Штамм вируса гепатита ни-а, ни-в для приготовления специфических диагностических препаратов

Штамм вируса гепатита ни-а, ни-в для приготовления специфических диагностических препаратов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к вирусологии и касается получения диагностических препаратов . Цель изобретения - новый штамм вируса эпидемического гепатита ни-А, ни- В, способного вызывать соответствующую инфекцию у обезьян, сопровождающуюся выделением вируса, используемого для специфической диагностики гепатита ни-А, ни- В у людей. Штамм вируса эпидемического (энтерально передающегося) гепатита ни-А, ни-В Ош-2599 выделен из фекальной пробы больного, взятой за день до появления желтухи , и депонирован в Государственной коллекции вирусов под №831. При заражении яванских макак штамм Ош-2599 вызывает развитие инфекции со специфическим поражением печени, выделением вируса с фекалиями, накоплением вируса в печени и желчи, появлением антител к вирусу эпидемического гепатита ни-А, ни-В. Вируссодержащие материалы и сыворотки, полученные от зараженных обезьян, используются для осуществления специфической диагностики эпидемического гепатита ни-А, ни-В. 1 табл. сл С

COI03 СОВЕТСКИХ

C0I ИАЛИСТ ИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (SI)s С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4767365/13 (22) 06.12.89 (46) 30.10,91. Бюл. N. 40 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (72) M.Ñ. Балаян, А.Г.Анджапаридзе, В.Ф.Полещук и Н,А.Замятина (53) 576.8.094,29 (088.8) (56) Kong D.Ñ. et al. Epidemic and endemic

hepatitis!и India. evidence for а поп-А, non-, В hepatitis virus aetiology. — Lancet И: 876—

879 (1980).

Balayan М.S, et al, Evidence for à virus in

Non — А, Non — В Hepatitis Transmitted via the

Fecal — Oral Route. — Intervlrology, 20 23 — 31 (1 983). (54) ШТАММ ВИРУСА ГЕПАТИТА ни-А, ни-В

ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к вирусологии и касается получения диагностических препаратов, Цель изобретения — новый штамм

Изобретение относится к вирусологии и касается получения диагностических препаратов.

Цель изобретения — выделение нового штамма вируса эпидемического гепатита ни-А, ни-В, способного вызывать соответствующую инфекцию у обезьян, сопровождающуюся выделением вируса, используемого для специфической диагностики гепатита ни-А, ни-B у людей.

Штамм вируса эпидемического гепатита ни-А, ни-В Ош-2599 выделен из фекальной пробы больного, взятой за день до появления желтухи, Штамм депонирован в

„„5U „„1687612 А1 вируса эпидемического гепатита ни-А; ниВ, способного вызывать соответствующую инфекцию у обезьян, сопровождающуюся выделением вируса, используемого для специфической диагностики гепатита ни-А, ниВ у людей. Штамм вируса эпидемического (знтерально передающегося) гепатита ни-А, ни-В Ош-2599 выделен из фекальной пробы больного, взятой за день до появления желтухи, и депонирован в Государственной коллекции вирусов под 1чг 831. При заражении яванских макак штамм Ош-2599 вызывает развитие инфекции со специфическим поражением печени, выделением вируса с фекалиями, накоплением вируса в печени и желчи, появлением антител к вирусу эпидемического гепатита ни-А, ни-B. Вируссодержащие материалы и сыворотки, полученные от зараженных обезьян, используются для осуществления специфической диагностики эпидемического гепатита ни-А, ни-В, 1 табл, Государственной коллекции вирусов под М

831 и обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства.

