Способ определения днказной активности микроорганизмов

Способ определения днказной активности микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и предназначено для ускоренного определения ДНКазной активности микроорганизмов. Целью изобретения является ускорение, упрощение и повышение экономичности способа. Способ заключается в том, что микробная культура смешивается с раствором ДНК или ее соли на предметном стекле и после 1-2 ч экспозиции при 37°С определяют ДНКазную активность исследуемой культуры с помощью капиллярометрии по скорости подъема жидкости в капилляре. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 Q 1/00

ГОСУДАР СТВЕ ННЫ И КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4706065/13 (22) 16.06,89 (46) 23,11.91. Бюл. М 43 (71) Кишиневский государственный медицинский институт (72) Н.Н, Морарь и В,M. Никитин (53) 577.15.08(088.8) (56) Никитин В.M. Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов, — Кишинев: Картя молдовеняске, 1986, с. 150 — 152.

Там же, с. 153 — 154, Изобретение относится к медицинской микробиологии и предназначено для ускоренного определения ДН Казной активности микроорганизмов.

Известны ускоренные способы определения ДНКазной активности, например быстрый тест на ДНКаэу с использованием метилового зеленого, ускоренный флюоресцентный метод Лачика и Дейбеля, ускоренный метод с использованием хромогенного субстрата Смита и др (1).

Однако перечисленные методы относительно трудоемкие и не экономичные„так как при их постановке используются дорогосгоящие реактивы.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является вискозиметрический метод, который осуществляется следующим образом, Берут 3 — 5 мл исследуемой культуры в бульоне Хоттингера, вносят в центрифужную пробирку и центрифугиру„„ ЫÄÄ 1693058 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНКАЗНОЙ

АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии и предназначено для ускоренного определения ДНКаэной активности микроорганизмов. Целью изобретения является ускорение, упрощение и повышение экономичности способа. Способ заключается в том, что микробная культура смешивается с раствором ДНК или ее соли на предметном стекле и после 1 — 2 ч экспозиции при 37 С определяют ДНКазную активность исследуемой культуры с помощью капиллярометрии по скорости подъема жидкости в капилляре, 2 табл. ют при 3000 — 5000 об/мин в течение 30 — 45 мин. Затем 0 1 мл надосадочной жидкости переносят в опытную пробирку, куда последовательно добавляют 0,6 мл 0,1 -ной натриевой соли ДНК, 0,2 мл боратного буфера и 0,1 мл хлорида кальция. Пробирку помещают на водяную баню на 30 мин и после этого с помощью вискозиметра Оствальда определяют вязкость жидкости, которая уменьшается в связи с деполимеризацией соли ДНК под воздействием микробной

ДН Казы (2).

Несмотря на относительную доступность описанного метода для практических лабораторий, он продолжает оставаться трудоемким и неэкономичным, требующим дополнительной аппаратуры (вискозиметр

Оствальда, центрифуга, водяная баня и др.). и относительно длительным (результат можно получить не раньше 2.5-3 ч).

1693058

Целью изобретения является ускорение, упрощение и повышение экономичности способа.

Способ заключается в том, что микробную культуру смешивают с раствором ДНК или ее соли на предметном стекле и после экспозиции 1 — 2 ч при 37 С определяют

ДНКаэную активность исследуемой культуры с помощью капиллярометрии, Способ осуществляется следующим образом, Предварительно готовят 1,57-ный раствор ДНК или ее соли, который можно хранить при 4 С до 3 нед. Выбор укаэанной концентрации раствора ДНК объясняется . тем, что такой раствор имеет вязкость, измеряемую капиллярометрией, в среднем 5—

8 мм (вязкость колеблется в указанных пределах в зависимости от температуры и срока хранения раствора). Применение более концентрированного раствора ДНК нецелесообразно иэ-за крайне высокой вязкости и дороговизны препарата, а менее концентрированный раствор непригоден из-за низкой вязкости.

Для определения ДНКазной активности микробов на чистое предметное стекло наносят 0,05-0,1 мл 1,5 -ного раствора ДНК или ее соли, s котором эмульгируют полную . бактериальную петлю исследуемой культуры. С помощью капилляра (используют капилляры, входящие в упаковку к диагностической сыворотке на С-реактивный белок) опеределяют инициальную вязкость раствора в капле, затем предметное стекло помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 С (указанная температура . является наиболее оптимальной для ферментатианой активности патогенных микроорганизмов). По истечении 1 — 2 ч вновь определяют вязкость раствора в капле и по ее изменению судят об активности ДН Казы.

