- 35 ток люцерны иллюстрируется в табл,4, из которой видно, что на 6 день после 3— - 4-кратной промывки наблюдается наиболее высокая жизнеспособность. При увеличении числа промывок жизнеспособность изменяется слабо.

После 3-4 пассажей на селективной среде отбирают устойчивые к смеси солей клеточные линии люцерны, получают растения-регенеранты, 40% которых выдерживают сильное засоление в природных почвенных образцах с преобладающим сульфатно-хлоридным типом засоления, Получены семена от растений-регенерантов в условиях комплексного засоления.

Формула изобретения

Способ получения солеустойчивых клеточных линий люцерны, включающий получение каллуса из эксплантатов, получение из каллуса суспензии клеток и перенос ее на селективную питательную среду с последующим получением растений-регенерантов, отличающийся тем, что, с Целью повышения солеустойчивости растений, перед переносом на селективную питательную среду на суспензию клеток воздействуют ультрафиолетовым облучением в течение 3 — 4 ч, после чего облученные клетки промывают 3 — 4 раза стерильной питательной средой с рН 5,8 — 6,0 в условиях асептики и в качестве селективного агента используют смесь солей сульфата и хлорида натрия в концентрации 1,25 — 1,67% при соотношении солей 1:1 по осмотическому давлению, 1687139

Та блица 3

Концентрация

Содержание соли

7 от контроля

Индекс роста солей NaC1 и Ма 80,7 атм z

Таблица 4

Без промывки

Промывка

Срок, сут

Плотность шт (мг) жизнеспособность, Ж

1-2 раза 3-4 раза

5-6 раз 5.

241, 1/30, 2

240, 6/23, О

243, О/16,5

243,6/единичные клетки

241,3/33, О

240,6/35,0

249,2/33,2

242,2/32,8

245,4/33,2

259,8/45,8

268,6/55,4

277,2/57,2

246, 6/33, О

260,4/45,6

263,2/55,8

278,2/59,0

° 3

Составитель В.Демкин

Редактор М.Недолуженко Техред М.Моргентал Ко ектор Л.Бескид

Тираж Подписное

Заказ 3655 етениям и открытиям при ГКНТ СССР

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и откры

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат Пате

"Патент"„г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Контроль

0,21

0,42

0,63

0,83

1,05

1,25

1,46

1,67

1,88

2,09

2

4

6

8

10

0,07:0,14

0,14: 0,28

0,21: 0,55

0,28; 0,55

Оэ 35: Оэ 55

0,42: 0,83

0,49: 0,97

0,56:1,11

0,63:1,25

0,70:1,39

7, О+0,5

Некроз

Некроз

62,8

74,3

78,5

52,8

40,0

21,4

22,8

22,2