Способ оценки лечения ретинобластомы у детей

Способ оценки лечения ретинобластомы у детей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к онкоофтальмологии и может быть использовано для оценки эффективности лечения, прогнозирования развития ретинобластомы и достижения клинико-иммунологической ремиссии . Целью изобретения является упрощение , ускорение и повышение точности способа. Способ включает иммунологическое исследование периферической крови больного с использованием клеток ретинобластомы . Новым в способе является то. что противоопухолевый иммунитет оценивают по функциональной активности Т-лимфоцитов в реакции миграции лейкоцитов в агаре с использованием водорастворимых антигенных препаратов из биопсийного материала ретинобластомы, содержащих специфически активные полипептиды с мол.м. 50-100 кД. Способ позволяет оценивать эффективность лечения ретинобластомы , в частности иммунотропного. прогнозировать течение заболевания. В отличие от прототипа способ является более простым и точным, отличается высокой специфичностью . (Л С

CCI Q3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБ".ÈÊ (sI>s G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗО6РЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

S

Ъг

О

О

© (21) 4716766/14 (22) 10,07,89 (46) 07,01,92. Бюл. М 1 (71) Научно-исследовательский институт физико-химической медицины (72) И,В,Каргина, О.А.Скрябина и В.Я.Арион (53) 615.375(088.8) (56) lap. 1.Ophtha)mol. 1978. 22, М 3. р, 396400. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ЛЕЧЕНИЯ РЕТИНОБЛАСТОМЫ У ДЕТЕЙ (57) Изобретение относится к онкоофтальмологии и может быть использовано для оценки эффективности лечения, прогнозирования развития ретинобластомы и достижения клинико-иммунологической ремиссии, Целью изобретения является упрощенис. ускорение и повышение точности

Изобретейие относится к медицине, а именно к онкоофтальмологии, и может быть использовано для оценки эффективности проводимого лечения, прогнозирования процесса развития ретинобластомы, оценки активности клеточного противоопухолевого иммунитета, достижения клинико-иммунологической ремиссии.

Целью изобретения является упрощение, ускорение и повышение точности способа.

Оценивают функциональную активность Т-лимфоцитов в тесте торможения миграции лейкоцитов периферической крови с использованием водорастворимых антигенных препаратов. содержащих полипептиды с мол.м. 50-100 КД, получае, Ы„„1704086 А1 способа. Способ включает иммунологическое исследование периферической крови больного с использованием каеток ретинобластомы. Новым в способе является то, что противоопухолевый иммуниавт оценивают по функциональной активности Т-лимфоцитов в реакции миграции лейкоцитов в агаре с использованием водорастворимых антигенных препаратов из биопсийного материала ретинобластомы, содержащих специфически активные полипептиды с мол.M 50-100 кД. Способ позволяет оценивать эффективность лечения ретинобластомы, в частности иммунотропного. прогнозировать течение заболевания. В отличие от прототипа способ является более простым и точным, отличается высокой специфичностью. мых иэ ткани ретинобластомы и обладающих специфической активностью в отношении лимфоцитов периферической крови больных с ретинобластомой. Метод отличается простотой, требует 3 — 5 мл крови.

Способ осуществляют следующим образом.

В тесте торможения миграции лей .оцитов определяют миграционную способность лейкоцитов периферической крови в присутствии антигенного препарата из ткани ретинобластомы, Рассчитывают индекс миграции (ИМ) лейкоцитов в процентах. При значениях ИМ выше 95 делают вывод о положительном эффекте проведенного лечения через 4-6 мес. после него и о благоприятном прогнозе течения заболевания.

1704086

При значениях ИМ ниже 95 де",àþò вывод о недостаточной эффективности проведенной терапии спустя 4-6 мес и неблагоприятном прогнозе, а в случае клинической ремиссии — о повышенном риске рецидива заболевания.

Антигенный препарат для диагностики получают следующим способом.

