Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к трансферрину человека

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к трансферрину человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения трансферрина в сыворотке крови и моче. Штамм получают при слиянии клеток мышиной миеломной линии Sp 2/0- Ag 14-1 с клетками селезенки мышей линии BaLb/c, иммунизированных высокоочищенным трансформатором человека. Гибридные клоны отбирают на селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин, и клонируют в полужидком агаре. Штамм ICIOSp2/0 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под № 345Д. Время удвоения популяции 48 ч, частота пассирования 2-3 сут, кратность рассева 1/2 - 1/3. У мышей линии BaLb/c при прививке 2- 10x10 клеток штамма асцитные опухоли образуются через 10-16 сут. Титр моноклональных антител составляет 3 для культуральных жидкостей и 6 для асцйтных жидкостей, концентрация моноклональных антител в культуре составляет 100 мкг/мл, в асцитной жидкости 10 мг/мл. Антитела относятся к классу IgG 1. Чувствительность определения трансферрина человека составляет 10 мкг/мл. Специфичность монАТ показана методом иммуноблотинга. со с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (g>)s С 12 М 5/20, С 12 P 21/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР а .;::.н1ЮЗНЯ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ м

l» ч,г

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4707446/13 (22) 20.06.89 (46) 23.11.91. Бюл. ¹ 43 (71) Научный центр по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики (72) В. А. Фуралев и Е. С, Северин (53) 578.085.23(088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЪ|Х АНТИТЕЛ К ТРАНСФЕРРИНУ

ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения трансферрина в сыворотке крови и моче. Штамм получают при слиянии клеток мышиной миеломной линии Sp 2/OAg 14 — 1 с клетками селезенки мышей линии

Ва| Ь/с, иммунизированных высокоочищенным трансформатором человека. ГибридИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения трансферрина в сыворотке крови и моче.

Штамм гибридомы ICIO S 2/О получают следующим образом, Мышей линии BaLb/c иммунизируют 3кратно внутрибрюшинно по 10 мкг высокоочищенного трансферрина человека; первый раэ с полным адъювантом Фрейнда, второй раз с неполным адъюватом Фрейнда и третий раэ без адъюванта с интервалом в

1 мес. На третий день после последней иммунизации проводят гибридизацию клеток селезенки иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы Sp2/OAg 14 в

„„Я „„1693045 А1 ные клоны отбирают на селективной среде, содержащей гипоксантин. аминоптерин и тимидин, и клонируют в полужидком arape.

Штамм ICIOSp2/О хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под № 345Д. Время удвоения популяции 48 ч, частота пассирования 2-3 сут, кратность рассева 1/2 — 1/3, У мышей линии BaLb/c при прививке 210х10 клеток штамма асцитные опухоли образуются через 10-16 сут. Титр моноклональных антител составляет 3 для культуральных жидкостей и 6 для асцитных жидкостей, концентрация моноклональных антител в культуре составляет 100 мкг/мл, в асцитной жидкости 10 мг/мл. Антитела относятся к классу!961. Чувствительность определения трансферрина человека составляет 10 мкг/мл. Специфичность монАТ показана методом иммуноблотинга. мЪ

0 соотношении 10 клеток селезенки на 10 сО клеток миеломы, В качестве гибридиэующе- (1 го агента используют полизтиленгликоль для газовой хроматографии м.в. 4000. Гиб- р ридные клонй рассевают на селективную среду, содержащую гипоксантин (10 M} аминоптерин (4х10 М), тимидин (1,6х10

M) иа расчета 10 миеломнык клеток на 1 Ы ° лунку 96-луночного планшета. Через 2 недели проверяют продукцию специфических антител синтезируемых гибридными клонами, иммуноферментным методом с использованием конъюгатов кроличьих антимышиных антител с пероксидазой и высокоочищенного трансферрина в качестве антигена. Клонируют гибридами в полужид1693045 ком агаре. Полученный после реклонирова- трия (10 -ный ПААГ, по 20 мг белка на лунния клеток из асцитных опухолей активно ку), затем переносят белки на полоски из подуцирующий моноклональные антитела нитроцеллюлозы и инкубируют с раствором клон переводят в массовую культуру и обоз- монАТ в концентрации 10 мкг/мл. Связавначают ICIOSp2/О. Процент позитивных 5 шиеся с антигеном антитела выявляют при клонов на второй стадии составляет 70 >. помощи коньюгата кроличьих антител проШтамм ICIOSp2/О депонирован в специали.- тив иммуноглобулинов мыши, меченых пезированной коллекции перевариваемых со- роксидазой. При этом выявляется матических клеток Института цитологии АН связывание монАТ только с одной белковой

СССР ВСКК(П) под N 345 Д, 10 зоной, соответствующей белку с м,в. 78 киК моменту паспортизации число пасса- лодальтон, что соответствует м,в. трансфержей штамма ICIOSp2/О составляет 60 в рина. Взаимодействие моноклональных культуре и 25 на животных, антител с какими-либо другими белками сыШтамм характеризуется следующими вороткичеловеканеобнаружено. свойствами. 15: Таким образом было установлено, что

Среда культивирования: среда Дульбек- продуцируемые. штаммом антитела специко с 15 (, сыворотки эмбриона коровы, 1 мм фично реагируют с трансферрином человепирувата натрия, 50 мкм меркаптоэтанола и ка.

