Способ фракционирования нуклеиновых кислот

Способ фракционирования нуклеиновых кислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к способам получения препаратов нуклеиновых кислот, широко применяющихся в здравоохранении и сельском хозяйстве. Цель изобретения - снижение себестоимости конечных продуктов . Для этого способа предусматривает последовательное осаждение уксуснокислым калием суммарных однонитчатых РНК 1,4- 2,2 М и двуспиральных РНК 2,5-3,0 М, а осаждение ТРНК и ДНК осуществляется этиловым спиртом. Предложенный способ на порядок снижает себестоимость конечных продуктов f способствует улучшению экологической обстановки и условий труда, так как исключает использование токсичных веществ.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4710241/13 (22) 26.06.89 (46) 23.11,91. Бюл. М 43 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ

Научно-производственного объединения

"Вектор" (72) А.Б.Дужак, В, Ф.Подгорный и А.В. Штань (53) 547,963.3(088.8) (56) Proc. Nat!. Acad Sci, 1966, v,55, М 6, р.1504-1511, Prep. Blochem, 1978, v.8, М 11, р.1 — 17. (54} СПОСОБ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЬ!Х КИСЛОТ

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к способам получения препаратов нуклеиновых кислот, широко применяющихся в здравоохранении и сельском хозяйстве.

В настоящее время известен ряд методов фракционирования смРНК, дсРНК и

ДНК. Однако большинство из них для применения в крупномасштабном производстве непригодны, так как обладают принципиальными недостатками: сложностью исполнения и использованием дорогостоящих (как правило импортных) реактивов.

Известен способ фракционирования нуклеиновых кислот, включающий следующие последовательные стадии: препарат нуклеиновых кислот наносят на колонку с целлюлозой ЦФ-11 (фирмы "Ватман", Англия), колонку промывают 35%-ным этано„„SU „„1692986 А1

2,2 !У! и двуспиральных РНК 2,5 — 3,0 М, а осаждение ТРНК и ДНК осуществляется этиловым спиртом. Предложенный способ на порядок снижает себестоимость конечных продуктов н способствует улучшению экологической обстановки и условий труда, так как исключает использование токсичных веществ, лом, при этом элюируются ненуклеотидные примеси; колонку промывают 15%-ным этанолом, при этом элюируются рибосомальные и транспортные РНК; колонку промывают в отсутствие этанола, при этом элюируются дсРНК, Недостатком известного способа является нетехнологичность; использование дефицитного сорбента (целлюлоза ЦФ-11) и сложного оборудования (насос, проточный сектофотометр и т.д.), низкая производительность (нагрузка нуклеиновых кислот составляет 0,05 мгlг сорбента) и плохая эффективность разделения, Наиболее близким к предлагаемому является способ фракционирования нуклеиновых кисло —, заключающийся в том, что к раствору. нуклеиновых кислот добавляют хлористый литий до концентрации 2,0 M u выдерживают при "-4 С; сформировавший169298б ся осадск, содержащий смРНК (в основном рибосомальные и матричные), отделяют цетрифугированием в течение 15 — 20 мин при 10000 об/мин и температуре 2-4 С. В дальнейшем центрифугирование проводят в э.их же чсловиях, К надосадочной жидко, сти, соцержащей дсРНК, тРНК и ДН К, до оавляют хлористый литий до концентрации

4,0 M и выдерживают при 2-4 С. Осадок, ;одержащий дсРНК, собирак1Т центрифугированием, ДНК и тРНК, содержащиеся в надосадочной жидкости, осаждают, добавляя 1 — 2 объема этанола. Осадок собирают центрифугированием.

Б случае необходимости дополнительную очистку нуклеиновых кислот производят повторным фракциани рова нием хлористым литием или другими известными способами, Недостатком известного способа явля ется высокая стоимость хлористого лития.

: что увеличивает себестоимость препаратов нуклеиновых кислот, Кроме того, хлористый литий относится к токсичным соединениям.

Исходя из этого использование хлористого лития для промышленного получения нуклеиновых кислот ухудшает условия труда и экологически Опасно.

