Рекомбинантная плазмидная днк @ -1 @ 1-13, кодирующая синтез фибробластного интерферона ( @ i) человека, способ ее конструирования, штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент @ i-интерферона человека

Рекомбинантная плазмидная днк @ -1 @ 1-13, кодирующая синтез фибробластного интерферона ( @ i) человека, способ ее конструирования, штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент @ i-интерферона человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности. Цель - повышение уровня фибробластного интерферона (б 1) человека в клетках штамма-продуцента . Сконструирована рекомбинантная плазмида pPR-IFN/3 1-13, которая обеспечивает регулируемый синтез фибробластного интерферона человека в клетках E.coli под контролем промоторно-операторной области PRORбактериофага А. С помощью плазмиды pPR-lFN / 1-13 получен штамм E.coli ВНИИГенетика vl.903 (pPR-IP№1-13), продуцирующий фибробластный интерферон в количестве 2 -109 международных ед. интерферона на 1 л бактериальной культуры , что составляет около 10% от суммарного клеточного белка. 3 с.п. ф-лы. (/)

СОВХОЗ СОВЕ1СКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ! г ь1

) (21) 4191345/13 (22) 09,02.87 16) 07.01.92. Бюл. N 1 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) B.Ã.Äåáaáoâ, Ю.И.Козлов, С.В.Машко, А.Я.Стронгин, B.Ý.Ñòåðêèí, В.Л.Юрин, М.И.Лебедева, М.Э.Трухан, С.М. Подковы ров, А.Л.Лапидус, А.B.Ìî÷óëüñêèé, Л.С.Изотова, А.С Рыжавская, А.П.Алексенко, С.В,Костров, M.А.Скворцова, В.В.Гервинкас, Е.А.Носовская, Л.В.Евдонина. В.А.Лившиц, В,-А.В.БуМ ял ис, С.И. Борухов, Т. Г. Плотникова, А,П,Болотин и Э.-А.А.Янулайтис (53) 575.224; 577.2 (088.8) (56) Nucleis acids Research, 1983, ч. 11, р. 467-4688. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

PHK pPR-IFNP 1 13, КОДИРУЮ!ЦАЯ Ci/IHТЕЗ ФИБРОБЛАСТНОГО ИНТЕРФЕРОНА

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, молекулярной биологии и генно-инженерной биотехнологии и представляет собой сконструированную рекомбинантную плазмидную ДНК, обеспечивающую микробиологический синтез фибробластного интерферона человека, способ ее конструирования и штамм Е.coli, содержащий эту рекомбина нтную плаэмиду,— п родуцент P Iинтерферона человека.

Целью изобретения является повышение уровня фибробластного интерферона человека в клетках штамма-продуцента.

Новая плазмида pPR-)FN P 1 — 13, которая имеет длину около 3.9 тыс.н.п., обеспе„„5U„„1703692 А1

31) ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ, ШТАММ БАКТЕ РИЙ

ЕSCHERICHIA СО! — ПРОДУЦЕНТ J8 I-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности.

Цель — повышение уровня фибробластного интерферона (В 1) человека в клетках штамма-продуцента. Сконструирована рекомбинантная плазмида pPR-IFN j31-13, которая обеспечивает регулируемый синтез фибробластного интерферона человека в клетках

Е.coll под контролем промоторно-операторной области рровбактериофага A. С помощью плазмиды pPR-IFN P 1-13 получен штамм

Е.со!! ВНИИГенетика vI. 903 (pPRIFN41--13), продуцирующий фибробластный интерферон в количестве 2 10 международных ед. интерферона на 1 л бактериальной культуры, что составляет около 10 (, от суммарного клеточного белка. 3 с.п. ф-лы. чивает экспрессию гена IFN f3) под контролем регуляторной области pRoR бактериофага А, состоит из большого (3,4 т.н.п.)

ВамН1-BgLII-фрагмента векторной плазмиды pPR124, модифицированной введением в ее состав олигонуклеотидного BgLII-линкера, и EcoRl-Sau3A-фрагмента плазмиды

plNP-1гр-7 длиной 510 н.п.

