Способ получения аффинных сорбентов для иммуноферментного анализа

Способ получения аффинных сорбентов для иммуноферментного анализа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к получению иммуносорбентов, используемых для анализа кортизола в биологических жидкостях человека и животных, а также в иммунобиотехнологии при получении и очистке антител против кортизола методом аффинной ароматографии. Изобретение позволяет создать сорбент, пригодный для анализа кортизола с повышенными емкостью и иммунореактивностью за счет того, что нитроцеллюлозные пленочные мембраны с диаметром пор 0,4-0,6 мкм активируют водным раствором периодата натрия с последующей иммобилизацией конъюгата бычьего сывороточного альбумина с кортизолом (I) или овальбумина с кортизолом (II), содержащим 9-36 молекул кортизола на молекулу белка. При этом массовое соотношение нитроцеллюлозной пленочной мембраны с конъюгатом I равно (97.6-99.4):(0,6-2,4), а с коньюгатом II (98,3-99.28):(0,72-1,7). 1 ил , 1 табл. сл с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4648841/05 (22) 06,02,89 (46) 23,12.91. Бюл. ¹ 47 (71) Институт биоорганической химии

АН БССР (72) Е.Н.Карасева, В.Л.Маркина, А.Н.Еремин и Д.И,Метелица (53) 677.465 (088.8) (56) Krysteva M.È., Blagov ЯЯ., Sokolov Т.Т.

J.Appl. Blochem, 1984, v. 6, N. 5 — 6, р, 367373. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АФФИННЫХ

СОРБЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА (57) Изобретение относится к получению иммуносорбентов, используемых для анализа кортиэола в биологических жидкостях человека и животных, а также в.иммунобиотехИзобретение относится к получению иммуносорбентов с использованием целлюлозного материала, которые могут быть использованы в иммуноферментном анализе кортизола в биологических жидкостях человека и животных для дифференциального диагноза ряда заболеваний эндокринной системы и контроля за их лечением, а также в иммунобиотехнологии при получении и очистке антител против кортизола методом аффинной хроматографии.

Целью изобретения является создание сорбента, пригодного для анализа кортизо ла с повышенными емкостью и иммунореактивностью.

Пример 1. К 330 мг нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ) (e форме кружков с диаметром 0,6 см и геометрической поверхно„„SU „„1700006 A1 (я)я С 08 В 15/06 // G 01 N 33/548 нологии при получении и очистке антител против кортизола методом аффинной ароматографии. Изобретение позволяет создать сорбент, пригодный для анализа кортизола с повышенными емкостью и иммунореактивностью за счет того, что нитрацеллюлозные пленочные мембраны с диаметром пор 0,4 — 0,6 мкм активируют водным раствором периодата натрия с последующей иммобилизацией коньюгата бычьего сывороточного альбумина с кортизолом (I) или овальбумина с кортизолом (1!), содержащим 9 — 36 молекул кортизола на молекулу белка, При этом массовое соотношение нитроцеллюлозной пленочной мембраны с коньюгатом. l равно (97,6-99,4):(0,6-2,4), а с коньюгатом li (98,3 — 99,28):(0,72 — 1,7). 1 ил., 1 табл, стью 0,565 см „массой 1,1 мг каждый) до2 бавляют 60 мл раствора перйодата натрия в С бидистиллированной воде и выдерживают: C) смесь 1,5 ч при комнатной температуре и С постоянном встряхивании. Для удаления („.) избытка окислителя приливают 6 мл I M 0, этиленгликоля и выдерживают смесь 10 мин. Сорбенты промывают 5 раз 0,1 М би- у, карбонатным буфером (рН 9,2) по 50 мл. К активированному сорбенту добавляют 16,5 мл раствора коньюгата овальбумина (OBA) с кортизолом (OBA-КОР-9) в концентрации

0,70 мг/мл. ОВА-КОР-9 — коньюгат, содержащий 9.молекул кортизола, получен известным способом реакцией ОВА с й-оксисукцинимидным эфиром 3-0-карбоксиметилоксима кортизола, взятого в избытке при 4 С в течение 18 ч и постоянном

1700006 перемешивании с последующим диализом против воды, Число связавшихся с ОВА кортиэолов определяют из спектров поглощения относительно нейодифицированного

