Способ количественного определения ауксинов и цитокининов в растительном материале

Способ количественного определения ауксинов и цитокининов в растительном материале

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к количественному определению регуляторов роста растений в растительных экстрактах, и может использоваться в химических, биохимических, физиологических исследованиях для определения в биологических объектах ауксинов и цитокининов. Целью изобретения является повышение точности и ускорение опреде- - ления. Свежий растительный материал фиксируют жидким азотом, растирают и добавляют меченые тритием аналоги. Пробу экстрагируют последовательно н-бутанолом и этанолом и концентрируют определяемые соединения Путем пропусканий через патрон с амберлито м ХАД-4. Затем выделяют индивидуальные соединения на хроматографической колонке с обращеннофазным сорбентом и определяют их мо - лярную активность. 1 з.п. ф-лы. 2 табл. fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)5 G 01 N 30/06

ГОСУДАРСТВЕ1+1ЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ()а=х

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4707555/25 .. (22) 20.06.89 (46) 07.01.92. Бюл. N. 1 (71) Институт молекулярной генетики АН СССР (72) Н,Ф.Мясоедов, Э.С,Пирузян, Г.В.Сидоров и В.М.Юсибов, (53) 543.544(088.8) (56) Кефели В.И. и др. Методы определения фитогормонов, ингибиторов роста, дефолиантов и гербицидов. М.: Наука, 1973.

Негрецкий В.А. и др.-"Агрохимия", М 10, с. 47, 1985.

S. G. Klm, J. Mark, Chatfleld, 0. J.

Armstrong.— А of Chromotpprafl. 1 1, р. 175183, 1985.

J. М. $оппег, W. K; Р1)гУев. Plaut Рйуз1о1. :

77, р. 784 — 785, 1985. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУКСИНОВ И ЦИТОКИНИНОВ

В РАСТИ ТЕЛ Ь Н ОМ МАТЕ РИАЛ Е

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к количественному определению регуляторов роста растений в растительных экстрактах, и может быть использовано в химических, биохимических, физиологических исследованиях для определения в биологических объектах ауксинов и цитокининов, Цель изобретения — повышение чувствительности, ускорение и упрощение определения.

Способ осуществляется следующим образом.

Свежий растительный материал фиксируют жидким азотом, растирают и добавля2 . - . с .-1 (57) Изобретение относится к- аналитиче-. ской химии, в частности к количественному определению регуляторов роста растений в растительных экстрактах, и может использоваться в химических, биохимических., физиологических исследованиях для определения в биологических объектах ауксинов и цитокининов. Целью изобретения является повышение точности и ускорение опреде-ления. Свежий растительный материал фиксируют жидким азотом, растирают и добавляют меченые тритием аналоги. Пробу экстрагируют последовательно н-бутанолом и этанолом и концентрируют определяемые соединения 1тутем пропусквнм: через патрон с амберлитом ХАД-4. Затем выделяют индивидуальные соединения на хроматографической колонке с обращенно- Б фазным сорбентом и определяют их молярную активность. 1 з.п. ф-лы, 2 табл, ют меченые тритием аналоги. Пробу экстрагируют последовательно H-бутанолом и этанолом и концентрируют определяемые соединения путем пропускания пробы через патрон с амберлитом ХАД-4. Затем выделяют индивидуальные соединения на хроматографической колонке с обращеннофазным сорбентом и определяют их молярную активность.

Количество фитогормона в исходном растительном материале рассчитывают по формуле:

1704065 где Ао — молярная активность исходного Нз меченого фитогормона;

А, — молярная активность выделенного фитогормона; а — количество добавленного Н-мечез ного фитогормона; х — количество эндогенного фитогормона.

Количество индХвВдуал ного фитогормона, выделяемого на.стадии высокоэффективной хроматографии определяют по площади пика, используя УФ-детектор (длина волны 254 нм). Радиоактивность определяют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика (эффективность регистрации трития около 30 ).

Пример 1, Определение количества

6-бензиламинапурина (БАП) и кинетина в растительной ткани.

10 г свежей биомассы (листья, стебли

2-недельного растения) фиксировали жидким азотом, тщательно растирали, количественно переносили в колбу с помощью

80 -ного этанола и добавляли меченый тритием БАП (1,6 мКи, 17,7 Ки/ммоль) и кинетин (1,23 мКи, 8,97 Ки/ммоль). Объем довели до 100 мл 80 -ным этанолом и инкубировали при комнатной температуре в течение 4 ч на магнитной мешалке. Спирт слили, к биомассе добавили еще 100 мл

80 -ного этанола и оставили экстрагироваться на ночь. На следующий день объединили спиртовые экстракты и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант слили в колбу для выпаривания (потери меченого БАП составила 10 ). Супернатант упаривали до половины исходного объема, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. Радиометрическая проверка показала, что и тери

"H-БАП нет. Добавили 1:1 н-бутаноп (насышенчый водо;.) и упарили досуха. Осадок

„.аствосили в 10 мл 95 -ного спирта (растворяется не весь осадок), перенесли в колбу, добавили 10 мл Н20 и повторили упаривание с бутанолом, Осадок растворили е 5 мл этанола (95 ), перенесли в колбу и водой довели до 70 . Радиометрическая проверка показала, что потерь на этой стадии нет. С помощью NaQH довели рН до 8,0, экстрагировали два раза бутанопом в делительной воронке и собрали бутанольные фракции (потеря меченого БАП составила

1,0 ). Бутанольную фракцию упарили досуха, растворили в 1 мп спирта (ОСЧ) и довели объем до 10 мл водой. Этот раствор пропустили через патрон 5х30 мм с амберпитом

ХАД-4 (Serva), собрали водную фракцию, цитокиникы смыли с патрона 10 мл 70 спирта (потери метки нет).