Ткань ретинобластомы, полученную в результате энуклеации и хранящуюся при20 С, размораживают, взвешивают и гомогениэируют на льду в физиологическом растворе хлористого натрия при рН 4,5 в весовом соотношении ткань: раствор 1:9, Гомогенат фильтруют через капроновую сетку. Фильтрат охлаждают до 2 — 3 С, определяют объем и при рН 4,5-5,0, добавляют хлористый калий, постоянно перемешивая, до конечной его концентрации в фильтрате

3 M. Экстракцию проводят в течение 16 ч при 4 С в условиях постоянного перемешивания на магнитной мешалке, Материал центрифугируют при 20000 об/мин 30 мин при 4 С. Иэ полученного супернатанта на колонке с сефадексом G-75 удаляют хлористый калий и балластные вещества с мол.м. ниже 50000 Д, не обладающие диагностической активностью. На колонку размером

4,0х15 см наносят 4-5 мл образца, элюцию проводят дистиллированной водой. Фракции свободного обьема с мол.м. свыше

50000 Д объединяют и лиофилизируют. Препарат используют в тесте миграции лейкоцитов в агаровых блоках в концентрации

100 — 200 мкг/мл по белку.

Тест Tophloæåíèñ ..грации лейкоцитов проводят следующим способом. Готовят

Зо(,-ный агар "Дифко" в 0,05 М трис-HCI буферном растворе. содержащем 0.9 «(»

NaCI, рН 7,3. Один объем 3;ь-ного агара при

5 -55 С смешивают с двул я обьемами 199 среды. содержашей 1,5 сыворотки IV группы крови человека, и заливают в пластиковые чашки до высоты слоя arapa 4 мм.

После застывания агара чашки ставят в эксикатор с влажной атмосферой и 5 ь-ным содержанием COg. Эксикатор выдерживают при 4 С не менее 2 ч. В агаровых блоках пробойникол диаметрол1 3 мм вырезают лунки (три для контроля без антигена и по три для проб с антигеном), Агаровые блоки до постановки реакции хранят во влажной камере с 5 -ным содержанием СО2 при

4 "С. Веноэную кровь берут в пробирки с 0,5 мл?,7 -ного раствора три".î а Р по 4-5 мм от каждого больного. После оседания эритроцитов отбирают плазму, обогащенную лейкоцитами. центрифугируют ее при 1200 o6/мин. Осадок лейкоцитов дважды отмывают раствором Хенкса, не содержащим ионов кальция и магния. в том же режиме. Доводят концентрацию лейкоцитов до 2,5х10 и вносят суспензию в лунки по 10 мкл. Затем в контрольные лунки

5 вносят по 10 мл раствора Хенкса, а в рабочие лунки — по 10 мкл раствора диагностического антигена — препарата иэ ткани ретинобластомы, содержащего 100-200 мкг белка в 1 мл раствора Хенкса. Чашки с лей10 коцитами в агаровых блоках помещают в эксикатор с влажной атмосферой и 5 -ным содержанием СО2, Эксикатор помещают в термостат при 37 С на 17 ч, После инкубации в чашки с arapoM заливают 107ь-ный

15 раствор формальдегида на 1 ч для фиксирования клеток. Формалин сливают, агар подсушивают до исчезновения влаги в лунках. затем его удаляют. Проводят оценку результатов реакции. Определяют среднюю шири20 ну эон миграции лейкоцитов в контрольных лунках 4 и в лунках с антигеном Q. как расстояние от границы лунки до края зоны миграции, Рассчитывают ИМ лейкоцитов по формуле

ИМ вЂ” х 1007ь .

Ls

4(Пример 1. Больная 1986 г.рожд, Диагноз — двухсторонняя ретинобластома.

Левый глаз (худший) удален. диагноз под30 твержден гистологически. Проводят органоохранное лечение правого (O.Д.) глаза путем хИмиолучевой терапии. 20,01.88 г, определяют путем эхографии степень проминенции (СП), она равна 5.0 мм и площадь

35 свежей опухолевой ткани на глазном дне офтальмоскопически, она равна 25ф,, У больной берут 4 мл веноэной крови в пробирку с 0,5 мл 2.77-ного раствора трилона

Б, рН 7,3. Кровь отстаивают 40 мин. после

40 оседания эритроцитов отбирают плазму, центрифугируют ее при 1200 об/мин в течение 5 мин, осадок клеток ресуспендируют в растворе Хенкса беэ кальция и магния рН 7;3, дважды переосаждают в том же

45 режиме центрифугирования. Осадок клеток ресуспендируют в 2 мл раствора

Хенкса и с помощью камеры Горяева подсчитывают концентрацию и общее количество выделенных лейкоцитов 7,8x10 .

