Способ диагностики инфицированности плодов овец вирусом лейкоза крупного рогатого скота

Способ диагностики инфицированности плодов овец вирусом лейкоза крупного рогатого скота

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и иммунологии, Б частности к разработке экспресс-способа диагностики инфицированное™ вирусом лейкоза плодов сельскохозяйственных животных в ранние сроки после заражения. Целью изобретения является повышение точности способа и повышение проницаемости плацентарного барьера. Для этого из проб крови суягных овец получают лейкоконцентрат, разводят питательной средой Игла до концентрации 107-109 кл/мл, смешивают с флуоресцеин изотиоционатрм (ФИТЦ) в соотношении 0,08-0,1 мг/мл взвеси клеток, инкубируют в термостате при36-38°С 13-15 мин, отмывают средой Игла до получения чистых меченых клеток и внооь вводят овцематкам внутривенно в 3,0-8,0 мл при концентрации 1011-1013 меченых клеток на 1 мл среды, через 3-12 ч овцематок убивают, от них и их плодов берут пробы крови, делают мазки и мазки-отпечатки из внутренних органов , которые фиксируют 59-61 %-ным ацетоном на насыщенном растворе трилона Б в течение 1 мин и учет результатов проводят по наличию меченых клеток в испытуемых пробах. Предварительно, перед введением меченых клеток, для повышения проницаемости плацентарного барьера вводят внутривенно пирогенал (официальный препарат) в дозе 0,024-0,026 мг/кг массы животного. Для уточнения диагноза На инфицйрованность плода ВЛ КРС проводят постановку биопробы на ягнятах. 2 з.п. ф-лы. С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (н)з А 61 К 39/12 ф Цф

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ- КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ ССЧР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . -К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

> о

2 (21) 4?39194/13 (22) 20.09.89 (46) 07.01.92. Бюл. М 1

1 с (71} Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.P.Koâàëåíêo (72) Л.Г.Бурба, Ы.И. Гулюкин, Л.А.Иванова, С.В.Колина, А.B.Âañèí и Л.А. Кудрявцева (53) 616-07(088,8) . (56) 1.Schnorr К. L et. а!. !м. Archs. Allergy

Арр!. lmmun. 1983, 72, 3, 239 — 242.

2.0hshima К. et. а!. lpn.J. Vet. Scl., 1982, 44, 76, 479 — 488. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФИЦИРОВАННОСТИ ПЛОДОВ ОВЕЦ ВИРУСОМ

ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и иммунологии, в частности к разработке экспресс-способа диагностики инфицированности вирусом лейкоза плодов сельскохозяйственных животных в ранние сроки после заражения. Целью изобретения является повышение точности способа и повышение проницаемости плацентарного барьера. Для этого из проб крови суягных

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и иммуйологии, в частности к разработке экспресс-способа диагностики инфицированности вирусом лсйкоза плодов сельскохозяйственных животных в ранние сроки после заражения.. Лейкозы относятся к хроническим HH фекционным заболеваниям опухолевой природы — гемоблг тозам, основным признаком которых. является згокачественное (,Ml„) 1793120 Al овец получают лейкоконцентрат, разводят питательной средой Игла до концентрации

107-10 кл/мл, смешивают с флуоресцеин изотиоционатом (ФИТЦ) в соотношении

0,08-0,1 мг/мл взвеси клеток, инкубируют в . термостате при 36 — 380C 13 — 15 мин, отмывают средой Игла до получения чистых меченых клеток и вновь вводят овцематкам внутривенно в объеме 3,0 — 8,0 мл при концентрации 10 — 101з меченых клеток на 1 мл среды, через 3 — 12 ч овцематок убивают, от них и их плодов берут пробы крови, делают мазки и мазки-отпечатки из внутренних органов, которые фиксируют 59-61%-ным ацетоном на насыщенном растворе трилона Б в течение 1 мин и учет результатов проводят по наличию меченых клеток в испытуемых пробах. Предварительно, перед введением меченых клеток, для повышения проницаемости плацентарного барьера вводят внутривенно пирогенал (официальный препарат) в дозе 0,024-0,026 мг/vr массы животного. Для уточнения диагноза на инфицированность плода ВЛ КРС проводят постановку биопробы на ягнятах. 2 з.п. ф-лы.

