Среда покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию

Среда покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для индикации и подсчета количества вирусов в вирусных суспензиях и биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение чувствительности и стабильности среды покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию. Предлагаемая среда покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию, содержащая раствор Эрла или среду 199 на растворе Эрла, сыворотку крупного рогатого скота, бикарбонат натрия, отличается тем, что она дополнительно содержит аминоэтоксиаэросил при следующем соотношении компонентов: аминоэтоксиаэросил 0,03 - 0,05 мас.%; бикарбонат натрия 0,2 - 0,3 об. %; сыворотка крупного рогатого скота 3,0 - 5.0 об.%; раствор Эрла или среда 199 на растворе Эрла до 100,0 об.%. 7 табл. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ре Эрла до 100,0 об.%. 7 табл. (21) 4602974/13 (22). 29.08.88 (46) 30.11.91. Бюл, М 44 (71) Киевский государственный институт усовершенствования врачей и Институт химии поверхности AK УССР (72) В.Н.Гирин, А,А.Чуйко, В.К.Пикапов, И.И.Бойко, В.И,Богомаз, И.В.Дзюблик и

В.М.Плугаты рь (53) 576,8.094.29, 576.858 (088.8) (56) Dulbecco R., Vogt M., Plague formation

and isolation of pure lines with роПотуоПбз

virus. — J.Ехр, Med, 1954, v.99, р,167 — 182, Авторское свидетельство СССР

М 478059, кл. С 12 К 7/00, 1975. (54) СРЕДА ПОКРЫТИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ

ВИРУСОВ ПО БЛЯШКООБРАЗОВАНИЮ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть исИзобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для индикации и подсчета количества вирусов в вирусных суспензиях и биологических жидкостях.

Известна плотная питательная среда для выявления и изоляции вирусов полиомиелита по бпяшкообразованию, включающая в себя растворы Эрла, нейтрального красного, куриный эмбриональный экстракт и агар

Дифко, Недостатком известной среды для выявления вирусов по бляшкообразованию является непригодность агарового покрытия для многих перевиваемых культур клеток, которые быстро дегенерируют и

„„59„„1694641 А1 пользовано для индикации и подсчета количества вирусов в вирусных суспензиях и биологических жидкостях. Цель изобретенияповышение чувствительности и стабильности среды покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию. Предлагаемая среда покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию, содержащая раствор

Эрла или среду 199 на растворе Эрла, сыворотку крупного рогатого скота, бикарбонат натрия, отличается тем, что она дополнительно содержит аминоэтоксиаэросил при следующем соотношении компонентов: аминоэтоксиаэросил 0,03 — 0,05 мас,%; бикарбонат натрия 0,2 — 0,3 об,%; сыворотка крупного рогатого скота 3,0 — 5.0 об.%; раствор Эрла или среда 199 на раствой отслаиваются от стекла. Кроме того, на эф- (), фективность выделения и титрования вирусов по бляшкообразованию отрицательное влияние оказывают содержащиеся в агаре вирусные ингибиторы — сульфатированные полисахариды, а также фотодинамическое Ф действие нейтрального красного, Трудоемким и материалоемким является процесс приготовления куриного эмбрионального экстракта и контроль на его стерильность.

Существенным недостатком агарового покрытия является сложность его приготовления; отдельное приготовление растворов.

А и В; необходимость расплавления агара

Дифко и нанесение на клетки покрытия с температурой 43 "С (быстрое застывание

30

50 агара при более низкой температуре); необходимость проведения ряда манипуляций в темноте.

Необходимость использования дорогостоящих термостатов с подачей COz для поддержания определенных параметров рН среды существенно ограничивает возможности применения метода титрования вирусов под агаровым покрытием.

Известна жидкая питательная среда покрытия, содержащая раствор Эрла, бикарбонат натрия, сыворотку крупного рогатого скота, природный алюмосиликат бентонит.

Недостатками жидкого питательного бентопитового покрытия являются трудоемкость и сложность получения геля бентонита из природного сырья. Природный ал юмосиликат бентонит характеризуется нестабильностью химического состава и различной дисперсностью в зависимости от месторождения, что затрудняет получение геля стандартизованного состава, отсутствует также выпуск бентонитового геля в промышленных масштабах. . Цель изобретения - повышение чувствительности и стабильности среды покрытия для выявления вирусов по бля шкообразовани1о.

Поставленная цель достигается, тем что в раствор Эрла или среду 199 на растворе Эрла вносят бикарбонат натрия, сыворотку крупного рогатого скота и аминозтоксиаэросил с рН покрытия 7,9 при следующем соотношении компонентов, :

Аминоэтоксиаэросил 0,03 — 0,05

Бикарбонат натрия 0,2 — 0,3

Сыворотка крупного рогатого скота 3 — 5

Раствор Эрла или среда

199 на растворе Эрла До 100

Предлагаемую среду покрытия выгодного отличает ее высокая стабильность в течение длительного времени перед использованием (6 мес при температуре хранения 4 С) без изменения свойства как отдельных ее компонентов, так и покрытия в целом. В то же время, агаровое покрытие не обладает стабильностью свойств, так как может быть приготовлено только ех tempore и его качество, а также качество результатов выявления вирусов по бляшкам зависят от температуры покрытия во время его приготовления и s момент внесения на зараженн ые клеточные культуры (43 С).

