Штамм бактерий bacillus suвтilis - продуцент l - фенилаланина

Штамм бактерий bacillus suвтilis - продуцент l - фенилаланина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 P 13/22, С 22 N 15/01

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2 1) 471 6354/13 (22)06.07.89 (46)23.11,91, Бюл. И 43 (71) В сесоюз н ый научно-исследовател ьский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Т. А. Ямпольская, Г, А. Великжанина, H.

И. Жданова, Т. А. Бачина, Н. А. Васильева и

А. К. Соколов (53) 663. 15(088.8) (56) Патент США

М 4591562, кл. С 12 Р 13/22, 1986.

Авторское свидетельство СССР

N 1380212 екл; С 12 P 13/22, 1986. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS

SUBTILIS — ПРОДУЦЕНТФФ ЕНИЛАЛАНИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма — незамениИзобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма — продуцента незаменимой аминокислоты L-фенилаланина, которая применяется в медицине, а также может служить исходным веществом при синтезе аспартама — пептида, используемого в качестве интенсивного подсластителя пищевых продуктов.

Целью изобретения является получение штамма бактерий Baciilus subtilis ВКПМ В4761 (264-Т), способного синтезировать до

17 г/л L-фенилаланина при росте на простых по составу средах.

Штамм получен как мутант штамма В.

subtilis ВНИИгенетика-19п путем мутагенизации клеток нитрозогуанидином и отбора мутантов, ауксотрофных по тирозину.

„„Я „„1693056 А1 мой аминокислоты L-фенилаланина, которая применяется в медицине, а также может служить исходным веществом при синтезе аспартама — пептида, используемого в качестве интенсивного подсластителя пищевых продуктов. Целью изобретения является получение штамма бактерий Bacillus

subtliis В КПМ-4761 (264-T), способного синтезировать до 17 г/л L-фенилаланина при росте на простых по составу средах. При выращивании на среде с кукурузным экстрактом. аммонийным азотом, минеральными солями и при поддержании в среде концентрации сахара на уровне, близком к лимитирующему, после 80 ч в культуральной жидкости накапливается 17 г/л L-фенилаланина. Коэффициент конверсии сахара в фенилаланин 12,2%, Штамм хранят в столбиках полужидкого агара Хоттингера (0,7%) с 2-5% мальтоэы О под слоем вазелинового масла при 2-4ОС . сО или в лиофильно-высушенном состоянии в Ъ стеклянных запаянных ампулах при комнатной температуре.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки. Грампоаожитеаьние спорообразую- )3Ь щие палочки размером (2,5-4,5)х0,7 мкм. в

Размер спор (1,0-1,2) х (0,6-0,7) мкм.

Мясопептонный агар и агар Хоттингера: колонии после 24 ч инкубации при 37 С достигают 4-6 мм в диаметре, сплошные, круг- лые, с изрезанным краем, поверхность гладкая, цвет кремовый, 1693056

Агаризованная среда Спицайзена с 40 мкг/мл тирозина и 10 MKr/мл аденина: колонии после 48 ч инкубации при 37 С имеют 1 мм в диаметре, поверхность гладкая, блестя щая, цвет серовато-бел ый. 5

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: использует сахарозу, глюкозу, мальтозу, маннит, глицерин, ацетат, Отношение к источникам азота: исполь- 10 зует мочевину, соли аммония.

Не растет на молоке, желатину разжижает слабо, хорошо растет на крахмале.

Отношение к аналогам аминокислот: устойчив к р-фторфенилаланину (9 мгlмл) и 15

О-тирозину (0,075 мг/мл).

Потребность в факторах роста: требует для роста 40 мкгlмл тирозина, рост стимулируется аденином.

Ауксотрофность по тирозину позволя- 20 ет штамму расходовать весь пул префеновой кислоты (общего предшественника фенилаланина и тирозина) на синтез одного фенилаланина. Кроме того, 3-дезокси-D" арабиногептулозонат-7-фосфат синтетаза 25 (ДАГФ-с), ключевой фермент биосинтеза ароматических аминокислот, у исходного штамма репрессируется в присутствии тирозина и фенилаланина, Отсутствие тирозина в пуле предлагаемого штамма приводит 30 к снижению репрессии ДАГФ-с, что обеспечивает этому штамму более высокий, чем у исходного штамма, уровень образования фенилаланина (до 17г/л).

Другим преимуществом предлагаемого 35 штамма по сравнению с известным является полное отсутствие в культуральной жидкости тирозина, что значительно облегчает процесс выделения целевого продукта, В то же время потребность в тирозине обеспечи- 40 вается присутствием в ферментационной среде кукурузного экстракта, который добавляется в среду и для известного штамма.

Штамм растет при 28-3 С; оптимальная температура 32 С. Рост возможен при рН 45

5-9, оптимум рН 7,0-7,2.

Получение L-фенилаланина с использованием предлагаемого штамма-продуцента осуществляют следующим образом.

Клетки штамма Вас. subtilis ВКПМ В- 50

4761 выращивают в течение 1 сут на агариэованной среде Хоттингера, пересевают в колбы со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азот, ростовых веществ и необходимые минераль- 55 ные соли, и культивируют в течение 18-24 ч на качалке при 220 об/мин и 28-37 С. Полученный посевной материал вносят в колбы или ферментеры со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азота, ростовых веществ и минеральные соли. В качестве источника углерода используют сахарозу или содержащие ее субстраты, например технологический сахар, в качестве источника азота — мочевину или соли аммония, в качестве ростовых веществ кукурузный экстракт. Ферментацию осуществляют в течение 46-72 ч в условиях аэрации при 28-37 С, рН 6-8, в колбах на качалке или в ферментере. В конце ферментации в культуральной жидкости накапливается до

17 г/л фенилаланина.