50 Суспенэию центрифугируют в том же режиме, осадок клеток ресуспендируют в 0,3 мл раствора Хенкса для получения концентрации клеток 2.5х10 в 1 мл. В лунки заранее приготовленных агаровых блоков с

55 17;-ным содержанием агара "Дифко" и

1 -ной сывороткой IV группы крови человека в 199 среде вносят по 10 мкл суспензии лейкоцитов, т.е. по 2,5х10 клеток в каждую лунку. В три контрольные лунки

1, 1; г«ося< по 10 мкл раствора Хс.<хса. г, три др > гие лунки той же чашк ° вносат по 10 мкл раствора антигенного препарата иэ ткани

peтинобластомы в концентр":öèè по белку

100 мкг/мл в растворе Хенкса. выделенного укаэанным способол<, Инкубацию проводят при 37 С во влажной камере с 57.-ным содержанием СОр в течение 17-21 ч в трех чашках. Реакцию останавливают через 17, 19 и 21 ч от начала инкубации в чашках 1,2 и 3,10 -ным раствором формальдегида. заливая его по 2 мл в каждую чашку, диаметром 3.5 см. Фиксацию проводят 1 ч.

Формальдегид сливают, агар подсушивают и удаляют. С помощью бинокулярного микроскопа определяют средние значения ширины зон миграции лейкоцитов в контроле беэ антигена и в опыте — с антигеном. Вычисляют ИМ лейкоцитов, который равен

85<(, что указывает на угнетение миграционной активности лейкоцитов и отражает наличие жизнеспособной опухолевой ткани у больной. Проводят больной лечение в сочетании с иммунокоррекцией, эа 1 день до курса лечения снова оценивают СП, она равна 4,0 мм и площадь живой опухопевой ткани (Пл). она равна 15, а также берут венозную кровь в количестве 4 мл и вновь оценивают миграционную активность лейкоцитов с помощью антигенного препарата иэ ткани ретинобластомы. как указано. Вычисляют ИМ-85 . Повторяют исследование через день после пяти дневного курса лечения: Пл=15 СП=4,0, ИМ=85 — 86 (13,04.88). Обследование проводят через 6 мес после лечения 12.10.88: СП=-2,5 мм, Пл8.5ь, ИМ=90;ь. Размеры опухоли (живой ткани) уменьшаются, ИМ возрастает, Далее через 9 мес (19.01.89) проводят обследование: СП=-2 мм. Пл=5 -рубцовая ткань.

ИМ=98-100 Живой опухолевой ткани не обнаруживается, ИМ в норме. Отдаленные клинические результаты через 5 мес (06.06.89). плотный рубец, ремиссия, положительный эффект от проведенной терапии, благоприятный прогноз.

Значения ИМ, onpeper ел ые гредлагаемым способом, а также значения степени проминенции, в мм. и площэ.",1< опухоли. в

,ь. от площади сетчатки (СП,<;"; — сбработаны статистически, Достовеp<-c: ü < э«ич«й показателей в группах оце <е«э по <епараметрическол<у критерию У<.", оксе на-Манна-Уитни. Обследовано 23 ребенка.

Исходные показатели ИМ в острь<й период заболевания при наличии акти <ной опухолевой ткани были 89 + 2 . Дет«;.< проводили стандартную противоопухолевую терапию, а затем при отсутствии явного клинического эффекта провели «у<ро и.<муноте20

55 раn««с тактиви«."< Бес д<ет<» были обследованы до лечения тактивином после стандартной терапии, через день после курса лечения и через 4-6 мес после этого лечения — первый отдаленный срок. Нэ основании последних результатов пациенты были распределены в три группы: А — с четкой положительной динамикой (СП снизилась в 1,7 раза, Пл снизилась в 3 раза)