О разрастание клеток кроветворных органов с. нарушением их созревания, Возбудитель лейкоза крупного рогатого скота — вирус лейкоза крупного рогатого скота — PHK — содержащий онкогенный ретровирус. О путях и чаетоте передачи вируса от больных здоровым животным среди исследователей нет единого мнения. Общепризнано, что перенос вируса лейкоза путем гQMBTo-õðîèoñîìíoé трансмиссии не происходит. В последнее время исследова1703120 тали стали обращать внимание fÿ трансплацентарцый путь передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота, интегрированного с ДН К лимфа ц«гов, матери — плоду.

B связи с зтим разработка надежного способа определения проникновения через плацеитариый барьер материнских лимфоцитов, содержащих геном ВЛ КРС в плод, является актуальной проблемой расшифровки механизма прохождения вируса чераз пла 1еиту и обиарч ж е йи е его в организме плода в более ранние сроки, когда специфические антигены к нему серологическим методом ие выявляются.

Известен способ изучения циркуляции крови в плацаите путем введения в сосуды рентгенрконтрастиых веществ — кордиотраст, а ак:-.е определения проницаемости сосудов на основе в щтривениого введения беременным животным витальных красителей — трипановой сини. туши и ряда других.

Но применение их дсытаточио трудоемко и ие удобно в работе.

Для изучения циркуляции клеток в кровеносной системе, распределение их в кро.веносных сосудах тканей, в последнее время используют мечение клеток флуоресцеин изотиоционатои (БЛИТЦ), который не влияет на морфофункциональиые cBQAcTBQ клеток (1j

Известен также способ диагностики иифицированиости плодов ВЛ КРС по обнаружению антител к аитигенам р-24 и др 69 ВЛ

КРС и РИД в сыворотке крови новорожденных, взятой до скармливания им молозива.

У 5 из 15 исследованных плодов (33,3-",ь) от инфицированных ВЛ КРС коров-матерей исследователи отмечали наличие антител к вирусу лейкоза в ГИД. У одного плода антитела обнаруживали в более высоком титре, чем у коровы-матери. при этом отмечали инфильтрацию опухолевыми клетками матки и плодной части плацаиты у отдельных инфицированных плодов (2).

Недостатком данного способа является то, что нарушение плацантарного барьера и инфицирование плодов ВЛ КРС определяли ретроспективно путем обнаружен«я в сыворотке их крови антител к вирусу лейкоза, не выявляя вирус. Общепризнанно, что антитела к вирусу обиаруживзют в основном через два месяца после заражения. РИД в этот пар«од бывает ложноотрицательной и плод оценивают как свободный от ВЛ КРС, т. е. иедовыявляют некоторых животных-вирусоноситслсй.

Цель изобретения — повышение точности, и повышение проницаемости плацантарного барьера.

Поставленная цель достигается благодаря тому, что из крови овцы получают лейкоконцентрат, разводят аго питательной средой Игла до концентрации 10 -10

5 кл/мкл, смешивают с флуоресцеином изоти-. оцианатом (ФИТЦ) в соотношении 0,08-0,1 мгlмл взвеси клеток, инкубируют в термостате при 36-38 С в течение 13 — 15 мин, отмывают средой Игла до получения чистых

10 меченых клеток и вновь вводят овцематке внутривенно в количестве 3,0-8,0 мл при концентрации 10 -10 меченых кл/мл сре11 1з ды, через 3-12 ч овцематку убивают, от иее и от плода берут пробы крови, делают мазки

15 и мазки-отпечатки из внутренних органов, которые фиксируют 59-61 g,-ным ацетоном на иасыьцеином растворе трилона Б в течение

1 мии и учет результатов проводят по наличию меченых клеток в испытуемых пробах. Пред20 нарительно для повышения проницаемости плацентарного барьера овцематке вводят внутривенно однократно пирогенал (официальный препарат) в дозе 0,024 — 0,026 мг/кг массы животных. Для уточнения диагноза иа

25 инфицированность плода ВЛ КРС проводят постановку биопробы на ягнятах.

Предложенный способ состоит в следующем.

От инфицированных ВЛ КРС суягных

30 овец(иифицированность ВЛ КРСовецопределяли по наличию внутреннего белка р24

ВЛ KPC в краткосрочной культуре лейкоцитов крови зтих овец) берут кровь и проводят выделение из крови лейкоцитов методом ли35 зиса зритроцитов. Затем полученные лейкоциты трижды отмывают стерильной средой

Игла от остатков зритроцитов, расуспанлируют в среде Игла, К взвеси клеток (1х10—

-1х10 кл/мл взвеси) добавляют флуоресцин я, 40 изотиоционат (ФИТЦ) в расчете 0,08-0,1 мг/мл взвеси лейкоцитов и инкубируют в термостате при 36,0-38,0 С в течение 13-15 мии. Затем отмывают клетки средой Игла от несвязанного с ними красителя и осаждают