Способ конструирования рекомбинантной плазмиды pPR-IFN P 1-13 заключается в том, что в состав вектора pPR124 с помощью олигонуклеотидного линкера вводят уникальный участок узнавания рестриктазы

BgLII, затем образующуюся таким образом плазмиду pPR124B расщепляют рестрикционными эндонуклеазами EcoRI u BgLII u

1703692

55 проводят соединение большего из образующихся фрагментов векторной молекулы с

ЕсоИ-Sau3A-фрагментом, содержащим кодирующую часть зрелого P I-интерферона иэ плазмиды plNP-trp7, в полученной таким образом рекомбинантной плаэмиде pPRIFNP 1-123 проводят сближение SD-последовательности гена сго и первого кодона/3 I интерферона, для чего плазмидную ДНК гидролизуют рестриктазой BamHI, удаляют часть нуклеотидов с помощью экэонуклеазной активности ДНК-полимеразы I Е.coli, расщепляют ДН К рестриктазой EcoRI, обрабатываютт Sl-эндонуклеазой с последующим полным восстановлением двуцепочечных концов с помощью Кленовского фрагмента

ДНК-полимеразы I Е.coli и обеспечивают циклизацию образовавшихся линейных молекул ДНК ДНК-лигазой фага Т4, Полученным препаратом трансформируют клетки

Е.coli С.600, отбирают трансформанты на среде с ампициллином при культивировании клеток при 28 С с последующей селекцией на пониженную скорость роста при

42 С. Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмидную ДН К.

Штамм Е.coli ВНИИгенетика V4 903 (pPR-IFN P I-13), регистрационный номер

1825, в коллекции культур микроорганизмов

Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков — продуцент фибробластного (P I) интерферона человека.

Штамм получают трансформацией

Е.coli ВНИИгенетика VL903 (ВКПМ В-3546) рекомбинантной плазмидой pPR-IFN  I-13 с последующим отбором рекомбинантных клонов на среде с ампициллином при 28 С и определением активности фибробластинтерферона в экстрактах клеток рнсформантов после дерепрессии PRпромотора, достигаемой культивированием ш; i ма в течение 1 — 12 ч при 42 С. В качестве реципиента могут быть также использованы штаммы Е.coli С600, Е.coli

ВНИИгенетика Ч 902 и другие производные Е.coli К12.

Штамм Е.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IFNP I-13) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы (1,2-1,6) х х(2,0 — 6,0) мкм, слабоподвижные, способные к образованию нитевидных форм, грамотрицательные, неспороносные, Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на плотных и жидких простых синтетических, полусинтетических и комплексных средах. При росте на агаризованном бульоне Хоттингера или L-бульоне

50 образуют ослизненные, круглые, слабоматовые колонии. При выращивании в жидких средах типа L-бульона или М9 с казаминовыми кислотами образуют равномерную взвесь.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки способны к росту в диапазоне 540 С (оптимум 35 С) при рН 6,7 — 7,5. В качестве источника углерода используют аминокислоты и углеводы (например сахарозу), Источником азота могут служить минеральные соли в аммонийной форме. а также органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта и аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам. Штамм устойчив к ампициллину в концентрации до

100 мг/л при выращивании в жидких и на агаризованных питательных средах.

Стабильность плазмиды. При хранении клеток на агаризованной среде (сроком до одного месяца), при серии последовательных пересевов (в течение не менее 6 месяцев) и в процессе глубинного культивирования в жидкой среде с антибиотиком не происходят потери и перестройки плазмиды, Пример 1, Конструирование рекомбинантной плазмиды pPR-IFN ф 1-13.

Рекомбинантную плазмиду рРЯ-(РМ/3 I13 получают в несколько этапов.

Этап — конструирование векторной плазмиды pPR124B.

3 мкг ДНК плазмиды pPR124 расщепляют рестриктаэой ХЬа) в 70 мкл буфера для рестрикции — I, содержащего 10 мМ трисHCI, рН 7,9, 6 мМ MgClz, 6 мМ 2-меркаптоэтанола, 150 мМ NaCI, ДНК переосаждают двумя объектами этанола. Осадок растворяют в 15 мкл НгО, Достройку одноцепочных

3-концевых участков ДНК проводят обработкой Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы IE.coli в пробе объемом 20 мкл, содержащей 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 10 мМ

MgClz, 2 мкг препарата ДНК, по 30 мкМ деэоксирубонуклеозидтрифосфатов, 5 ед. феамента, ДНК из реакционной смеси переосаждают этанолом и растворяют в 100 мкл

Н О.

