Способ выделения тилозина

Способ выделения тилозина

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения антибиотика сельскохозяйственного назначения тилозина, а более конкретно - выделения тилозина из раствора. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и степени его чистоты. Способ включает обессоливание раствора с последующей сорбцией на катионите средней кислотности в натриевоводородной форме со степенью сшивки катионита 1 - 5%, н, а эмоцию проводят 1 - 2 н, фосфатным буферным раствором с pH 9,0 - 9,5. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения антибиотика сельскохозяйственного назначения тилозина, а более конкретно выделения тилозина из растворов. Цель изобретения повышение выхода целевого продукта и степени его чистоты. Способ осуществляют следующим образом. Культуральную жидкость продуцента тилозина предварительно подвергают обессоливанию. Наиболее эффективно обессоливание может быть проведено посредством электродиализа подщелоченной до значения рН 9,0-9,5 культуральной жидкости. Для электродиализа может быть использована, например, стандартная ячейка для электродиализа. Режимы электродиализа не имеют принципиального значения. В равной мере электродиализу может быть подвергнут фильтрат культуральной жидкости. В этом случае культуральную жидкость первоначально обрабатывают в течение 20-30 мин при рН 5,0-5,5 и 50-55^оС и отфильтровывают осадок. Значение рН фильтрата доводили до величины 9,0-9,5. После электродиализа содержание неорганических катионов снижается от 0,15 до 0,01 М, что позволяет осуществлять ионный обмен. Однако более глубокое освобождение от конкурирующих катионов возможно и может быть проведено. Обессоливание можно провести и иным методом, стремясь к снижению концентрации конкуpирующих катионов до величины 0,01 М и меньшей. Сорбцию тилозина осуществляют на катионите средней кислотности. Могут быть использованы, например, фосфорнокислые катиониты марки КРФ, в частности катионит КРФ-2 (фосфорилированный полистирол со сшивкой 2% дивинилбензола). Степень сшивки катионитов КРФ должна лежать в пределах 1-5% При более высоких значениях затруднена десорбция тилозина. Применяют катионит в смешанной водородно-натриевой форме. Катионит в водородной форме переводят в смешанную форму обработкой двумя объемами буферного раствора, представляющего собой 1 н. раствор гидроксида натрия, нейтрализованный фосфорной кислотой до значения рН 5,5, к которому прибавлен гидроксид натрия в количестве, эквивалентном половине емкости катионита, заполняющего колонку. Сорбцию ведут до насыщения катионита тилозином, а избыток диализата возвращают на следующий цикл сорбции. После завершения сорбции тилозина колонку промывают водой для удаления примесей. Десорбцию тилозина осуществляют 1-2 н. раствором фосфатного буфера с рН 9,0-9,5. Фракцию элюата, содержащую тилозин, собирают, контролируя пробы спектрофотометрическим методом. Концентрация тилозина в элюате составляет 90-100 г/л, рН элюата 7,5-8,0. Выход тилозина на стадии ионного обмена (учитывая стадию электродиализа) составляет 90-92% степень чистоты продукта 90-95% Полученный элюат может быть дополнительно очищен. Например, он может быть пропущен через колонку анионита АВ-17 в хлор-форме. Для извлечения тилозина элюат подщелачивают до рН 9,5 и нагревают при перемешивании при 35^оС в течение 30 мин, в результате чего выпадают белые кристаллы тилозина-основания, которые отфильтровывают и сушат. Выход готового продукта составляет 80-90% (от содержания в культуральной жидкости) при степени чистоты 90-95% При несоблюдении указанных условий поставленная цель не может быть достигнута, что подтверждается нижеприведенными данными. В табл. 1 показано влияние ионной силы раствора на степень десорбции тилозина и из представленных данных видно, что использование 1-2 н. раствора наиболее приемлемо. Влияние рН на степень десорбции тилозина показано в табл.2. Хотя эффективная десорбция тилозина может осуществляться в довольно широком диапазоне значений рН, предпочтительно использовать буфер рН 9,0-9,5, чтобы не затруднять дальнейший процесс нейтрализации. Попытки использовать иные буферные растворы, чем фосфатный буфер, положительных результатов не дали. Влияние природы элюирующего агента на степень десорбции тилозина приведено ниже. Десорбирующий Cтепень агент десорбции, 1 н. фосфатный буфер 97 1 н. боратный буфер 96 1 н. ТРИС буфер 97 П р и м е ч а н и е. Сорбцию тилозина проводили из обессоленной культуральной жидкости продуцента тилозина, содержащей 5,4 г/л тилозина. Использовалась ионообменная колонка диаметром 2,5 см и высотой 25 см, заполненная 20 мл катионита КРФ-4 в водородно-натриевой форме. Десорбцию осуществляли после промывания катионита водой. Общий объем элюента 180 мл. Поскольку фосфатный буфер является наиболее доступным и дешевым, он и рекомендуется для практического использования. Способ поясняется следующими примерами. П р и м е р 1. 