45 его центрифугирован«ам при 1000 об./мин в течение 45 мин. Лайкоконцентрат ресуспанцируют средой Игла до концентрации

10 -10 меченых клеток в 1 мл среды и з вводят внутривенно овцам. Каждой овце

50 вводят лейкоциты кров«. выдаланиыа из ее крови. С целью говышания проницаемости плацантарного барьера двум из трех овец внутр«ванн6 прадвар«тельно взодят пироганал в дозе 0.024-0,026 мг/кг массы живо55 тного. Через 3-12 ч животных убивают и от овец и «х плодов берут пробы крови, делают мазки и мазки-отпа атки из внутренних органов, которые фикс«руют 59-61 j> ацетоном иа насыщенном раствора трилона Б в тсчен«е 1 мин. Одновременно от плодов бе1703120 рут кусочки органов и тканей, фиксируют общепринятым способом для дальнейшей проводки и заливки в уплотняющие средй.

Для подтверждения диагноза на инфицированность плодов ВЛ @PC кровь от исследу- 5 емых плодов вводят внутрибрюшинно ягнятам, свободным от ВЛ КРС (ставят био. пробу).

Учет результатов на инфицированность плодов и роводя г по наличию меченых кле- 10 ток в мазках-отпечатках из органов плода (просмотр проводят на люминесцентнам . микроскопе) и по положительным результа- . там биопрабы.

П р и и е р 1. От трех овец получали 15 кровь, выделяли лейкоконцентрат, разводили средой Игла до концентрации 10 кл/мл, смешивали с ФИТЦ в соотношении 0,1 мгlмл взвеси клеток, инкубиравали в термостате при 38 С в течение 15 мин, отмывали 20 средой Игла от остатков несвязанного . - ФИЩ и вводили овцематкам внутривенно в количестве 8,О мл при концентрации 101з меченых клеток в 1 мл среды. Через 12 ч овец убивали, от овец и от их плодов брали 25 кровь, делали мазки-отпечатки из внутренних органов, которые фиксировали 61%ным ацетоном иа насыщенном растворе трилона Б в течение 1 мин и просматривали в люминисцентиом микроскопе. Двум ов- 30 цам предварительна, до введения лейкоци. тов крови, мечеиных ФИТЦ, внутривенно однократно вводили пирагенал в дозе 0,026 мг/кг массы животного. Сыворотку крови .. плода. и овцы-матери исследовали в РИД, 35 кровью плодов (гепаринизированной) ставилии би оп робу на я гнятах.

Отмечали активное свечение меченых клеток в мазках-отпечатках медиальных подвздашных лимфоузлов, единичные в 40 матке. в межворсинчатам пространстве плаценты. У овец, которым вводили пирогенал, находили интенсивное свечение в лимфаузлах, матке, между клетками эпителия хориона, в страме ворсин. В сыворотке кро- 45 ви плодов и овец-матерей антител к ВЛ КРС обнаружено не была. От плодов двух овец, которым вводили пирагенал, биапраба была положительной.

П р и и е р 2. От трех овец получали 50 кровь, выделяли лейкаконцентрат, разводили средой Игла до концентрации 10 кл/мл, смешивали с ФЫТЦ в соотношении 0,08 мг/мл взвеси клеток, инкубиравали B термостате при 36 С в течение 13 мин, отмывали 55 средой Игла ат остатков несвязаннога

ФИТЦ и вводили овцематкам внутривенно и в количестве 3.0 r,n при концентрации 10 меченых клеток в 1 мл среды. Через 3 ч овец убивали, от овцы и ее плодз брали кровь, делали мазки-отпечатки из внутренних органов, которые фиксировали 59%-ным ацетоном на насыщенно л растворе трилана Б в течение 1 мин и просматривали 0 люминесцентном микроскопе. Двум овцам предва-. рительно, до введения лейкоцитов крови, меченных ФИТЦ. внутривенно однократно вводили пирогенал в дозе 0,024 мг/кг массы животного, Сыворотку крови плода и овцыматери исследовали в РИД, кровью плодов (гепаринизированной) ставили биопрабу на ягнятах.

При осмотре мазкОв-отпечатков в люминисцентном микроскопе находили единичные светящиеся клетки в матке, межворсинчатом пространстве, У плодов двух овец, которым вводили пирогенал, находили меченые клетки в мазках-отпечатках из пуповины. В сыворотке кропи плодов и овец-матерей антител и ВЛ КРС обнаружено не было. От плодов двух овец, которым вводили пирогенал, биопроба была положительной.