35

45 смывали 70%-ным метанолом (потеря 1.0 ).

Экстракт упарили досуха, осадок раствори50 ли в подвижной фазе (0,1 моль/л ТЭАБ, рН

7,0 в 40 -ном метаноле), пропустили через патрон с лихропрепом С-18. С патрона смывали 5 мл той же подвижной фазы (потери з

Н-ИУК нет). Затем собранные фракции упа55 рипи досуха и растворили е 50 мкл подвижной фазы.

Выделение ИУК проводили на колонке

Separon sax С-18, 7 мкм (ЧССР). Подвижная фаза 0,1 моль/л ТЭАБ, рН 7,0 с 7 / ацетонитрипа, скорость 0,5 мл/мин, УФ-детек5

Спиртовой раствор упарили и к осадку добавили 5 мл 0,1 моль/л триэтипаммоний бикарбонат (ТЭАБ) в 40 -ном метаноле (рН

7,0, подвижная фаза), Пропустили этот раствор через патрон 5х30 мм с сорбентом лихpoIlpell С-18 (ЧССР, 25 — 40 мкм). Собрали первую фракцию, смыли еще 5 мл подвижной фазы, объединили и упарили досуха, растворили в 50 мкл подвижной фазы (потери 0,57ь).

Выделение БАП и кинетина проводились на колонке 3,3х150 мм Separon sax С-18

7 мкм (ЧССР). Подвижная фаза 0,1 моль/л

ТЭАБ рН 7,0 в 36 -ном метаноле, скорость

0,5 мл/мин, УФ-детектор, А =254 нм. В ремя удерживания БАП 31 мин, кинетина—

14,3 мин.

Пики, соответствующие БАП и кинетину, собрали. измерили молярную активность, которая оказалась равной 8,15 Ки/моль в первом случае и 2,18 Ки/моль во втором случае., Содержание эндогенного БАП и кинетина в исходном растении рассчитывали по приведенной выше формуле.

Результаты определения количества

БАП и кинетина приведены в табл. 1.

Пример 2. Определение количества индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), 10 г свежего растительного материала фиксировали жидким азотом и тщательно растирали. Хорошо размельченный порошок перенесли в колбу, добавили Н-ИУК з (0,33 мКи, 6,5 Ки/ммопь), "00 мл метанола и поместили на магнитную мешалку при 0 С на ночь в темноте, Затем гомогенат центрифугировапи при 10000 o6/мин в течение 15 мин . Супернатант слили в колбу для упаривания (потеря меченого ИУК на этой стадии составила 9,5 ) и упарипи досуха. Осадок растворили в 70 -ном метаноле, перенесли в колбу, упарипи до водной фазы, рН довели

1 н HCI до 3,0 и центрифугировапи (потери

ИУК меченого 2,0 ). Затем супернатант пропустили через патрон с амберлитом

ХАД-4 (серва) 5х30 мм. Ауксины с патрона

1704065

Таблица 1

Таблица 2 тор, it =254 нм. Время удерживания ИУК—

21,4 мин. Пик, соответствующий ИУК„собрали и определили его малярную активность.

Результаты определения количества

ИУК в описанном и другом обьектах приведены в табл. 2, Предлагаемый способ позволяет существенно сократить время анализа до суток (почти в 5 раз) за счет сокращения числа стадий хроматографической очистки пробы, упростить и удешевить процесс определения фитогормонов за счет применения менее дефицитных и более дешевых тритиевых аналогов взамен С-аналогов.

Способ позволяет работать на первой стадии с малым количеством биомассы, что обуславливает большую чувствительность предлагаемого способа. Увеличение чувствительности связано с значительным сокращением потерь исследуемого материала на всех стадиях процесса и сокращением числа этих стадий. Последнее особенно важно при работе в лабораторных условиях со стерильными растениями, количество биомассы которых ограничено.

Формула изобретения

1. Способ количественного определения ауксинов и цитокининов в растительном материале путем добавления к гомогенату

5 меченых аналогов, экстракции органическим растворителем, предварительной подготовки пробы. хроматографического выделения индивидуальных соединений на хроматографической колонке с обращенно10 фазным сорбентом и последующим определением их молярной активности, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности, ускорения и упрощения определения, добавление в гомогенат мече15 ных аналогов осуществляют до стадии экстракции, а предварительную подготовку пробы проводят последовательной трехкратной экстракцией н-бутанолом и этанолом с концентрированием определяемых

20 соединений.

2. Способ по и. 1. отличающийся тем, что концентрирование определяемых соединений осуществляют пропусканием пробы через патрон с амберлитом ХАД-4 и

25 с обращенно-фазовым сорбентом.