Штамм культивируемых клеток растений аrisтоlоснiа маnsнuriеnsis ком., используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью

Штамм культивируемых клеток растений аrisтоlоснiа маnsнuriеnsis ком., используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности. Цель изобретения - получение активно растущего штамма клеток кирказона маньчжурского, обладающего кардиотропной активностью. Штамм Аг кирказона маньчжурского получен в результате генетической трансформации и селекции клеток кирказона. Штамм характеризуется высокой скоростью роста на безгормональных средах. Из биомассы штамма А2 получен препарат, обладающий профилактическим антиангинальным, антигупоксическим, противоаритмическим и кардиопротекторным действием. Зтабл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)5 C 12 N 5/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ 1 ЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4815599/13 (22) 06.03.90 (46) 30.01.92. Бюл. N 4 (71) Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения АН СССР. Тихоокеанский институ биоорганической химии

Дальневосточного отделения AH СССР и

Всесоюзный научный центр безопасности биологически активных веществ (72) В.П.Булгаков, IO.Н,Журавлев, Е.К.Альшевская, А.А.Артюков, Э.H.Áàáêèía, A.M.Ïîïîâ, Т.Ю,Кочергина, В.В.Гацура, Л.H.Ñåðíîâ, Ю.Б. Розонов и И,В.Левандовский (53) 578.085.23(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1551736, кл. С 12 N 5/00, 1988.

{54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОКРАСТЕНИЙ ARISTOLOCHIA MANSHURIENSIS

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности.

Впервые Arlstolochla manshurlensls

Kom. введена в культуру в форме штамма А1, который специализирован для биосинтеза аристолохиевых кислот, веществ противоопухолевого действия и кардиотропной активностью не обладает.

Таким образом, предлагаемый штамм

Ар, используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью, аналогов не имеет.

Цель изобретения — получение активно растущего штамма клеток кирказона маньчжурского, обладающего кардиотропной активностью.

K0M., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО КАРДИОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности. Цель изобретения— получение активно растущего штамма клеток кирказона маньчжурского, обладающего кардиотропной активностью, Штамм

А2 кирказона маньчжурского получен в результате генетической трансформации и селекции клеток кирказона. Штамм характеризуется высокой скоростью роста на безгормональных средах, Из биомассы штамма

А2 получен препарат, обладающий профилактическим антиангинальным, антигипок- а

I сическим, противоа ритмическим и кардиопротекторным действием. Зтабл.

Штамм Arlstolochla manshurlensis (А2) л получен в результате генетической трансформации клеток кирказона и депонирован во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений ВСКК(ВР) при Институте физиоло- О© гии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР под коллекционным номером 37.

Описание исходного материала. Исход- О ным материалом для получения штамма Аг были пробирочные стерильные растения )чь

Arlstolochia manshurIensls, выращенные из почек многолетней дикорастущей лианы, заготовленной s декабре 1986г. в Надеждинском районе Приморского края. Штамм Az получен из дисков стерильных пробирочных растений, инокулированных агробактериями Agrobacterlum tumefaclens С 58. и представляет собой культуру трансформи1708836 рованных гормононезависимыхапухолевых клеток, выращиваемую на агаризованной либо в жидкой среде.

Культуральные свойства., Растущая каллусная культура представляет собой ткань рыхлой консистенции кремового и беложелтого цвета без запаха. Ростовой индекс

31 ч- 0,6 для каллусов начальной массой

150 мг. Растущая в жидкой питательной среде культура представлена агрегатами кремового цвета размером 1-3, реже 3 — 5 мм.

Накопление биомассы 200 — 250 r сырого веса на 1 л при посевной дозе 40 г/л. Штамм

Аг. выращивают при 25 1 С, относительной влажности воздуха 70О/ в темноте на питательной среде следующего состава, мг/л воды:

NH4NGg 350-450

KN03 1500-2300

КНгРО4 150-190

CaCb, 6НгО 600-730

MgSG4 7НгО 350-400

НзВОз 4,2-8,0

MASG4 4НгО 15,6 — 26,7

CuSG4 5НгО 0,02 — 0,03

Со С!г 2НгО 0,02-0,03

ZnSO4 7Нг0 6.0 — 10,3 йагМо04 2НгО 0,2-0,3

К3 0,52 — 0,90

}- еЯG4 ° 7НгО 25,0 — 30,6

ИагЕОТА. 2ИгО . 33,6-41,0

Тиамина гидрохлорид 0,15 — 0,25

Пиридоксина гидрохлорид 0.40-0,60

Никотиновая кислота 0,40-0,60

Мезо-инозит 80 — 120

Цистеина гидрохлорид 4-6

Сахароза 25000-30000

Агар 5800-6200 рН среды 5,2-5,6

Ткань культивируют в колбах Эрленмейера емкостью 100 мл, содержащих 40 мл среды. Продолжительность цикла выращивания ткани 30 дней, номер пассажа 33-й.