Чем выше ДНКазная активность исследуемой культуры, тем больше снижается вязкость раствора в капле. . Степень активности ДНКазы микроорганизмов можно выразить в условных единицах от 1 до 10, вычислив ее по формуле

Са ДНКазы = —, Нк

Ни где С ДН Казы — степень активности ДНКазы, усл .ед.;

Нк — ВЫСОТа СТОЛбИКа ЖИДКОСТИ В КдПИЛляре по истечению 1 или 2 ч инкубации, мм;

Ни — инициальная высота столбика жидкости в капилляре до инкубации, мм.

По степени ДНКазной активности, определяемой с помощью предлагаемого способа, все микроорганизмы условно можно разделить на 4 группы, Классификация микроорганизмов по степени ДНКазной активности приведена в

5 табл. 1, Предлагаемый способ определения

ДНКаэной активности апробирован экспериментально с 11 штаммами различных микробов.

10 Результаты определения ДНКаэной активности стафилококков и других микробов с помощью капиллярометрии приведены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что наиболее сущест15 венные изменения вязкости раствора в капле происходят в первые 2 ч инкубации, поэтому через 1 ч можно учесть предварительный результат, а через 2 ч — оконЧ.: тельный.

20 . Пример. Определение ДНКазной активности культуры золотистого стафилококка "209-Р".

На чистое предметное стекло наносят

0,05 мл 1,5;4-ного раствора натриевой соли

25 ДН К и в нем тщательно эмульгируют полную бактериальную петлю 18 — 24-часовой агаровой культуры золотистого стафилококка

"209-P", Затем с помощью капилляра определяют инициальную вязкость раствора в

30 капле следующим образом. Берут капилляр, промываютдистиллированной водой и устанавливают его строго вертикально в каплю на 30 с (за это время жидкость самотеком поступает в капилляр, и чем меньше вяэ35. кость жидкости, тем больше высота столбика в капилляре). Затем обыкновенной линейкой измеряют высоту столбика жидкости в капилляре, что соответствует инициальной вязкости (в приведенном примере

40 инициальная вязкость капли равна 7 мм).

Предметное стекло помещают so anажную камеру и инкубируют в термостате при 37 С, По истечении 1 ч вновь определяют вязкость раствора в.капле. К примеру, она равна 28,7

45 мм.

Для определения степени ДНКазной активности исследуемой культуры стафилококка необходимо делить значение высоты столбика жидкости в капилляре после инку50 бации 1 и на значение высоты столбика жидкости до инкубации:

Нк

Са ДН Казы = — = 4,1, .

Ни

Согласно приведенной в табл. 1 класси55 фикации микроорганизмов по степени

Д Н Казной активности исследуемая кул ьтура золотистого стафилококка "209-P" относится к группе средней степени ДНКазной активности.

1693058

Аналогично можно определить степень

ДНКазной активности остальных культур микробов (табл. 2).

Формула изобретения

Способ определения ДНКазной активности микроорганизмов, включающий смешивание раствора ДНК или ее соли с анализируемым образцом, инкубацию и измерение изменения вязкости методом капиллярометрии, отличающийся тем, что, с целью ускорения, упрощения и повышения экономичности способа, в качестве анализируемого образца используют непос5 редственно свежевыделенную микробную культуру, смешивание осуществляют в капле на предметном стекле, измерение изменения вязкости ведут по скорости подъема инкубируемой смеси в капилляр.

Таблица 1

Таблица 2

Результаты капилля рометрии (среднеарифметическая высота столбика жи кости в капилля е,мм, череза емя, ч

Исследуемая культура

Ини иальная

5,0

5,0

4,8

4,6

Составитель А,Семенов

Редактор О.Юрковецкая Техред М,Моргентал Корректор Э.Лончакова

Заказ 4052 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ. СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Золотистый стафилококк

"209-P" — — "Королев" — "Иванов" — "Кован-1" — "Смит"

Эпидермальный стафилококк

Сапрофитный стафилококк

Микрококк лизодейктикус

Кишечная палочка (0-55) Синегнойная палочка

Контроль (1,5 -ный раствор нат иевой соли НК

7,0

7,5

6,5

7,0

7,5

7,0

7,5

6,5

6,0

6,0

5.5

28,7 .

36,5 .

17,5

18,6

26,2

15,2

7,8

6,7

5,8

6,5

5,3

32,5

40,6

23,4

23,4

37,1

18,4

7,6

6,3

5,4

6,9

5,0

34,5

41,4

27.,6

25,5

40,0

21,5

6,6

5,8

5,4

7,2

4,7