Пример 3. От трех овец получали кровь,выделялилейкоконцентрат, разводили средой Игла да концентрации 10 кл/мл, смешивали с ФИТЦ в соотношении 0,09 мг/мл взвеси клеток, инкубировали в термостате при 37 С в течение 14 мин, отмывали средой Игла ат остатков несвязанного

ФИТЦ и вводили овцематкам внутривенно в объеме 5,0 мл при концентрации 10 меченых клеток в 1 мл среды. Через 6 ч убивали, ат овцы и ее плода брали кровь, делали мазки-отпечатки из внутренних органон, которые фиксировали 60 g ным ацетоном на насыщенном растворе трилана Б в течение

1 мин и просматривали в люминесцентном микроскопе. Двум овцам предварительно, до введения лейкоцитов крови, меченных

ФИТЦ, внутривенно однократно вводили пирагенал в дозе 0,025 мг/кг массы животного. Сыворотку крови плода и овцы-мате- . ри исследовали в РИД, кровью плодов (гепаринизированнай) ставили риопрабу на ягнятах.

При просмотре на люминесцентном микроскопе находили свечение меченых клеток в мазках-отпечатках медиальных подвздашных лимфоузлав (незначительное), в матке, в межварсинчатам пространстве. У пладан двух овец, которым вводили пирогенал, — сроди клеток эпителия хариана, в печени. В сыворотке крови плодов и овец-матерей антител к ВЛ КРС обнаружена не была. От плодов двух анец, которым вводили пирагенал, био- пробэ была положительной, Все пробы материала от девяти авсц и от их плодов фиксировали общепринятым методом с последующей проводкой и залив7

1703120

Составитель И. Гареева

Техред M,Маргентал Корректор Л, Бескид

Редактор Г, Гербер

Заказ 12 Тираж .Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательскиЙ комбинат "Патент", r. Ужгород, yn,Ãeãàðèíà, 101 кой в парафин. Затем Готовили гистосрезы, в которых при просмотре на люминесцентном микроскопе искали святящиеся (мечен ные ФИТЦ) лейкоциты крови, У всех плодов от овец, у которых повышали проницаемость плацентарного барьера, отмечали HBличие светящихся материнских клеток, биопроба отэтих плодов нв наличие ВЛ KPC была положительной. .Число обнаруженных меченных ФИТЦ лейкоцитов, введенных овцематкам, зависело от числа введенных клеток и времени от момента их введения до уб : животных.

Мазки-атпечат ";Оказались более быстрым и поост.Тй в исполнении диагностическим

1риемом по выявлению светящихся клеток по сравйеиию с обработкой материала для заливки в уплотня ощие среды (парафин), приготовленис срезов и последующим их просмОтром в люминесцентном микроскопе. предложенный сйособ позволяет вйявлять проникновение в плод материнских лимфоцитов, содержащих ВЛ КРС, и тем самым задолго до. выработки организмом плода антител к ВЛ КРС судить об инфицированности его этим вирусом.

Способ прост в исполнении благодаря использованию мазков-отпечатков, в которых Определяют меченные ФИТЦ клетки.

Предлагаемый способ найдет применение в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся профилактикой и борьбой с лейкозами.

Формула изобретения

1. Способ диагностики инфицированности плодов овец вирусом лейкоза крупного рогатого скота, включающий отбор крови у

5 овцематок с последующим убоем и забором крови и внутренних органов у плода, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, из крови овцематок готовят лейкоконцентрат, разводят его средой I0 Игла до концентрации 107-10 кл/мл. смешивают с флуоресцеином изоти оционатом в количестве 0,008-0,1 мг/мл лейкоконцентрата, инкубируют при 36-38 С в течение.

13-15 мин, отмывают средой Игла и вновь

15 вводят овцематке внутривенно в количестве

3,0-8,0 мл при концентрации 1011-10 кл/мл среды, через 3-12 ч овцематку убивают, из внутренних органов плода делают мазки-отпечатки, которые фиксируют 59-.

20 61 $-ным ацетоном на насыщенном растворе трилона Б в течение 1 мин, и при наличии меченых клеток в испытуемых пробах диагносцируют инфицированность плодов вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

25 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью повышения проницаемости плацентарного барьера, овцематке перед введением меченых клеток внутривенно однократно вводят пирогенал в дозе 0,02430 0,026 мг/кг массы животного.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения точности, дополнительно проводят постановку биопробы на ягнятах.