Воссоединение линеаризованной плазмидной ДНК с Bgtll-линкерами проводят при 16 С в течение 12 ч с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в пробе, содержащей буфер для лигиаования (60 мМ трис-HCI рН 7,6, 10 мМ MgClz, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,4 мМ АТФ), 2 мкг плаэмидной ДНК и

0,5 мкг линкеров. После проведения лигирования ДН К из реакционной смеси осаждают этанолом, растворяют и подвергают фер1703692 ментативному гпдролизу рестриктазой Bg(ll в пробе объемом 40 мкл, содержащей буфер для рестрикции — 2 (6 мМ трис-HCI pH

7,6, 6 мМ МЕСЬ, 6 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мМ NaCI). ДНК вновь осаждают этанолом, растворяют, 1 мкг препарата плазмидной ДНК в 240 мкл буфера для лигирования обрабатывают ДНК-лигазой

Т4. Полученной смесью трансформируют клетки Е.coll С600.

Эффективность трансформации составляет до 5 10 колоний на 1 мкг нативной плазмиды pPR124. Отбирают клоны, устойчивые к ампициллину (100 мкг/мл), из них выделяют плазмидную ДН К и используют ее для рестрикционного анализа. В результате получают плазмиду pPR1248, которая в отличии от исходной векторной молекулы

pPR124 содержит уникальный участок расщепления Bgl вместо имевшейся последовательности узнавания.

Этап 2 — конструирование промежуточной плазмиды pPR-IFNP I-123.

В состав вектора pPR1248 интегрируют кодирующую последовательность фибробластного интерферона человека из плазмиды p IN P-trp-7, Для этого 10 мкг ДН К plN

P-trp-7 обрабатывают совместно рестриктазами Е.coRI и Sau3A в пробе объемом 100 мкл, содержащей буфер для рестрикции — 2, Полученный препарат наносят на гель 1 1 ной легкоплавкой агарозы и подвергают электрофорезу в трис-ацетатной буферной системе. Полоску геля, содержащую фрагмент ДНК длиной 510 н.п.. вырезают и ДНК элюируют из геля.

Полученный таким образом фрагмент

ДНК (1 мкг) интегрируют.в плазмиду

pPR124B. Для чего 1 мкг ДНК pPR1248 расщепляют рестриктазами EcoRI u Bgfll в пробе объемом 20 мкл в буфере для рестрикции — 2. Полученный препарат подвергают фенольной депротеинизации, ДН К осаждают этанолом и растворяют в 10 мкл

Н О.0,5 мкг ДНК расщепленной плазмиды

pPR124B объединяют с 1 мкг выделенного фрагмента плазмиды plN j3-trp-7 и обрабатывают ДНК-лигазой Т4 в пробе объемом

30 мкл, в буфере для лигирования. Полученным препаратом ДНК проводят трасформацию клеток Е.coll С600 с отбором трансформантов на среде с ампициллином с последующей селекцией Cm -клонов на среде с 200 мкг/мл хлорамфеникола при культивировании клеток при 42 С.

Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмидную ДНК и исследуют с помощью рестрикционного анализа, В полученной плазмиде Е.coRI — Bgfll-фрагмент.

55 кодирующий С-концевую часть хлорамфениколацетилтрансферазы в составе вектора

pPR124B, замещен на кодирующую последовательность зрелого /3 I-интерферона человека, Данная плазмида обозначена

pPR-IFN j3 I-123.

Этап 3 — конструирование плазмиды

pPR-IFN j3 l-13, 30 мкг ДНК плазмиды pPR-IFN P 1-123 расщепляют рестриктазой BamHI в 150 мкл буфера для рестрикции — 1, ДНК подвергают фенольной депротеинизации и осаждают этанолом. Осадок растворяют в 40 мкл НрО, Для ограниченной деградации ДНК с помощью 3 -5 экзонуклеазной активности

ДНК-полимеразы 1 Е.coll полученный препарат ДНК инкубируют в пробе объемом 150 мкл содержащей 50 мМ трис-HCI, рН 8,0, 10 М ЭДТА; 5 мМ MgClz, 100 мкМ ДАТФ, а затем дГТФ и 20 ед. ДНК-полимеразы.

