Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis suвsр.кursтакi для получения энтомопатогенного препарата против lерidортеrа и соlеортеrа

Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis suвsр.кursтакi для получения энтомопатогенного препарата против lерidортеrа и соlеортеrа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии , может быть использовано в производстве препаратов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур и лесных насаждений и представляет собой новый штамм спорообразующих бактерий. Целью изобретения является получение нового штамма Bacillus thuringlensls sisbsp.kurstaki, обладающего инсектицидной активностью против представителей отрядов Lepidoptera и Coleoptera. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Института ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер ВКПМ - 4853. Штамм создан методом трансфекции на основе Bacillus thuringlensls subsp.kurstaki HD - 1 Dlpel. Донором плэзмидной ДНК служил штамм Eacilius thuringiensis subsp.kurstaki. Полученный штамм B.thuTingiensis subsp.kurstaki продуцирует (5-эндотоксины, обладающие инсектицидной активностью против бабочек и жуков, вредителей сельскохозяйственных культур. Штамм продуцирует кристаллы (5-эндотоксина трех типов. На среде ДПС продуктивность штамма 4,6 10 спор/мл, токсинообразование на среде Difco 0,3 мг/мл. Для непарного шелкопряда летальная концентрация токсических компонентов препарата, вызывающая 100%-ную смертность, на 1 г корма равна 1,5 10 спор/мл и 8 мкг токсина/мл; для колорадского жука на 1 см2 листа картофеля - 2,5 10е спор/мл и 70 мкг токсина/мл. 4 табл. О 00 00 00 ЧЭ

C0IO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

A 01 И 63/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ KOMMTET

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

6 (21) 4744546/13 (22) 09.08.89 (46) 07.11.91, Бюл, ¹ 41 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов СССР, Бердский химический завод Производстввнного объединения "Сиббиофарм" и Химический завод Прогресс" (72) С.A.Òþðèí, А.Ю.Баранов, И.А.Залунин, А.И.Пахтуев, Н.И,Шашкина, Р.П.Комарских, Ф.Н,Чегодаев, Л.А.Баузр, А,А.Антонов, В.А, Шима наев, Г. Г,Честухина и В.M.Ñòåïàнов (53) 632,951 (088.8) (56) Патент США N 4797279, кл, А 01 N

63/00, 1989, (54) ШТАММ БАК) ЕРИЙ BAClLLUS

THURlNGlENSIS SUBSP.KURSTAlC,I ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕН НОГО

ПРЕПАРАТА ПРОТИВ LEPIDOPTERA И

C0LE0PTERA (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, может быть использовано в производстве препаратов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур и лесных насаждений и представляет собой новый штамм спорообразующих бактерий.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, может быть использовано в производстве препаратов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур и лес„„SJJ „„1688819 А l

Целью изобретения является получение нового штамма Bacillus thuringlensl s

subsp.kurstaki, обладающего инсектицидной активностью против представителей отрядов lepidoptera u Coieoptera. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции и ромы ш лен н ых микроорганизмов Института "ВНИИгенетика" и имеет регистрационный номер ВКПМ вЂ” 4853, Штамм создан методом трансфекции на основе ВасИЪз

thuringlensis subsp.kurstaki HD — 1 "Dipel

Донором плазмидной ДНК служил штамм

Baciiius thuringlensis subsp.kurstaki. Полученный штамм В.thuringiensis

subsp kurstaki продуцирует д-эндотоксины, обладающие инсектицидной активностью против бабочек и жуков, вредителей сельскохозяйственных культур. Штамм продуцирует кристаллы д-зндотаксина трех типов.

На среде ДПС продуктивность штамма

4,6 . 10" спор/мл, токсинообразование на среде "Difco" 0,3 мг/мл. Для непарного шелкопряда летальная концентрация токсических компонентов препарата, вызывающая

100%-надю смертность, на 1 r корма равна

1.5 10 спор/мл и 8 мкг токсина/мл; для колорадского жука на 1 см листа картофеля — 2,5 10 спор/мл и 70 мкг токсина/мл. в

4 табл. ных насаждений и представляет собой новый штамм спорообразующих бактерий, Целью изобретения является получение нового штамма Вас,thurlnglensis

subsp.kurstaki, обладающего инсектицид1688819 мер стороны 1,1 мкм) 10

15 ной активностьK) против предсгави ел< l1отрядов epldoptera u Coieoptera.