ОВА, П р и и е р ы 2 — 18. Выполняют аналогично примеру 1 при различных соотношениях комгонентов. Данные по всем примерам сведены в таблицу, Через определенные промежутки времени определяк>т концентрацию белка в контактном растворе. По разности содержания белка в контактном растворе до реакции и после нее определяют количество белка, связавшегося с сорбентом, и рассчитывают содержание белка на

1 см геометрической поверхности сорбента, Через 18 ч раствор белка сливают, промывают сорбент 0,1 M бикарбонатным буфером, добавляют 50 мл КаВН4, выдерживают смесь 1 ч при комнатной температуре и постоянном встряхивании. Затем сорбент промывают 0,1 М фосфатным буфером (pH 7,4), содер>кащим 0,1% Твина-20, и

0,1 М фосфатным буфером с тем же рН, но без детергента, Приготовленный сорбент хранят в том же буфере при 4ОС, Сорбент не меняет свои" свойств в течение 6 мес.

П р и м е 919. Изучение иммунореактивности аффинных сорбентов на основе нитроцеллюлозных мембран и конъюгатов

DHA-КОР, К аффинным сорбентам 1 или 17 (таблица) в среде 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,05% Таина-20, приллвают по 50 мкл антисыворотки против кортизола (АНТИ-КОР) с разбавлением

1:300 и инкубируют смеси 2 ч, Затем добавляют к ним разные концентрации коньюгата вторых антител с глюкоэо-6-фосфатдегидрогеназой (втор, AT-Г6ФДГ), содержащего белковые компоненты в соотношении 1:1, и выдерживают смеси еще 2 ч. Раствор сливают и после промывки сорбентов к.ним добавляют 1 мл 0,1н. NaOH-глицинового буфера (рН 9,1), содержащего 1,0 мМ глюкоза-6-фосфата л 0,4 мМ НАДФ. Через 1 ч измеряют оптическую плотность растворов на длине волны 340 нм и регистрируют ее рост, соответствующий накоплению

НАДФ.Н в результате ферментативной реакции дегидрирования глюкозо-б-фосфата.

На чертеже представлена зависимость ферментативной активности тройных иммунных комплексов (OBA-КОР:АНТИКОР:втор. AT-Г6ФДГ) на аффинных сорбентах (в единицах оптической плотности

Аз4о) от концентрации- конъюгата втор. АТГ6ФДГ в контактном растворе: разведение

АНТИ-КОР 1:300; кривые 1 и 3 — аффинный

55 сорбент 17, кривая 2 — сорбент 1, кривая 3— использована неспецифическая сыворотка

KPGBM, Из приведенных графиков следует, что

0,03 мг/мл конъюгата "втор, AT-Г6ФДГ" достаточно для достижения максимальной скорости маркерной ферментативной реакции тройного иммунного комплекса ОВЙКОР;АНТИ-КОР;втор.AT-Г6ФДГ на аффинных сорбентах 1 и 17 двух типов (таблица). Неспецифическая сыворотка (кривая

3) не взаимодействует с ОВА-КОР на сорбенте и поэтому иммунный комплекс не образуется. Графики подтверждают высокую иммунореактлвность аффинных сорбентов на основе НЦМ и конъюгатов ОВА-KOP u практически полное отсутствие неспецифической сорбции белков иэ контактного раствора, содержащего иммуноглобулины и конъюгат "втор,-AT-Г6ФДГ".

Таким образом, предлагаемый аффинный сорбент сохраняет способность кортизола, включенного в его состав, взаимодействовать с айтителами против этого антигена, т.е, может быть применен в иммуноферментном анализе кортизола.

Способ получения аффинных сорбентов на основе нитроцеллюлозных мембран и конъюгатов кортизола с белками не требует дорогостоящих реагентов. Коньюгаты БСАКОР или ОБА-KOP обычно используются для иммунизации животных с целью выделения антисывороток против кортизола и могут быть применены также по другому назначению — для приготовления аффинных сорбентов.