Реакцию останавливают, проводят переосаждение ДНК и осадок вновь растворяют в 40 мкл НгО. 10 мкг полученного препарата обрабатывают рестриктазой Е.coRI e 50 мкл буфера для рестрикции — 2, проводят фенольную депротеинизацию, осаждение

ДНК этанолом и растворяют осадок в 30 мкл.

Удаление однонитевь х концевых участ ков полученного препарата ДНК проводят при помощи эндонуклеазы 1 в пробе объемом 100 мкл, содержащей 30 мМ

СНзСООМа, рН 4,4,-4,5 мМ ZnS04, 250 мМ

NaCI, 10 мкг ДНК, 200 ед. Sl-эндонуклеазы.

Реакцию проводят при 20 С, после чего смесь подвергают фенольной обработке и переосаждению нуклеиновой кислоты этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл НгО.

4 мкг полученного таким образом препарата

ДНК обрабатывают Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 Е.coll в указанных условиях для достройки возможно имеющихся одноцепочечных концов молекул до двухцепочечных. Реакцию останавливают фенольной депротеинизацией, нуклеиновые кислоты осаждают этанолом и растворяют в 20 мкл Н20, Лигирование линейных молекул ДНК с двуцепочечными концами проводят при

16 С в пробе объемом 50 мкл, содержащей

60 мМ трис-HCI, рН 7,6, 10 мМ MgClz, 10 мМ дитиотреитол, 4 мМ АТФ, 8 -ный полиэтиленгликоль — 6000, 4 мкг ДНК, 100 ед. ДНКлигазы Т4. После завершения реакции пробу разбавляют водой в четыре раза и проводят осаждение нуклеиновых кислот этанолом. 2 мкг растворенной в HgO ДНК обрабатывают рестриктазой Bgfll s 30 мкл буфера для рестрикции — 2. ДНК осаждают

1703692 из реакционной смеси этанолом, растворяют в воде и обрабатывают ДНК-лигазой Т4 в 200 мкл буфера для лигирования.

Полученный препарат ДНК используют для трансформации клеток Е.coli С600 указанным образом с последующей селекцией трансформантов на среде с ампициллином при культивировании клеток в течение суток при 28 С. Среди полученных трансформантов отбирают варианты. обладающие пониженной способностью к росту при 42 С. Из указанных клонов выделяют плазмидную

ДНК, указанным образом и подвергают рестрикционному анализу, Для установления первичной структуры гибридного участка связывания рибосом перед геном 1ГЙ Р 1 в полученной плазмиде

pPR-IFNP 1-13 30 мкг соответствуЮщей ДН К обрабатывают рестриктазой Hlndll в 100 мкл буфера для рестрикции — 2, наносят на градиентный (4-12 ) полиакриламидный гель. Электрофореэ проводят в трис-ацетатной буферной системе, Фрагмент ДНК длиной-190 н.п. элюируют из геля по методу Максама-Гилберта, к нему присоединяют с помощью ДНК-лигазы

Т4 ВагпН!-линкеры "Callaborative Research" (США) аналогично указан ному способу. ДН К переосэждают этанолом, осадок растворяют в 20 мкл Н20, расщепляют рестриктаэой

BamHI в 30 мкл буфера для рестрикции — 1, депротеинизируют фенолом, осаждают этанолом и растворяют в HzO.

Молекулярное клонирование образующегося при расщеплении BamHI фрагмента

ДНК в составе репликативной формы ДНК бактериофага M13 mp 10, селекция рекомбинантных фагов на индикаторной среде. содержащей 5-бром-4-хлор-3-индолил- Р

-0-галактоэид (Х-gal), выделение одноцепочечной фаговой ДНК и определение первичной структуры клонированного фрагмента с помощью метода ограниченного матричного копирования (метод Ф,Сенгера) осуществляется в соответствии с хорошо разработанными стандартными методами.

Установленная методом Сенгера нуклеотидная последовательность гибридного участка связывания рибосом в составе плазмиды pPR-IFN f31-13 является следующей; 5 -... TAAGGAGGTTGGATG...-З, где

TAAGGAGGT — SD-последовательность гена

cro фага il, à ATG — метиониновый кодон Р

1-интерферона.