50 мкг/мл гентамицина, Клетки культивиру- Штамм гибридомы стабильно продуциют в атмосфере воздуха с 7,5 COz при 20 рует монАТ к трансферрину человека без

37 С, Культура состоит из слабо прикрепля- изменения аффинитета при длительном ющихся к субстрату клеток..Характер роста культивировании (60 пассажей в культуре и — стационарная суспензия. Время удвоения 25 на животных). популяции 48 ч, частота пассивирования— Титр моноклональных антител опредечерез 2-3 сут, кратность рассева 1/2 — 1/3, 25 ляют непрямым иммуноферментным метопосевная концентрация клеток (1-2)х10 в 1 дом, Он составляет 1000 для культуральных

5 мл. жидкостей и 10 для асцитных жидкостей, Введение клеток штамма в брюшную Концентрация монАТ в культуре 100 мкг/мл, полость мышей линии Balb/с вызывает у в асцитной жидкости 5-6 мг/мл. Для опредених образование асцитных опухолей. Доза 30 ления константы связывания монАТ инкубиклеток для введения (2-10)х10 . За 1-2 неде- ровали с несколькими различными

6 ли до введения клеток мышей сенсибилизи- концентрациями трансферрина в течение руют внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл 2 ч, а затем:.определяли концентрацию неминерального масла пристан(2,4,10,14-тет- связавшихся антител методом иммунораметилпентадекан), Время образования 35 ферментного -анализа. Расчет константы асцитных опухолей 10-16 сут. Переваривае- провбдили по уравнению Скэтчарда. Она мость асцитов 100-ная, . равна (1,35+. 0,35)х10 M.

- о

Маркерный признак: продукция специ-::. Способ криоконсервирования. фических монАТ к трансферрину человека. ": Криозащитная среда: культуральная

Класс lylg G1. 40 среда с 307 эмбриональной сыворотки коПодвижность изоферментов глюкозо-6- ровы и 10";ь диметилсульфоксида (криопрофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогена- тектор). Клетки (10 клеток в 1 мл) зы характерна для мышиных клеток. суспендируют в холодной криозащитной

Контаминантов штамма ICIOSp2/О, среде (+4 С). Суспензию разливают в стевключая бактерии, грибы, дрожжи и микоп- 45 рильные ампулы из расчета (1-2)х10 клеток лазмы, не обнаружено. на ампулу. Ампулы охлаждают до -70 С со

Характеристика монАТ, скоростью 1 С/мин и переносят в контейШтамм 11CIOSp2/О гибридом продуци- нер с жидким азотом. рует мышиные моноклональные иммуногло- Для размораживания клеток ампулы избулины класса G, подкласса 61. 50 влекают из азота и быстро размораживают

Принадлежность иммуноглобулинов к дан- до 37 С в водной бане. Клетки дважды отмыному классу и подклассу определена мето- вают в фосфатном буфере. Получают более дом иммуноферментного анализа с 60ф, жизнеспособных клеток по окрашиваиспользованием коньюгатов антител к мы- нию трипановым синим. шиным иммуноглобулинам разных классов 55 МонАТ из асцитных жидкостей получаи подклассов, ют путем 3-кратного высаливания сульфаСпецифичность антител оценивают ме- том аммония при концентрации 40$ от тодом иммуноблотинга. Для этого проводят насыщения с последующим диализом проэлектрофорез белков сыворотки человека в тив калийфосфатного буфера рН 7,5 с добавпопиакриламидном геле с додецилсульфатом на- лен и ем О, 1 М Na C I c последующей

1693045

Составитель Г.Игнатьева

Редактор О.Юрковецкая Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор Т.Малец

Заказ 4051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 аффинной хроматографией на белке А. Степень очистки иммуноглобулинов по данным злектрофореза составляет около 90 .

Пример. Высокоочищенный трансферрин человека сорбируют на полистирольном 96-луночном планшете, внося по

100 мкл раствора трансферрина с концентрацией 10 мкг/мл в фосфатном буфере с рН

7,4 с 0,1 М NaCI и инкубируя 1 ч при 37 С.

Затем планшеты промывают 3 раза тем же буфером с добавлением 0,05 твина-20 и вносят пероксидазный конъюгат монАТ клона (С!О $р2/О, полученный периодатным методом, в концентрации 1 мкгlмл в исследуемый образец, содержащий 5-100 мкг трансферрина (в том же фосфатном буфере). Инкубируют 30 мин, затем отмывают б раз тем же буфером с добавлением твина и вносят по 100 мкл субстрата — раствор орто5 фенилендиамина 0,25 мг/мл и перекись водорода 0,03, в ацетатном буфере рН 5,5.

Через 15 мин измеряют оптическую плотность при 492 нм. Результаты показывают, что минимально определяемая концентра10 ция трансферрина составляет 78 мгк в 1 мл.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus muscutus L М ВСКК (П)

345 Д вЂ” и родуцент моноклонал ьн ых антител

15 к трансферрину человека.