ИМ - 103 ч 3.27ь — достоверно в пределах нормы у всех больных группы — 16 детей;

 — с нечеткой клинической картиной, т.е. уменьшение размеров опухоли по клиническим показателям (СП в 1,4 раза, ПЛ в 2,3 раза), но с появлением новых точечных очагов и кровоизлияний. ИМ в группе=88,0 ч 3,1 . т,е. достоверно ниже нормы; С вЂ” с отрицательной динамикой или без изменений в положительную сторону, ИМ = =84,0 + 2.17, т.е. достоверно ниже нормы. Ретроспективно были определены эти средние показатели: средние значения их в группах А.В.С в сроки II u III Достоверные различия по ИМ, СП и Пл как между группами, так и внутри групп в сроки II u III не выявляются, хотя значения ИМ в группах

B и С достоверно ниже нормы до иммунотерапии.

Через 10-12 мес — второй отдаленный срок — проведено повторное обследование больных для подтверждения проведенной оценки эффективности лечения и прогнозирования течения заболевания. В группе А констатирован положительный эффект от проведенного лечения (рубцевание опухоли, ремиссия), подтвержден благоприятный прогноз, ИМ = 102 3,0% (беэ изменений).

В группе В положительный эффект достигнут только у одного больного из пяти (рубцевание. благоприятный прогноз) Vlf = 98 а у пяти больных — лли«и <еское ухудшение, UlM = 82 "- 4,2, . отрицательная динамика соответствует вь<во; о неэ";фек-..вности проведенного лечениа v плохому прогнозу в срок 4 — 6 мес после лечения. В группе С— ухудшение по клинике. V

Груг<па Д (20 больнь х) — де-,«с ретичобластомой, у которы: Аост <гнута клиническая ремиссия после стандартной терапии (химиолучевой), ИМ = 10". 0 7 5-, у 65% больных ИМ в норл.е. 1.е. выше 95;, что указывает на эффективность печени .< 61агоприятный прогноз, à у 35;- . больн«х ИМ ниже 95, что позволяет рассл<атриг ать эту

Группу как Группу риска.

Таким образом, l

1704086

Составитель Д.Бонврцев

Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор С.Шевкун

Редактор Н.Бобкова

Заказ 60 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская нвб.. 4/5

Производственно-иэдательс; комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 эффективность лечения. в частности иммунотропного, и прогнозировать развитие заболевания; определять достижение клинико-иммунологической ремиссии и возможность рецидива заболевания, Способ отличается высокой специфичностью, чувствительностью, простотой, воспроиэводимостью. Иммунологический показатель — ИМ, оцениваемый предлагаемым способом, четко корректирует с клиническими показателями активности опухолевого процесса ретинобластомы до лечения и в отдаленные сроки — через 10-12 мес, а также через 4-6 мес в группах с четкой положительной или отрицательной динамикой. Через 4-6 мес после курса иммунотерапии способ позволяет более точно прогнозировать отдаленные результаты и оценивать эффективность лечения у больных с положительной динамикой по клинике, но с нестабильным течением процесса, когда при явном уменьшении площади и степени проминенции опухоли, ИМ достоверно ниже нормы. 8 отдаленные сроки через 10-12 мес обнаруживается ухудшение состояния: рецидив опухоли. отрицательная динамика, что трудно предположить по клиническим поквэате5 лям за 4-6 мес до этих результатов.

Формула изобретен и я

Способ оценки лечения ретинобластомы у детей, включающий исследование лей10 коцитов периферической крови, о т л и ч а ющ и R с я тем, что. с целью упрощения, ускорения способа и повышения точности, определяют миграционную активность лейкоцитов до начала лечения и далее через 4-6

15 мес путем определения индекса миграции лейкоцитов с использованием водорвстворимых полипептидов из опухолевой ткани ретинобластомы с мол.м. 50-100 кД в концентрации 100-200 мкг/мл по белку к дозе

20 лейкоцитов 2.5х10, учитывают результат через 17 ч от начала реакции и при значениях индекса миграции выше 95 оценивают лечение квк эффективное, ниже

95 $ — недостаточное лечение.