Фекальная проба в виде экстракта была исследована методом иммуноэлектронной микроскопии с использованием сывороток добровольца, зараженного и перенесшего эпидемический гепатит ни-А, ни-В; реконвалесцентной сыворотки, содержащей антитела к вирусу ни-А, ни-В и взятой до заражения и не содержащей антител к данному вирусу. В исследуемой пробе были обнаружены вирусные частицы, реагирующие с реконвалесцентной сывороткой и не

1687612 реагирующие с сывороткой, взятой до заражения, Вирусные частицы представляли собой сферические образования размером 27 — 28 нм, в препаратах они обнаруживались в виде полных и пустых форм. В присутствии реконвалесцентной сыворотки эти частицы выявлялись в вице скоплений или единичных структур, покрытых характерным венчиком антител, При исследовании 2%-ной фекальной суспензии концентрация частиц составляла 1000 на 5 ячеек электронно-микроскопической сеточки.

Биофизические свойства. Для изучения биофизических свойств выделенного штамма, названного Ош-2599, были приготовлены очищенные двумя разными способами экстракты, Первый способ очистки включал два этапа центрифугирования — при 3000 об/мин и 10000 об/моин, Второй способ очистки включал помимо центрифугирования трехкратное замораживание-оттаивание при температурах — 70 С/37 С, При иммуноэлектронно-микроскопическом исследовании очищенных первым способом экстрактов вирус гепатита ни-А, ни-В выявлен в количестве 1000 частиц на 5 ячеек сеточки, а при исследовании экстрактов, очищенных вторым способом, выявлены только единичные частицы вируса.

Исходя из этих результатов, далее для изучения плавучей плотности выделенного вируса в градиентах хлорида цезия были использованы только экстракты, очищенные первым способом, При проведении анализа фракций (с помощью метода иммуноэлектрон ной микроскопии) различных градиентов в хлориде цезия не удалось выявить вирусспецифические структуры.

Полученные данные показывают, что выделенный вирус разрушается в результате замораживания-оттаивания, а также в результате воздействия концентрацией солей хлорида цезия, что характерно для вируса эпидемического гепатита ни-А, ни-В, Далее были проведены опыты по определению коэффициента седиментации данного вируса в сахарозе, Результаты показали, что основная масса частиц вируса выявлялась во фракции, соответствующей коэффициенту седиментации 183 в.

Антигенные свойства, Вируссодержащие фракции далее объединяют и снова центрифугируют в 30%-ной сахарозе для осаждения частиц вируса, Полученный осадок ресуспендирован в фосфатно-солевом буфере, и вируссодержащая суспензия исследована методом иммуноэлектронной микроскопии в шифрованном опыте с различными сыворотками. Прове10

20

30

35 лением вируса с фекалиями и накоплением

55 денные исследования показывают, что вирусоподобные структуры размером 27 нм реагируют с сыворотками, содержащими антитела к вирусу эпидемического (фекально-орального) гепатита ни-А, ни-В, и выявляются с хорошим венчиком антител, Сыворотки, не содержащие антитела к указанному вирусу, не реагируют с этими структурами, Полученные данные свидетельствуют о том, что при описанной очистке и концентрировании в сахарозе частицы вируса выделенного штамма сохраняют свои морфологические и антигенные характеристики, присущие вирусу эпидемического гепатита ни-А, ни-В, Антигенные свойства штамма Ош-2599 были исследованы с помощью реконвалесцентных сывороток, полученных из разных стран мира (Индия, Бирма, Непал, Франция, Афганистан). Исследование показывает антигенную близость выделенного штамма вирусу гепатита ни-А, ни-В, распространенному в данных странах.

Штамм Ош-2599 вируса гепатита ни-А, ни-В в виде 10 -ного фекального экстракта, обработанного антибиотиками, был введен внутривенно яванской макаке, После этого у обезьяны развивалась типичная инфекция, и вирус далее был пассирован на яванских макаках.