Пример 2. Получение штамма Е.coli

ВНИИгенетика Vh 903 (pPR-IFN P 1-13)— продуцента фибробластного интерферона человека.

Плазмиду pPR-IFN Р 1-13, кодирующую синтез фибробластного интерферона человека, трансформацией вводят в клетки штамма Е.coli ВНИИгенетика И 903 из коллекции ВНИИгенетика (регистрационный номер ВКПМ В-3546 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов). Эффективность грансформации клеток Е.coli

ВНИИгенетика VL 903 составляет около

10 клонов на 1 мкг нативной ДНК плазмиды pPR-IFNP)-13. Трансформанты отбирают на среде, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), после культивирования клеток в течение суток при 28 С. Из отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК и подтверждают ее идентичность препарату ДН К

pPR-IFN j3 I-13 с помощью рестрикционного анализа. Полученный штамм Е.coll ВНИИгенетика ЧЧ 903 (pPR-IFNP 1-13) депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов, Пример 3. Определение продуктивности штамма Е.coli ВНИИгенетика И 903 (pPR-IFN P t-13) — продуцента фибробластного интерферона человека.

Для определения продуктивности штамма Е,соП ВНИИгенетика VL 903 (pPRlFN itI НЗ) плазмидсодержащие клетки выращивают при 28 С на скошенной агаризованной стандартной среде Хоттингера, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 14 ч, Выросшую на косяках биомассу используют для получения посевного материала, Для этого клетки переносят в колбы Эрленмейера объемом 750 мл со 100 мл среды Хоттингера, со 100 мкг/мл ампициллина и выращивают при 28 С на качалке при 240 об/мин в течение 6 ч.

Оптическая плотность посевной культуры составляет 1,5-2,5 ед.

Ферментацию проводят в ферментере, оснащенном системами для регулирования рН, температуры, скорости перемешивания и аэрации. Для ферментации используют среду Хоттингера со 100 мкг/мл ампициллина и 10 г/л глюкозы. Посевную культуру внося в количестве 5 — 10 . Культивирование осуществляют при рН 6,6-6,8, поддерживая этот уровень подачей аммиачной воды. Первую часть ферментации до О, /gap = 3,5 проводят при 28 С, а затем осуществляют термоиндукцию, повышая температуру до

42 — 45 С в течение 5 мин, после чего продолжают ферментацию еще 2 ч при той же гемпературе.

После окончания процесса для определения активности интерферона клетки из 1 мл культуральной жидкости осаждают центрифугированием, осадок ресуспендируют в

1 703692

1 мл 1 -ного раствора додецилсульфата натрия в 0,02 М ффооссффааттнноом м ббууффееррее, рН 7,2, содержащем 1 2-меркаптоэтанола, и прогревают 2-4 мин при 100 С. После этого осадок отбрасывают центрифугированием и активность интерферона, содержащегося в надосадочной фракции; определяют стандартными методами или по защите диплоидных фибробластов человека о цитопатического действия вируса веэикулярного стоматита, или методами иммуноферментного анализа. В качестве стандартов используют препараты Р -интерферона ("Torey", Япония), оттитрованные по стандарту лейкоцитарного интерферона MPCB 69/19 (Великобритания) или Р9 (СССР).

По различным методам определения активность фибробластного интерферона человека, синтезируемого в клетках штамма

Е.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR 1FNP-13), составляет более 2 10 международных

9 ед./л бактериальной культуры.

Для определения доли синтезированного фибробластного интерферона от суммарного клеточного белка клетки из 1 мл культуральной жидкости осаждают центрифугированием и обрабатывают указанным образом, препарат разделяют электрофорезом в присутствии 0,1 додецилсульфата натрия в 15 -ном полиакриламидном геле. Белки, разделенные в полиакриламидном геле, прокрашивают в растворе

Кумасси P-250. Количественное содержание белков в зонах определяют после сканирования геля на автоматическом лазерном денситометре "КВ 2202" фирмы

"KB" (Швеция). Идентификацию зоны, соответствующей синтезированному в клетках зрелому фибробластному интерферону (19 кД), проводят на основе сравнения с электрофоретической подвижностью маркерных белков, а также с помощью иммуноблотинга разделенных белковых фракций на нитроцеллюлозные фильтры и идентификации зоны интерферона с помощью обработки фильтров в растворах, содержащих мышиные моноклональные антитела против

-интерферона и антимышиные кроличьи антитела, коньюгированные с пероксидаэой из хрена. После соответствующей процедуры окрашивания зона интерферона выглядит темной полосой коричневого цвета на неокрашенном фоне нитроцеллюлозного фильтра.