Целью изобретения является снижение себестоимости препаратов, Способ заключается в следующем. К раствору нуклеиновых кислот добавляют уксуснокисл ый калий до концентрации 1,4 — 2,2

Юи выдерживают при 2 — 4 С. Осадок, содержащий смРНК, собирают центрифугированием. К надосадо НОЙ жидкости, содержащей дсРНК, ДНК и тРНК, добавляют уксуснокислый калии ДО полной концег трации 2,5 — 3,0 M и выдерживают при 2 — 4" ;, Осадок, содержащий дсРНК„собирают 1.;ентрифугированием, ДНК итРН К, содер>кащлеся в надосадочнй жидкости, осаждают, добавляя 1- 2 объема этанола. Осадок собирают центрифугированием, 11о предлагаемому способу используют для фракционирования нуклеиновых кислот вместо хлористого лития уксуснокислый калий, что в 12 раз позволяет снизить себестоимость получаемых препаратов и

Отка1заться От использования хлористогО ли тия, при одновременном сохранении высокой эффективности фракционирования нуклеиновых кислот.

Пример 1. К препарату суммарных кислот из килле рных дрожжей

Saccharomyces cerevisiae, штамма ВКПМ У448 (киллерной системы К ), растворенному в 30 ил дистилированной воды, добавляют

10 мл 8,0 М уксуснокислого калия (до конеч10

ЗО

55 ной концентрации 2,0 M) и выдерживают

8 — 12 ч при 2 — 4 C.

Осадок, содержащий смРНК, собирают центрифугированием и растворяют в 30 мл

0,05 М калий фосфатного буферного раствора(рН 7,0), Из надосадочной жидкости отбирают аликвоту для электрофоретического анализа. К надосадочной жидкости добавляют 5,71 мл 8,0 M уксуснокислого калия (до конечной концентрации 2,7 5 M) и выдерживают 8 — 12 ч при 2-4 С, Осадок, содержащий дсРНК собирают центрифугированием и растворяют в 15 мл 0,05 M калий фосфатного буферного раствора (pH 7,0), К надосадочной жидкости добавляют 90 мл этилового спирта и выдерживают в течение 8-12 ч при

2-4 С, Осадок, содержащий ДНК и тРНК, собирают центрифугированием и растворяют в 30 мл 0,05 M калий фосфатного буферного раствора (при. 7,0). Из всех растворов нуклеиновых кислот отбирают аликвоты по

20 мкл и анализируют их состав электрофорезом в 1 -ном агарозном геле.

Для сравнения эффективности фракционирования к 30 мл исходного раствора суммарных нуклеиновых кислот добавляют 10 мл 8,0 M хлористого лития (до концентрации

20 М) и выдерживают в 30 мл 005 M калий фосфатного буферного раствора (рН 7,0). Из надосадочной жидкости отбирают аликвоту для электрофоретического анализа, К надосадочной жидкости добавляют 20 мл 8,0 M хлористого лития (до концентрации 4,0 M) и выдерживают в течение 8 — 12 ч при 2 — 4 С.

Осадок, содержащий дсРНК, собирают центрифугированием и растворяют в 15 мл 0,05

М калий фосфатного буферного раствора (рН 7,0). К надосадочной жидкости добавляют 120 мл этилового спирта и выдерживают в,течение 8-12 ч при 2-4" С.. Осадок, содержащий ДНК.и тРНК, собирают центрифугированием и растворяют в ЗО мл 0,05 M калий фосфатного буферного раствора(рН 7,0). Из всех растворов нуклеиновых кислот отбирают аликвоты по 20 мл и анализируют их состав электрофорезом в 1;ь-ном агарозном геле.

Из представленных оезультатов следует., что эффективность фракционирования смРНК, смРНК v ДНК с PHК по предлагаемому и известному способам практически идентичны, При этом стоимость расходуемого на фракционирсвании реактива по предлагаемому способу в 12 ниже, чем по известному.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить значительный экономический эффект, улучшить условия труда и экологическую Обстановку на предприятиях, производящих препараты нуклеиновых

1692906

Составитель Г. Степанова

Техред М,Моргентал Корректор M. Кучерявая

Редактор H. Рогулич

Заказ 4048 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 кислот, а его применение способствует повышению эффективности производства, обеспечивающего здравоохранение и сельское хозяйство высокоэффективными средствами противовирусной защиты и 5 стимулятора реэистентности организмов.

Формула изобретения

Способ фракционирования нуклеиновых кислот, включающий последовательное осаждение смРНК и дсРНК возрастающими концентрациями соли щелочного металла, отличающийся тем, что, с целью снижения себестоимости препаратов нуклеиновых кислот, в качестве соли щелочного металла используют уксуснокислый калий, причем смРНК осаждают при концентрации соли 1,4 — 2,2 М, а дсРНК вЂ” 2,5-3,0 М.