Штамм получен путем скрещинания штамма Вас thuringiensis subsp.kurstakl 1-1!)—

1 "Dipel" со штаммомВас.thuringiепэ!s

subsp.tenebrionis при совместном культивировании. Полученный штамм обладает ин= сектицидной активностью против колорадского жука (отр.Coleoptera) и представителей отряда Lepidoptera. Штамм

Васл!шг!п giensis subsp,kurstakl Т вЂ” 2 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Института

"ВНИИ вЂ” генетика" и имеет регистрационный номер ВКПМ вЂ”  — 4853.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки, Грампопожительные подвижные палочки размером 4,1 — 1,6 мкм. В стационарной фазе роста образуют кристаллы д-эндотоксинов и овальные споры.

Хорошо растет на МП средах при 27 — 29 С и рН 6,8 — 7,5. На МПАна 10-е сутки при 29 С образует однородные колонии 3 — 5 мм в диаметре, светло-ceðîãî цвета со слабо изрезанным краем. Структура мелкозернистая.

В МПБ рост умеренный, помутнение однородное, образует кольцеобразную пленку.

На картофельном агаре и агаризованной среде Хоттингера рост обильный, на 7-е сутки при 29 С колонии светло-серого цвета, однородные, пигмента не образуют. По

Н-антигену относится к сероварианту Ill (ЗаЗв).

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: усваивает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, кукурузный и картофельный крахмал, соевую и кукурузную муку. Не усваивает лактозу, ксилозу, арабинозу, лецитин, Пептонизирует молоко, гидролизует крахмал, желатин не разжижает.

Отношение к источникам азота; восстанавливает Mèòðà û, усваивает àMìoнийные формы азота, Отношение к температуре: хорошо растет при 27 — 29 С. оптимальная температура

28о(Отношение к рН среды; хорошо растет при 6,8 — 75, огпимум рН 7,2.

Отношение к кислороду: аэроб.

Отношение к фагам: устойчив к основным производственным фагам 11, 22, С/П, И вЂ” 77, 25 — 16.

Энтомопатогенные свойства; синтезирует д-эндотоксины, обладающие инсекти20

50 цидной активностью против представителей отряда Lepldoptera и Coleoptera, синтезирует кристаллы д-эндотоксинов трех типов. большой (1,1х0,7 мкм) и маленький (0,5-- 0,3 мкм) ромбы, плоский квадрат (разГенетические особенности: рекомбинантный штамм Вас,thuringiensis

subsp.kurstaki Т вЂ” 2 наряду с плазмидами, свойственными штамму Вас,thuringiensls

subsp,kurstaki HD — 1 "Dipel" (реципиент), посредством трансцепции приобретает плазмидную ДН К штамма Вас.thur!п9!епз!з subsp tenebrionsis (донор) размером "60 т,п.н. Плазмида стабильна на протяжении более чем 100 генераций клеток.

Стабильность штамма Т вЂ” 2 проверяют согласно следующей схеме, Штамм снимают петлей с агаризованной Nutrient Broth (NB) и вносят в 2 мл аналогичной питательной среды, после чего выращивают в течение 12 ч при 28 С на круговой качалке при 240—

260 об./мин. Затем 1 мл микробной культуры засевают в колбу емкостью 750 мл с обьемом среды выращивания 100 мл

Nutrient Broth. По окончании 4-часового интервала 1/2 часть культуры отбирают и добавляют равный обьем свежей NB-среды.

Образцы отбирают для исследования культуральных признаков, иммунологического анализа и выделения плазмидной ДНК. Осуществляют 10 таких переносов, что составляет, согласно подсчетам, более 200 генераций клеток. Отобранные образцы разводят и высевают на чашки Петри с агаризованной средой Хоттингера с расчетом

30 — 100 колоний на чашку, после чего инкубируют при 28 С в течение 7 — 10 сут до полной споруляции анализированных клонов. Анализ плазмидного профиля, культурально-морфологических признаков, иммунологических свойств не выявил нестабильные варианты, Предлагаемый рекомбинантный штамм

Т вЂ” 2 генетически стабилен.

Маркерные признаки: Н-антиген ЗаЗв, плаэмида размером 60 т.п.н., штамм обладает инсектицидной активностью против представителей отрядов epidoptera u

Coleoptera и образует три типа кристаллов д-эндотоксинов (большой и маленький ромб, плоский квадоат), Р-эндотоксин не синтезирует.

Штамм хранят в ампулах после лилфилиэации спорокристаллической смеси обычным способом или в агаризованной МПБ (0,2 — 0,4 и при 4ОС, П р и M е р 1, Родительские штаммы

Вас thuringiensis s«l -.,p! urstaki HD — 1

1688819

"Dlpel" (реципиент, далее обозначается как

KUR) и Вас.thurlngiensis subsp. tenebrionsls (донор, далее обозначается как TEN), а также предлагаемый новый рекомбинантный штамм Вас thurigiensis subsp.kurstakl Т вЂ” 2 (дэлее обозначается как Т вЂ” 2) для подготов- 5 ки посевного материала выращивают в 2 мл

МПБ в течение 12 ч при 28 С на.круговой качалке при 240 — 260 об./мин. Затем 1 мл .микробной культуры засевают в колбы емкостью 750 мл с объемом среды выращива- 10 ния 50 мл дрожже-полисахаридной среды (ДПС) следуюшего состава, г/л: дрожжи кормовые 36; кукурузная мука 26,8; соевая мука 5,0; мел 3,0; вода — остальное, рН среды 7,2, и культивируют на круговой качалке 15

48 ч до стадии полной споруляции в тех же условиях. Определение титра жизнеспособных спор проводят на чашках Петри с МПа.