При заражении яванских макак штамм

Ош-2599 вызывает развитие инфекции со специфическим поражением печени, выдевируса в желчи и печени, Вирус выделяется с фекалиями и накапливается в желчи в количестве, достаточном для получения вирусного антигена и осуществления специфической диагностики эпидемического гепатита ни-А, ни-В, Ниже описаны возможности использования вируса гепатита ни-А, ни-В, получаемого от обезьян, зараженных штаммов

Ош-2599, Пример 1. Использование вируса гепатита ни-А, ни-В, полученного из фекальных проб инфицированной штаммом Ош2599 яванской макаки, для диагностики гепатита ни-А, ни-В, Фекальные пробы от инфицированной штаммом Ош-2599 яванской макаки собирают на 15 — 25 день после заражения и готовят из них 10 -ные фекальные экстракты: к 0,5 г фекалий добавляют 5,0 мл 0,01 М раствора фосфатно-солевого буфера (ФСБ), встряхивают 15 мин на шуттель-аппарате, затем центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин, переливают надосадочную жидкость в пластиковые пробирки и осветляют центрифу1687612

Место сбора

Количество положительных и об

Количество обсле рваных

2/84

12/37

34/52

24/38

1/24

2/25

Европейская часть СССР

Ташкент

Демократическая Республика Афганистан

Индия

Монгольская Народная Республика

Ф анция

Составитель И. Тарасова

Техред М.Моргентал Корректор Т. Палий

Редактор М. Петрова

Заказ 3678 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Г)роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужг род, ул. Гагарина, 101. гированием в течение 30 мин при 10000 об/мин. Далее экстракты проверяют на наличие антигена методом иммуноэлектронной микроскопии.

Положительные на антиген фекальные пробы в виде 10 (,-ных экстрактов используют в качестве антигена для выявления антител к вирусу эпидемического гепатита ни-А, ни-В в исследуемых сыворотках больных и в качестве положительного контроля при обследовании на вирус фекальных проб больных.

В таблице показано присутствие антител к вирусу эпидемического гепатита ни-А, ни-В в сыворотках больных из различных географических зон мира.

Пример 2, Использование вируса гепатита ни-А, ни-В, полученного из желчи, инфицированной штаммом Ош-2599 яванской макаки, для моделирования гепатита ни-А, ни-B.

Яванскую макаку, инфицированную штаммом Ош-2599, забивают на 14 — 15 день после заражения. Желчь из желчного пузыря отсасывают стерильным шприцем и в дальнейшем проверяют на содержание вируса методом иммуноэлектронной микроскопии. Содержание вируса в желчи достигает 300 частиц на 5 ячеек электронномикроскопической сеточки, В зависимости от содержания вируса желчь разводят в 5 — 10 раз стерильным физиологическим раствором, добавляют канамицин (0,5 мг/мл) и используют для заражения яванских макак. Заражение проводят внутривенно введением 1 мл разведенной физраствором желчи, Далее наблюдают развитие инфекции эпидемического гепатита ни-А, ни-В: выделение вируса с фекалиями, характерные для острого гепа5 тита гистологические изменения печеночной ткани, появление вирусспецифических антител.

Для моделирования гепатита ни-А, ни-В может быть использован также фекальный

10 экстракт, приготовленный по примеру 1.

Пример 3, Использование вируса гепатита ни-А, ни-В, полученного от инфицированной штаммом Ош-2599 яванской макаки, для получения гипериммунных ди15 агностических сывороток.

Для получения гипериммунных диагностических сывороток используют обезьяну (яванскую макаку), предварительно зараженную штаммом Ош-2599 и переболевшую

20 гепатитом ни-А, ни-В. Через два месяца после первого заражения обезьяне внутривенно вводят 1 мл вируссодержащей жидкости, полученной из фекальной пробы (пример 1) или из желчи (пример 2). Через две недели

25 после повторного заражения обезьяну обескровливают. Из полученной крови обычным способом готовят сыворотку.

Полученную сыворотку титруют методом ИЭМ и в дальнейшем используют для

30 выявления вируса гепатита ни-А, ни-В в фекальных пробах больных с целью специфической диагностики.

Формула изобретения

Штамм вируса гепатита ни-А, ни-В, ГКВ

35 М 831 для приготовления специфических диагностических препаратов.