Препарат L-фенилаланина из ферментационного раствора готовят в виде кормового препарата или выделяют в кристаллической форме известными способами, Пример 1. Штамм Вас, subtilis ВКПМ

В-4761 выращивают в течение 18 ч при 37 С на агаризованной среде Хоттингера. Затем петлей засевают колбы объемом 250 мл, содержащие 30 мл посевной среды. Состав посевной среды, г/л: сахароза 50; кукурузный экстракт 20: КгНР04 1,4: КНгРО4 0,6; водопроводная вода до 1 л, рН до стерилизации 7,2-7.5, после стерилизации 7,0-7.2.

Посевную среду стерилизуют в автоклаве при 0,8 атм в течение 30 мин. После посева колбы устанавливают на круговую качалку (220 об/мин) и инкубируют при ЗО C B течение 18 ч. Готовый посевной материал вносят в количестве 5 об, в колбы емкостью 750 мл с 30 мл ферментационной среды. Состав ферментационной среды, г/л: сахароза 130; кукурузный экстракт30; КНР041,4; КН2РОа

0,6; NaCI 0,5: MgS04 1,0: мочевина 5,0; водопроводная вода до 1 л. рН среды 7,2. Мочевину добавляют перед засевом в готовую среду в виде 40 -ного раствора, простерилизованного при 0,5 атм в течение 30 мин, После засева колбы устанавливают на качалку, После 72 ч роста при 30 С в культуральной жидкости накапливается 12 г/л фенилаланина, Помимо фенилаланина в культуральной о жидкости содержатся следующие аминокислоты. г/л: 0,56; аспарагин 0.042; треонин

0,0088; серин 0,215; глутаминовая кислота

0,119; аланин 0,098; изолейцин 0,056; лейцин 0,171; гистидин 0,164; лизин 0,116, Ароматические аминокислоты тирозин и триптофан в культуральной жидкости отсутствуют, Исходный штамм В. subtilis ВНИИгенетика-19п в аналогичных условиях образует

9,1 г/л L-фенилаланина, П ри м е р 2. Посевной материал штамма ВКПМ В-4761 выращивают, как в примере 1. Готовым посевным материалом (50 мл) засевают 650 мл ферментационной среды.

1693056

Составитель Л.Минеева

Редактор О.Юрковецкая Техред М.Моргентал Корректор Т.Малец

Заказ 4051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ. СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Состав среды, г/n: кукурузный экстракт 30;

NaCI 0.5; (ИНф304 5; MgS04 1; КНгРОа 0.6;

КН РО 1-4; водопроводная вода до 1 л.

Культивирование ведут при 32 С в лабораторном ферменте, оснащенном системой автоматического рН-статирования и перистальтическим насосом для подачи в ферментер стерильного раствора сахара, при расходе продуваемого через культуральную жидкость воздуха 600 мл/мин и скорости вращения мешалки 750 об/мин. Значение рН культуральной жидкости поддерживают на уровне 7,0-8,1, используя 6,9 н. раствор аммиачной воды. Концентрацию сахара в процессе культивирования поддерживают на уровне, близком к лимитирующему. Для этого через 1 ч после засева в ферментер начинают подавать раствор сахара концентрации 700 г/л, вначале со скоростью 1 мл/ч, затем после 15 и 21 ч культивирования скорость подачи увеличивают до 2,0 и 2,5 мл/ч соответственно и далее не меняют.

При таком режиме подачи концентрация сахара в среде на протяжении процесса ферментации не выходит за пределы 0-5 г/л.

Культивирование ведут в течение 80 ч. В результате s культуральной жидкости накапливается 17 г/л фенилаланина, коэффициент конверсии 12,2 . Штамм-прототип в аналогичных условиях выделяет 9,5 г/л фенилаланина, коэффициент конверсии 7$.

Пример 3. Условия выращивания посевного материала, начальный состав ферментационной среды и условия ферментации, как в примере 2. Отличие в том, что ферментационная среда содержит 15 г/л (NH4QSO4 вместо сахара в ферментер подают раствор мелассы с концентрацией углеводов 450 г/л. Скорость подачи составляет

1,7 мл/ч, после 15 культивирования скоро5 сть подачи увеличивают до 3,5 мл/ч и далее не меняют. Культивирование ведут при 32 С в течение 80 ч. По окончании процесса в культуральной жидкости накапливается до

12 г/л L-фенилаланина. Коэффициент кон10 версии углеводов мелассы в фенилаланин составляет 8,2 .

Пример 4. Ферментацию проводят в аппарате объемом 10 м . Состав ферментационной среды, как в примере 2. Начальный

15 объем среды 5 м . Посевной материал, выращенный в колбах, как описано в примере

1, вносят в количестве 1 л. Ферментацию ведут при 32-33 С, перемешивании 260 об/мин и продувании воздухом 5 м /мин.

20 рН поддерживают на уровне 7 автоматической подачи 207,-ного водного раствора аммиака. После 12 ч ферментации в аппарат начинают подавать стерильный раствор сахара с концентрацией 550 г/л. Вначале ско25 рость подачи составляет 8 л/ч, через 10 ч ее увеличивают до 23 л/ч и далее не меняют.

Общее количество поданной подпитки составляет 1300 л (720 кг сахара). После 75 ч ферментации содержание фенилаланина в

30 культуральной жидкости составляет 13 г/л.

Коэффициент конверсии сахара в фенилаланин 10,8 Я.

Формула изобретения

35 Штамм бактерий Bacillus subtllls ВКПМ

В-4761 — продуцент L-фенилаланина.