При варианте культивирования в жидкой среде культуру выращивают в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл на качалках со скоростью встряхивания 100 об/мин и амплитудой 25 мм. Каждая колба содержит 100 мл среды указанного состава без агара, цикл выращивания 2 недели.

Цитологические и кариологические характеристики штамма Аг, Ткань представляет собой гетерогеннуа популяцию, состоящую из трех групп клеток. Первая группа — клетки меристематического типа овальной формы среднего размера 64 х 74 мкм, содержание в культуре около 70 . Вторая группа представлена клетками паренхимного типа овальной формы, имеющих средние размеры 112 х 139 мкм, содержание s культуре около 25 j>.

Третья группа — клетки паренхимного типа

5 удлиненной формы среднего размера 64 х

440 мкм, содержание в культуре около 5 .

Максимум митотической активности наблюдается на 8 и 14-й день культивирования.

Культура характеризуется анеупплои10 дией, увеличенным по сравнению с интактным растением количеством хромосом.

Число хромосом о

28 12

28-38 7

15 42 22

44- 54 32

56 18

Более 56 9

Культура не способна к морфогенезу.

20 Получение препарата из биомассы штамма Аг, обладающего кардиотропным действием, После окончания цикла культивирования биомассу штамма Аг извлекают из культуральных сосудов и сушат в токе

25 горячего воздуха (50 — 60 С) в течение суток.

Готовят настойку в.соотношении 1: 10 на

24 -ном этиловом спирте, используя метод перколяции в соответствии с требованиями

Государственной Фармакопеи СССР Х из30 дании. Для этого 100 r измельЧенного сырья смачивают в отдельном закрытом сосуде достаточным количеством зкстрагента. Через

4 ч набухший материал плотно укладывают в стеклянный перколятор и при открытом

35 спускном кране добавляют такое количество экстрагента, чтобы слой его над поверхностью составил 2 — 3 мм. Вытекающую иэ крана жидкость наливают обратно в перколятор, закрывают кран и оставляют на 24

40 ч. Затем медленно перколируют, спуская за 1 ч объем жидкости, соответствующий примерно 1/48 используемого объема перколятора. Перколяцию ведут до получения 1 л настойки. Настойку отстаивают в течение

45 5 дней при 8 С, затем фильтруют.

Полученный препарат обладает профилактическим антиангинальным, антигипоксическим, антиаритмическим и кардиопротекторным видами действия.

50 Пример, В колбы Эрленмейера обьемом 500 мл наливают ro 100 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды:

NH4NG3 400

KNO3 1900

55 КНгРО4 170

СаС1г 6НгО 665

Мд304 7НгО 370

НзВОз 6,2

Мп504 4НгО 22,3

1708836

0,5

Оценка профилактического антиангинального действия. В опытах на бодрствующих кроликах самцах породы Шиншилла массой 2,5 — 3,0 кг изучают влияние настоек .50 биомассы штамма Аг и стеблей кирказона на порог возникновения ишемии миокарда, вызываемой сужением коронарной артерии. С этой целью за 2 — 3 сут до проведения эксперимента под нембутэловым наркозом 55 проводят имплантацию приспособления, позволяющего осуществить медленную окклюзию коронарной артерии с последующим восстановлением ее просвета. Порог

CuS04 5нго 0,025

СоС! г 2НгО 0,025

ZnSO4 7НгО 8,6

NazMo04 2НгО 0,25

KI 083. 5

FeSO4 7НгО 27,8

Na2EDTA 2НгО 37,3

Тиамина гидрохлорид

Пиродоксинэ гидрохлорид

Никотиновая кислота

Мезо-инозит

Цистеина гидрохлояид 5

Казеина гидролизат 50

Сахароза 25000 рН среды 5,6

Колбы со средой стерилизуют при 20

117 С в течение 20 мин, затем в эсептических условиях в каждую колбу помещают по

4 г клеточной биомассы штамма Аг. Колбы устанавливают на качалку орбитного типа и встряхивают со скоростью 100 об/мин при 25 амплитуде 25 мм. Культивирование проводят в темноте при 25 С и относительной влажности воздуха 70 (, в течение 14 сут.

Затем биомассу отфильтровывают и взвешивают, В каждой колбе накапливается от 30 — 20 до 25 r сырой биомассы. Биомассу сушат при 55 С в токе горячего воздуха в течение суток, измельчают и затем готовят настойку .. 1:10 на 24;ь-ном этиловом спирте методом перколяции в соответствии с требованиями 35

Государственной Фармакопеи СССР Х изд, Далее сравнивают фармакологическое действие полученного препарата с действием настойки иэ стеблей (лианы) кирказона, полученной параллельно тем же способом. 40

Во всех опытах настойки вводят лабораторным животным внутривенно в дозе 0,5 мл/кг веса. В контроле вводят соответствующее количество 24 этилового спирта. 45 ишемии миокарда определяют по степени сужения коронарной артерии, при которой появлялись признаки ишемии на прекардиальной электрокардиограмме. Из данных. представленных в табл.1, видно, что настойка стеблей кирказона маньчжурского и настойка биомассы штамма Аг оказывают профилактическое антиангинальное действие во всех опытах, т.е. были эффективны в

100 случаев. По степени повышения порога ишемии миокарда обе настойки достоверно не отличаются друг от друга, Сравнительная оценка антиангинальной активности препаратов из стеблей и биомассы штамма Аг кирказона маньчжурского приведена в табл.1.