3 л культуральной жидкости продуцента тилозина с активностью 6400 ед/мл с рН 7,5 подкисляют 15% НСl до рН 5,5, нагревают до 50^оС и перемешивают при указанной температуре 20 мин. При этом суспензия коагулирует и ее со скоростью 200 л/м²ч фильтруют через бельтинг/ткань под вакуумом. Осадок промывают 200 мл воды. После подщелачивания до рН 9,2 получают 3,25 л фильтрата с активностью 5800 ед/мл, который подвергают электродиализу. Электродиализ осуществляют в 3-камерной ячейке с размером сечения 25х25 см, снабженной 2-мя ионитовыми мембранами (катионитовой и анионитовой), подавая раствор снизу и отводя сверху со скоростью 700 мл/ч. Получают 3,3 л жидкости с активностью 5500 ед/мл, рН 9,4 и содержанием неорганических катионов 0,01 м. Обессоленную жидкость пропускают через колонку, загруженную 100 мл смолы КРФ-2 в смешанной водородно-натриевой форме со скоростью 300 мл в 1 ч. После появления тилозина в фильтрате (200 ед/мл) его собирают для следующего цикла. Культуральную жидкость вытесняют с колонны водой (2 объема). Получают 850 мл фильтрата с активностью 2500 ед/мл (1,7 г тилозина). Промывные воды не содержат тилозина. Для элюции тилозина через колонну пропускают сверху со скоростью 100 мл/час 200 мл 1 н. фосфатного буфера рН 9,5. Собирают 160 мл элюата с концентрацией тилозина 98 г/л (15,8 г тилозина) с рН 7,8. Раствор пропускают через колонну, загруженную 150 мл смолы АВ-17 в Сl-форме. Вывод тилозина контролируют спектрофотометрически. Получают 185 мл раствора с концентрацией тилозина 85 г/л. Раствор доводят до рН 9,5 щелочью, нагревают до 35^оС и поддерживают указанную температуру при перемешивании 30 мин. Выпавшие кристаллы фильтруют и промывают 30 мл нагретой до 35^оС воды с рН 9,5. После сушки получают 16,1 г белого порошка с содержанием тилозина 94% Выход 85% от исходного количества в культуральной жидкости. Выход на стадии ионного обмена составил 98,1% степень чистоты 95,2% П р и м е р 2. 3,4 л культуральной жидкости продуцента тилозина с активностью 5800 ед/мл подщелачивают до рН 9,5 и пропускают через электродиализатор, как это было описано в примере 1. Получают 3,3 л обессоленной жидкости с рН 9,2 и остаточным содержанием катионов 0,012 м. Сорбцию и элюцию проводят на той же колонне, как в примере 1, с той разницей, что промывку после сорбции ведут тремя объемами воды. Получают 190 мл элюата с содержанием тилозина 95 г/л и рН 7,7. После обработки на колонне с АВ-17 в Сl форме, как описано выше, получают 210 мл раствора с концентрацией тилозина 83,6 г/л. Раствор подщелачивают до рН 9,5 и выдерживают при перемешивании 30 мин при 35^оС. После фильтрации, промывки и сушки кристаллов получают 17,1 г препарата с содержанием тилозина 90% Выход 88% от исходного количества в культуральной жидкости. Выход на стадии ионного обмена составил 97% степень чистоты 91% П р и м е р 3. 3,5 л культуральной жидкости продуцента тилозина с активностью 5800 ед/мл подщелачивают до рН 9,0 и подвергают электродиализу в условиях примера 1. Получают 3,6 л обессоленного диализата с рН 9,2 и остаточным содержанием катионов 0,008 м. Сорбцию и элюацию проводят как описано в примере 1. Получено 175 мл элюата с содержанием тилозина 96,5 г/л и рН 8,2. Выход тилозина на стадии ионного обмена составил 97,5% степень чистоты тилозина 92% Раствор подщелачивают до рН 9,4 и выдерживают при перемешивании 30 мин при 35^оС. После фильтрации, промывки и сушки было получено 17,7 г препарата с содержанием тилозина 94,3% Общий выход препарата составил 82% от исходного количества в культуральной жидкости, степень чистоты 94,3% Предложенный способ по сравнению со способом-прототипом обеспечивает повышение качества продукта (90-95%-ная степень чистоты против 70-85%-ной) и его выхода (80-90% против 70-80%).

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ТИЛОЗИНА, включающий сорбцию из раствора с последующей элюцией с сорбента и кристаллизацией, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и степени его чистоты, перед сорбцией раствор подвергают обессоливанию, сорбцию осуществляют на катионите средней кислотности в натриево-водородной форме со степенью сшивки катионита 1 5% а элюцию проводят 1 2 н. фосфатным буферным раствором с рН 9,0 9,5.

РИСУНКИ

Рисунок 1

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 22-2001

(73) Патентообладатель:ООО "Аполлукс" (RU)

Договор № 12363 зарегистрирован 20.04.2001

Извещение опубликовано: 10.08.2001