Содержание белка в зоне, соответствующей /3 1-интерферону. составляет около

10 от суммарного белка плазмидсодержащих клеток Е.coli ВНИИгенетика VL 903 (pP R-IFN j3 1-13).

Таким образом, изобретение в условиях крупномасштабного культивирования клеток Escherichia coli позволяет достичь выхода более 2 х 10 ед./л, что соответствует

5 — 10 от общего клеточного белка.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

pPR-IFNP I-1З, кодирую Чая синтез фибробластного интерферонаP(l) человека, длиной около 3,9 тыс,н.п., содержащая

BamHI-BgLII-фрагмент векторной плазмиды pPR 124 (размером 3,4 т.н.п.), модифицированный введением в ее состав олигонуклеидного BgLII линкера, EcoRIЯапЗА-фрагмент длиной 510 н.п. плазмиды

pIN P чр7, который содержит участок. ответственный за инициацию репликации и се регуляцию,— CoLEI-репликон (ovi CoLEI), ген репрессора cltS 857 фага )., ген устойчивости к ампициллину (Ар ), Тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd(tfd), регуляторную область (PROR), SD-последовательность гена сго (SDoro), кодирующую последовательность зрелого фибробластного интерферона человека (IFNP I) с собственным метиониновым кодо н о м (f- М е1), соединение регуляторной области гена сго 3, кодирующей части j3 1-интерферона и терминаторов транскрипции fd, которое осуществлено так, что перед геном IFNP 1 образован гибридный участок связывания рибосом, имеющий следующую нукf леотидную последовательность: 5 -...

TAAGGAGGTTGGATG... -3, где TAAGGAGGT—

SD-последовательность гена сго фага, ATG— метиониновый кодон интерферона, а непосредственно за терминирующим кодоном гена IFN P 1 расположен тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd, уникальные участки узнавания рестриктаз cLal, координата которого является началом отсчета (0), Pvul (-1110), BgLII (-1480), Асе! (-1 870), P vul Я360).

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмиды pPR-ЧЕМ/3 1-13, заключающийся в том. что в состав pPR 124 с помощью олигонуклеотидного линкера вводят уникальный участок узнавания рестриктазы BgLII, в результате получают плазмиду

pPR124B, которую затем расщепляют рестрикционными эндонуклеазами Есор(и

BgLII, проводят соединение большего из образующихся фрагментов векторной молекулы с EcoRI-SauÇA фрагментом плаэмиды plN p -сгр7, содержащим кодирующую

1703692

Составитель Т, Забойкина

Техред М.Моргентал Корректор Т, Малец

Редактор И. Шулла

Заказ 40 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 часть зрелого 3)-интерферона, в полученной таким образом рекомбинантной плазмиде проводят сближение SD-последовательности гена cro и первого (метионинового) кодона Р -интерферона, для чего плазмидную ДНК гидролизуют рестриктазой BamHI, удаляют часть нуклеотидов с помощью зкзонуклеазной активности ДНКоолимеразы I, проявляющейся в условиях неполного набора нуклеозидтрифосфатов в реакционной смеси, ферментативно расщепляют ДНК рестриктазой EcoRI. обрабатывают Sl-зндонуклеазой для удаления одноцепочечных участков ДН К и последующего полного восстановления двуцепочечных концов с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы Е.coli и обеспечивают циклизацию образующихся линейных молекул ДНК ДНК-лигазой фага Т4, полученным таким образом препаратом

5 трансформируют клетки Е.coli C600 с отбором трансформантов на среде с ампициллином при культивировании клеток при 28 С с последующей селекцией клонов, обладающих пониженной скоростью роста при

10 42 С, после чего из отобранных клонов выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК

pPR-IFNP )-13.

3. Штамм бактерий Escherichia coli

ВНИИА 1825 — продуцент фибробластно15 го (P 1) интерферона человека,