Бентонитовое питательное покрытие не обладает стабильностью из-за различий физико-химических свойств самого геля бентонита, что связано с месторождением природного сырья, нестандартиэированными условиями приготовления бентонитового геля, а также со способностью частиц бентонита агрегироваться в конгломераты при хранении уже готового покрытия.

Функциональное назначение аминоэтоксиазросила в покрытии для выявления вирусов по бляшкообразованию состоит в локализации вируса на клеточном монослое, абсорбции на своей активной поверхности "свободного" вируса, который не проник в клетку во время предварительной инкубации вируса и клеток; в абсорбции частиц аминоэтоксиаэросила на поверхности неповрежденных вирусом клеток; а также в визуализации вирусных бляшек на клеточном монослое без применения дополнительных методик окрашивания клеток: вирусные бляшки представляют собой прозрачные пятна четкой формы и размеров на матово-белом фоне неповрежденных клеток, покрытых аминоэтоксиаэросилом.

Пример 1. Выявление вируса полиомиелита1типа, штамм Lsc,2àÜ, К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминозтоксиаэросил, предварительно простерилиэованный сухим жаром при 160 — 170 С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56 С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может храниться до применения в бытовом холодильнике.

Взвесь клеток Чего при концентрации

300 тыс.-кл./мл вносят в стерильные пенициллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования монослоя на дне. Вируссодержащий материал или его разведения (десятикратные) вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при

37 С 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия, Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термостате при 37 С.

Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и подсчитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточногоионослоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).

В табл,1 приведены результаты титрования полиовируса I òèïà, штамм Lsc, 2 аЬ в зависимости от концентрации аминоэтоксиаэросила и рН в среде покрытия.

Пример 2. Выявление вируса поли- омиелита 11 типа, штамм Р-712 ch, 2 ab, К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминоэтоксиазросил, предварительно простерилизованный сухим жаром

1694641

30

55 при 160 — 170 С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56. С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия.

Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и можат храниться до применения в бытовом холодильнике.

Взвесь клеток Чего при концентрации

300 тыс.кл./MR вносят в стерильные пенициллиновые флаконы и выращива,от под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на дне монослоя. Вируссодержащий материал или его разведения (десятикратные) вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37 С 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдерживэния в термостате при 37 С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и подсчитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного монослоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается кэк БОЕ (бляшкообразующая единица).

В табл.2, приведены результаты титрования полиовируса ll типа, штамм P-712 ch

2 аЬ в зависимости от концентрации аминоэтоксиаэросила и рН в среде покрытия.

Пример 3. Выявление вируса Коксэки

В 1, штамм Сопп-5.

К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминоэтоксиазросил, предварительно. простерилизованный сухим жаром при160 — 170 С втечение1,5ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56ОС в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может хранится до применения в бытовом холодильнике.

Взвесь клеток Чего при концентрации

300 тыс.кл./мл вносят в стерильные пенициллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на дне монослоя. Вируссодержащий материал или его разведения (десятикратные) вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при

37 С 60 мин, затем заливают 3 мл. среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термостате при

37 С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и подсчитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного монослоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).

В табл,3 приведены результаты титровэния вируса Коксаки В 1, штамм Сопп-5 в зависимости от концентрации аминоэтоксиэзросила и рН в среде покрытия.

Пример 4. Выявление вируса Коксаки

В 3, штамм Nancy.

К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминозтоксиаэросил, предварительно простерилизованный сухим жаром при 160- 170 С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят Б мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56 С в течение I ч, добавляют бикарбонат натрия.

Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может храниться до применения в бытовом холодильнике.

Взвесь клеток Чего при концентрации

300 тыс.кл./мл вносят в стерильные пенициллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на дне монослоя. Вируссодержащий материал или его разведения (деся-. тикратные) вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при

37ОС 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия, Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термостате и ри 37 С.

Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и подсчитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного монослоя.

Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкоабразующая единица).

В табл.4 приведены результаты титровэния вируса Коксаки В 3, штамм Nancy в зависимости от концентрации аминоэтоксиаэросила и рК в среде покрытия.

Пример 5. Выявление вируса Коксаки

В 6, штамм Schmltt.

К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминоэтоксиаэросил, предварительно простерилизованный сухим жаром при160-170 Свтечение 1,5ч.,интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56 С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может хранится до применения в бытовом холодильнике.

Взвесь клеток Vего при концентрации

300 тыс.кл/мл BHGCAT в стерильные пенициллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования нэ дне монослоя, Десятикрат1694641 ные разведения вируса Коксаки В 6, штамм

Schmitt вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37 С

60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после 5 выдерживания в термостате при 37 С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и учитывают число прозра нных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного монослоя. 10

Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).

В та бл.5 и ри веден ы резул ьтаты титрования-вируса Коксаки В 6, штамм Scflmltt в 15 зависимости от концентрации аминоэтоксиазросила и рН в среде покрытия.