Исследование антигипоксической активности. Изучают влияние препаратов из стеблей к. рказона маньчжурского и биомассы штамма Аг на длительность сохранения биопотенциалов миокарда при острой асфиксии у мышей.

С этой целью мышей массой 18 — 20 r наркотизировали этаминэлом натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно), выделяя трахею и подводили под нее лигатуру. Сразу после перевязки трахеи внутривенно вводят испытуемый препарат. Время сохранения биопотенциалов миокарда фиксируют, снимая ЭКГ во И стандартном отведении прМ визуальном контроле с помощью кардиоскопа. Из табл.2 видно, что препараты иэ стеблей и биомассы штамма Аг кирказона маньчжурского примерно в два раза увеличивают длительность сохранения биоэлектрической активности по сравнению с контролем, т.е. обладают выраженной антигипоксической активностью, Изучение антиаритмического и кардиопротекторного действия. Кардиопротекторное действие оценивают по влиянию препаратов на процесс формирования зоны некроза в остром периоде инфаркта миокарда у крыс, а также по течению ранних постокклюзионных аритмий. Опыты проводят на нелинейных крысах самцах массой

250 — 300 г, наркотизированных этаминалом натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно). У живо.тных, переведенных на управляемое дыхание, моделируют инфаркт миокарда перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка предсердия.

В течение первого часа после окклюзии коронарной артерии осуществляют визуальный контроль за состоянием сердечного ритма при помощи кардиоскопа, при необходимости записывая ЗКГ во И стандартном отведении, Размеры зоны некроза и зоны

Таблица 1

Количество опытов

Из них " на-; Из них о личием анти- отсутангинально- ствием антиго

Всего зг1 ыто в ффЕКта оп1ГИНаЛЬНОго афФекта

Конт:.. ль (зтз н or)

Настойка стеблей кирказона

Настойка ";.::О амассы шт- . имя А) 100 0,38+6,1 в. в

Габлица 2 условия опыта

Дли i åëьность со кой а Различия с контролем достовернь. г;ри Р < 0,05, коллчество животных в серии 10. ишемии определяют через 4 ч после окклюзии коронарной артерии при помощи дифференциального индикаторного метода, .locj1e определения размеров зон повреждения рассчитывают процентное отношение зоны некроза к зоне ишемии в каждом опыте.

Результаты представлены в табл.3.

Препараты из стеблей биомассы штамма А2 кирказона маньчжурского обладают противоаритмическим действием при ранних постоккгнозиональных аритмиях. Настойка стеблей кирказона маньч>;<урского уме11ьшает частоту развития ранних постокклюзионных аритмий с 727 (в контроле) до

33 ь, а настойка биомассы штамма Ag — до

27 у.,, Под влиянием настоек увеличивается длительность латентного периода и одновременно примерно в 4 раза уи 1ьшается продолжительность аритмии, Оба препарата существенно уменьша .от размеры зо 1ы некроза после ьоспроиэведения инфаркта миокарда у крыс. Зонь некроза составляют соответственно 41 и

Контроль (физиологический раствор)

Контроль (,—:,. онол, 24 "Ъ р-р)

Настойка стебл"=й кирказона

Настоика био,icos. u- i;".: 1i 4-.-; А2

40 ф для настоек стеблей лианы и биомассы штамМа А2 от зоны ишемии против 68 в контроле.

Таким образом, препараты из стеблей

5 лианы кирказона маньчжурского и из биомассы клеточного штамма А2 кирказона маньчуржского обладают профилактическим антиангинальным, антигипоксическим, противоаритмическим и кардиопротектор10 ным действием, Эффективность препарата из биомассы штамма А2 не уступает эффективности препарата из интактного растения, Полученные результаты свидетельству15 ют о перспективности использования штамма А2 киркаэона маньчжурского как источника препарата, обладающего кардиотропной активностью.

Формула изобретения

20 Штамм культивируемых клеток растений Аriмо1осhia mапshuriensls Kom.

ВСКК(ВР) N 37, используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью, 25

1708836

Таблица 3

Характеристика нарушений сердечного итма

Длительность Длительность латентного аритмии, периода, мин мин

Условия опыта

172+ 3

3,9,3

3,5й1,5"

7,5 2,5

12,3 Ж,?, 4,0=%,6"

Продолжение табл.3 .

" Различия с контролем достоверны Р < 0,05.

Количество животных в контрольной серии опытов 17, в опытных сериях 10 — 12.

Редактор А,Долинич

Заказ 403 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб.; 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Контроль

Настойка кирказона ма н ьчжурского

Настойка биомассы штамма А2

Частота развития ранних постокклюзионных аритмий, Составитель В.Булгаков

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор M.Ìàêñèìèojèíåö