Результаты исследований приведены в табл.1. 20

Данные сравнительного анализа, проведенного в лабораторных условиях, показывают, что продуктивность штамма Т-2 не уступает продуктивности исходных родительских штэммов и составляет 4,6х10 25

9 спор/мл.

Пример 2. Иммунологический анализ д-эндотоксинов родительских штаммов KUR и TEN и сконструированного штамма Т вЂ” 2 проводят в реакции двойной иммунодиффу- 30 зии по Оухтерлони, Для этих целей исследуемые штаммы выращивают на питательной среде ("Difco", CLllA) в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 75 мл. Подготовку по- 35 севного материала и культивирование проводят, как в примере 1. После выращивания исследуемых штаммов до стадии полной споруляции споры и кристаллы осаждают центрифугированием при скорости 6000 40 об./мин 15 мин, трижды,п ромывают дистиллированной водой и гомогенизируют в 80 мл буфера (0,005 M трис-НС1, рН8,0,с0,5 твин — 80) 5 мин при скорости 5000 об./мин.

Затем 20 мл суспензии наслаивают на по- 45 верхность 20 мл 67 -ного раствора верографина в пробирках емкостью 50 мл к ротору JS — 20 ("Вeckman", США) и центрифугируют 90 мин при скорости 10000 об./мин и 4 С. Фракцию кристаллов, лока- 50 лизованную на границе интерфаз вода— верографин, отбирают с помощью пастеровской пипетки и отмывают от остатка верографина центрифугированием против дистиллированной воды трижды при 6000 55 об./мин в течение 10 мин. Очищенные кристаллы (более 96 чистоты) растворяют в

50 мл 0,05 М NaOH, рН 12,5 и 37 С в течение

1 ч. Количество полученного д-зндотоксина оценивают спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Далее растворы кристаллов используют для иммунологического анализа с иммуноглобулинами кролика против д-эндотоксинов родительских штаммов

KUR u TEN в реакции Оухтерлони, Результаты исследований представлены в табл.2, Как показывают приведенные в табл.2 данные, д-зндотоксины исходных родительских штаммов резко отличаются между собой по своим иммунологическим свойствам, в то время как рекомбинантный штамм Т—

2 синтезирует кристаллические белки, иммунологически идентичные и штамму-донору, и штамму-реципиенту.

Появление дополнительного д-эндотоксина штамма Т вЂ” 2 коррелирует с появлением плазмидной ДНК размером 60 т.п.н., присутствие которой наблюдали в плазмидном профиле после анализа плазмидной

ДНК иоследуемых штаммов с помощью электрофореза в 0,6%-ном агарозном геле.

Анализ и выделение плазмидной ДНК проводят с помощью метода Birnboim.

Суммарная продукция д-эндотоксинов у штамма Т вЂ” 2 не отличается от продукции на. указанной среде выращивания от исходных родительских штаммов и составляет

0,3 мг/мл.

Долю эндотоксинов, специфичных для

Lepidoptera и Coleoptera, определяют с помощью SDS-электрофореза в 7 ПААГ по методу Weber u Osborn. Для этих целей штаммы подращивают и получают растворы эндотоксинов, как в примере 2.

Результаты электрофоретического анализа приведены в табл.3.

Белки с молекулярной массой 133, 130 и

65 кДа обладают инсектицидной активностью против представителей отряда Lepidoptera. По данным электрофореза эга группа белков составляет примерно 70 от общего количества белков эндотоксинов рекомбинантного штамма Т вЂ” 2, Остальная доля общего белка приходится на эндотоксин с мол. массой 70 кДа, обладающий инсектицидной активностью против колорадского жука.

В полях зрения электронного микроскопа обнаружено у штамма Т вЂ” 2 три типа кристаллов. Два из них свойственны штамму KUR (большой и маленький ромб), а третий тип кристаллического включения (плоский квадрат) свойствен штамму TEN..

Пример 3. Определение энтомоцидной активности д-эндотоксинов сконструированного и родительских штаммов проводят на личинках непарного шелкопря1688819 да (Limantria dispar), используемого в качестве тест-объекта энтомоцидных свойств средств защиты растений, а также на личинках колорадского жука (Leptinotarsa

decemllneata Say) -- основного вредителя семейства пасленовых и представителя отряда Co leo ptera.