Пример 6. Выявление вируса Коксаки

В G, штамм Hammon.

К 95 мл стерильного раствора Эрла до- 20 бавляют аминоэтоксиаэросил, предварительно простерилизованный сухим жаром и ри 160 — 170 С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого ско- 25 .Ia, предварительно прогретой при 56 С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия.

Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может хранится до применения в бытовом холодильнике. 30

Взвесь клеток Нер-2 при концентрации

300 тыс.кл,/мл BHocHT tl стерильные пенициллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч.до образования на дне монослоя. Десятикрат- 35 ные разведения вируса Коксаки В 6, штамм

Hammon вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при

37 С 60 мин, затем заливают 3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч 40 после выдерживания в термостате при

37 С, Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и учитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного клеточного моно- 45 слоя, Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выра>кается как БОЕ (бляшкообразующая единица).

В табл.6 приведены результаты титрования вируса Коксаки В.6, штамм Hammon в зависимости от концентрации аминоэтоксиаэросила и рН в среде покрытия.

Пример 7. Выявление вируса везикулярного стоматита, штамм Индиана.

К 95 мл стерильного раствора Эрла добавляют аминоэтоксиаэросил предварительно простерилизованный сухим жаром при 160 — 170 С в течение 1,5 ч, интенсивно встряхивают для образования взвеси, вносят 5 мл сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой при 56 С в течение 1 ч, добавляют бикарбонат натрия. Приготовленная среда покрытия стабильна в течение 6 мес и более и может хранится ri бытовом холодильнике до применения.

Взвесь клеток Нер-2 при концентрации

300 тыс.кл,/мл вносят в стерильные. пенициллиновые флаконы и выращивают под резиновыми пробками в течение 24 ч до образования на.:дне монослоя. Десятикратные разведения вируса веэикулярного стоматита, штамм Индиана вносят во флаконы с клеточным монослоем, инкубируют в термостате при 37 С 60 мин, затем заливают

3 мл среды покрытия. Результаты учитывают через 48 ч после выдерживания в термо-, стате при 37 С. Для учета результатов флакончики переворачивают вверх дном и учитывают число прозрачных пятен на молочно-белом фоне неповрежденного монослоя. Одна бляшка (прозрачное пятно) соответствует одной вирусной частице и выражается как БОЕ (бляшкообразующая единица).

В табл.7 приведены результаты титрования вируса везикулярного стоматита, штамм Индиана в зависимости от концентрации аминоэтоксиаэросила и рН в среде .покрытия.

Формула изобретения

Среда покрытия для выявления вирусов по бляшкообразованию, содержащая раствор.Э.рла, или среду 199 на растворе Эрла, сыворотку крупного рогатого скота,. бикарбонат натрия, о тл и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью повышения чувствительности и стабильности среды, она дополнительно содержит аминоэтоксиаэросил при следующих соотношениях компонентов:

Аминоэтоксиаэросил 0,03 — 0,05мас.%Бикарбонат натрия 0,2 — 0,3об.%

Сыворотка крупного рогатого скота 3,0-5,0 об,%

Раствор Эрла или среда

199 на растворе Эрла До 100 об.%

1694641

Т г x - учет невозможен из-за неспецифической регенерации клеточного монослоя; хх " учет затруднен иэ-эа низкой концентрации аминоэтоксиаэросила в среде (не хватает сорбента Лля покрытия. всего монослоя).

Т а б л и ц а 3

Приме чан не.

; х - учет невозможен из-за неспецифической дегенерации клеточного монослоя, хх - учет затрудне днен из-за низкой концентрации аминоэтоксиаэросила в среде н (не хватает сорбента для покрытия всего монослоя) .

Таблица 4 р и li B ч а и и е. х)- учет невозможен из-за неспецифической дегенерации клеточноi v монослоя хх - учет затруднен из-за низкой концентрации аминоэтоксиаэросила в среде (не хватает сорбента для покрытия всего монослоя)..

Примечание, х учет невозможен из за неспецифическон дегенерации клеточного монослоя; Таблица 2

xx - учет затруднен иэ-за низкой концентрации аминоэтоксиаэросила в среде (не хватает сообента аля покрытия всего монослоя).

1694641

Таблица 5 риме чан ие.

x - учет невозможен из-за неспецифической дегенерации клеточного монослоя; хх - учет затруднен из-за низкой концентрации аминоэтоксиазросила Т а б л и ц а в среде (не хватает сорбента для покрытия всего монослоя).

Примечание, х - учет невозможен из-за неспецифической дегенерации клеточногб монослоя; хх -.учет затруднен из-за низкой концентрации аминозтоксиаэросила в среде (не хватает сорбента для покрытия всего монослоя).

Таблица 7

П р и м е ч а н и е. х-учет невозможен из-за неспецифической дегенерации клеточного монослоя хх-учет затруднен из-за низкой концентрации аминоэтоксиаэросила в среде (не хватает сорбента для покрытия всего монослоя).

Корректор М.Демчик

Редактор М.Петрова Техред M,Ìîðãåíòàë

Заказ 4130 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101