Преимущество предлагаемых аффинных сорбентов заключается в том, что при использовании в качестве белкового компонента ОВА-КОР сорбент имеет минимальную неспецифическую сорбцию антисывороток, полученных после иммунизации животных коньюгатами БСА-КОР, так как белковые компоненты сорбента нс взаимодействуют с фракциями антись воротки, включающими иммуноглобулин против

БСА, Целесообразно использовать ОВАКОР, содержащие сорбенты,при работе с антисыворотками, полученными после иммунизации животных конъюгатами БСАКОР, и наоборот, при использовании антисывороток против ОВА-КОР лучше применять сорбенты на основе БСА-КОР, Преимущества предлагаемым сорбентам дает применение пленочных нитроцел-. люлозных мембран с пористой структурой и контролируемым размером nop: адсорбционная емкость НЦМ по отношению к белкам в 14 раэ выше, чем у полистирольных материалов (пробирок, планшетов и т,д.). Пред170000б ч а ю шийся тем, что, с целью создания сорбента, пригодного для анализа кортизола, с повышенными емкостью и иммунореактивностью, в качестве целлюлозного

5 материала используют г>итроцеллюлоэные пленочные мембраны с диаметром пор 0,40,6 мкм, а для иммобилизации — конъюгат бычьего сывороточного альбумина с кортиэолом (I) или овальбумина с кортизолом (П}, 10 содержащий 9 — 36 молекул кортизола на

1 молекулу белка, при массовом соотношении нитроцеллюлоэной пленочной мембраны и конью гата I соответственно (97,60=,99,40):(0,60-2,40) и нитроцеллюлоэ15 ной пленочной мембраны и коньюгата II (99,28, 98,30):(0,72 — 1,70). лагаемые сорбенты могут иметь любую необходимую форму и особенно перспективны в качестве иммунореактивных носителей в методе индикаторных полос при разработке STATанализов и создании самодиагностикумов.

Полученные сорбенты позволяют определять концентрации кортизола в сыворотке крови в интервале концентраций

10 -10 моль/л.

Формула изобретения

Способ получения аффинных сорбентов для иммуноферментного анализа, включающий обработку целлюлозного материала водным раствором перйодата натрия и последующую стадию иммобилизации на полученном активированном носителе, от л иСорбент Нитроцеллюловные мембраны

Диаметр пор, Вес, мг мкм в

Белковые конъюгаты

Связанный Нассовое соотнобелок с аение НЦН: конъюгат одной стор и НЦИ, кг/см е

Время реакции, ч

Объем контактного раствора, мг

Число моле- мг/мл кул KOP

БСА - бычий сывороточный альбумин.

2

4

6

8

1О

11

1г 13

,14

16

17

0,4-0,5

0,5-0,7

0>5"О 7

0,5-0,7

0,5-0,7

0,5-0,7

0,5-0,7 о,5-о,7

0,5"0,7

0,5-0,7 о,5-о,7

0,5-0,7

0,5-0,7

0,4-0,5 о,4-О,5

0 5-0,7

0,4-0,5 о,4-0,5

33о

4о

Бо

1ZO

1го

1го

4о

430

ОВА-9

БСА"35

БСА-35

БСА-35

6СА-35

БСА-35

БСА-35

БСА-9

БСА-9

БСА-9

БСА-9

БСА-24

БСА-32

БСА-43

БСА-32

БСА-35

ОВА-20 овА-36

0,70

0,66

0,50

О,z4

0,60

В,ZO о,76

0,94

0,75 о,40

0,21

o,sz

0,82

0,63 о,63

1,18

0,72

0,75

i6,5

5,0

5,0

5,0

7,5

7,5

iZ,0

6,0

6,0

6,0

6,0

6,о

6,0 го,о

16,0

5,0

16,5

15,0

i8

4

4

4

16

16

16

16

16

16

16

16

is

0,0079

0,0221

0,0205 о,о143

0>0196

0,0093

0,0096

0>0102

O,0OSO

0,006о

0,0035

О,Î108 о,o132

0,0098

0,0067

0,0246

0 ° оо79 о,0173

99,28:0,72

97 78:2,22

97, 93:2,07

98>55:i,45

98,03:1,97

99,05:0,95

99,oz:o,98

98,97:i о3

99,18: 0,82

99;39:0,61

99,40:0,60

98,90:1,10

98,66:1,34

99, 06: 0,94

99 32:0 68

97,6î:2,40

99,28: 0,72

98,30:1,7î

1700006

ЙИ ОО

В)пО Р. ДT- Яфф/- pgg g

Составитель О,Рокачевская

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор В.Гирняк

Редактор И.Дербак

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4441 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5