Штаммы выращиваютдо стадии полной споруляции, как в примере 2. Используют гусениц непарного шелкопряда 2 — 3 возрастов. Тест-насекомых содержат в чашках

Петри при 25 — 28 С и влажности 70-90, фотопериод 18 ч. В каждом опыте используют 45 гусениц. Гусеницам дают возможность свободно поглощать инфицированный искусственный корм (3 г на чашку). Учет гибели гусениц проводят на 6-е сутки, Биотестирование на личинках колорадского жука проводят по следующей схеме. Личинки 1—

2 возраста помещают в чашки Петри на лист картофеля. Листовые пластинки обрабатывают суспензией спор и кристаллов исследуемых штаммов до полного смачивания, в контроле обрабатывают дистиллированной водой. После подсыхания листовые пластинки (размеры 4 — 7 см) помещают в чашки Петри с 10 личинками. Учет гибели личинок колорадского жука проводят на 3-е сутки, Число испытуемых концентраций препаратов должно быть не менее 5, количество опытов менее 4 с 3 повторностями в каждом.

В табл.4 представлены летальные концентрации препаратов, вызывающие 100 ную гибель насекомых(на 1 r корма для непарного шелкопряда и 1 см листа растения для колорадского жука).

Сравнительные данные инсектицидной активности штаммов показывают, что рекомбинантный штамм Т вЂ” 2 обладает совмещенным действием на представителей Lepldoptera u Coleoptera s дозах, сравнимых с исходными родительскими штаммами.

Штамм Т вЂ” 2 эффективен против других видов насекомых в концентрации

10 спор/мл. На 4-е сутки наблюдается

1007ь-ная гибель у следующих личинок насекомых-вредителей сельскохозяйственных культур: озимая совка (Agrotls segetum), хлопковая совка (Hellothls armigera), капустная совка (Mamestra brassical), отличная совка (Mamestra suasa), люцерновая совка (Hellothls vlriplaca). донниковая совка

5 (Hellothis marltlma), луговой мотылек (Loxostege stictlalls).

Штамм Т-2 не обладает инсектицидной активностью в указанной испытуемой дозе против хищного клопа Podlsus macullventrls, 10 который используется как биологическое средство. подавления численности личинок колорадского жука (Leptlnotarsa decemИпеата Say). Следовательно, микробиологические препараты на основе штамма Т вЂ” 2

15 можно использовать в интегрированной системе защиты растений от колорадского жука совместно с биологическими средствами защиты растений, в частности совместно с хищным клопом для борьбы с колорадским

20 жуком.

Таким образом, методом трансцепции осуществлена передача плазмиды размером -60 т.п.н, из штамма-донора TEN в реципиентный штамм KUR. Передача

25 плазмиды коррелирует с появлением кристаллического включения (форма — плоский квадрат) белковой природы в штамме реципиента KUR. Молекулярная масса этого белка примерно 70 кДа (определено

30 электрофореэом в 7 ПААГ в присутствии

ДС-натрия). По своим иммунологическим и инсектицидным свойствам этот белок соответствует кристаллическому белку штаммадонора TEN. Следовательно. получен

35 штамм Т-2, который синтезирует д-эндотоксины исходных родительских штаммов. Рекомбинантный штамм Т вЂ” 2 является перспективным для использования в микробиологической промышленности с целью

40 создания препаратов, обладающих энтомоцидной активностью одновременно против представителей отрядов Lepldoptera u

Coleoptera.

Формула изобретения

45 Штамм бактерий ВасИ!оз thurlnglensls

subsp.kurstaki ВКПМ В -4853 для получения энтомопатогенного препарата против

Lepldoptera u Coleoptera.

1б88819

Штамм Вас, th

Т-2

KUR TER

Титр >KH3Hee lQC (сппор., 10 спор/

Таблица 2

Продуктивность Реакция штаммов; ноглоб л

ringiensis л

ТЕЛ3 !0 0 3

Т-2 г,а 0,3

КОК 10 0 3

*Показана положительная (+) или отрицательная (-) реакция кристаллических белков с иммуноглобулинами против д-эндотоксина KUR и д-эндотоксина TEN.

Таблица 3

urstakl

Те

Таблица 4

Штамм

Вас.thurlnglen

HO-1 "Dipel"

T-2

Tenebrionis

Составитель M.Ñoêoëàsà

Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор А.Осауленко

Реда:::- ар И. Шмакова,заказ 3?59 Тира>к Подписное

ВНИИПИ i осударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Г1роиэводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина. 101

Штамм

Вас.thuTM по о- КОЕ

ы,