Способ получения рибонуклеиновой кислоты из клеток дрожжей

Способ получения рибонуклеиновой кислоты из клеток дрожжей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам выделения нуклеиновых киСлот, в частности РНК, которая применяется в медицине, сельском хозяйстве и является исходным сырьем для получения нукпеотидов и нулеозидов. Цель изобретения - повышение степени чистоты получаемого препарата РНК и сокращение продолжительности процесса выделения.. Способ заключается в экстракции РНК из биомассы кормовых дрожжей в присутствии 0,2 М NaC! и 0,01-Ч),04 М CaCl2, рН 7,5, при кипячении в течение 15 мин, удалении клеточного дебриса, осаждении РНК из экстракта в виде соли Са путем дополнительного внесения в экстракт CaCh до 0,1-1,0 М. Регенерацию РНК из ее соли осуществляют согласно стандартной процедуре вытеснения ионов кальция из комплекса с РНК минеральной кислотой. Способ позволяет получить целевой продукт 97%-ной чистоты с выходом до 73% от теоретически возможного при сокращении времени выделения до 4-5 ч.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4747102/13 (22) 14.07.89 (46) 30,01,92, Бюл. ¹ 4 (71) Институт микробиологии AH БССР, Всесоюзный научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт микробиологических производсгв (72) В.Н.Барай, И.А.Логачева, И.B.Öâëãóí, А.И,Зинченко, Т.В.Трухачева, H.Â.Mîíañòûрева, В.1У1.Шкуматов и И.A.Михайлопуло (53) 547.963.3(08Я.Е) (56) Патент Японии М 79-55791, кл. С 12 О 13/06, 1979.

{54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ KJ1ETOKДРОЖЖЕЙ (57) Изобретение относится к биохимии, а именно к способам выделения нуклеиновых кислот, в частности РНК, которая применяется в медицине, сельском хозяйстве и явИзобретение относится к биохимии, а именно к способам выдег ения нуклеиновых кислот, в частности РНК, являющейся сырьем для производства нуклеотидов и нуклеозидов и применяющейся в медицине.

Цель изобретения — повышение степени чистоты полученного препарата PHK u сокращение продолжительности процесса выделения.

Основу предложенного способа составляет совокупность следующих приемов: биомассу дрожжей кипятят 15 мин в растворе, содержащем 0,2 M хлористый натрий и

0,01-0,04 M CaCb, с рН 7,5, доведенным

NaOH. После удаления клеток центрифугированием РН К из экстракта осаждают в форме кальциевой соли путем дополнительного

„„5U,„, 1708845 А1 (51)5 С 12 N 15/01 ляется исходным сырьем для получения нуклеотидов и нулеозидов. Цель иэобретения— повышение степени чистоты получаемого препарата PHK и сокращение продолжительности процесса выделения.. Способ закл.очается в зкстракции РНК из биомассы кормовых дрожжей в присутствии 0,2 М йаС! и 0,01-0,04 M CaClz, рН 7,5, при кипячении в течение 15 мин, удалении клеточного дебриса, осаждении PHK из экстракта в виде соли Са путем дополнительного внесения в экстракт СаС12 до 0,1-1,0 М.

Регенерацию PHK из ее солиосуществляют согласно стандартной процедуре вытеснения ионов кальция из комплекса с PHK минеральной кислотой. Способ позволяет получить целевой продукт 97 -ной чистоты с выходом до 73 $ от теоретически возможного при сокращении времени выделения до 4 — 5ч. внесения в экстракт CaClz. Свободную PMK из ее комплекса с кальцием выделяют обработкой кальциевой соли РНК кислотой (напрмер, серной) в течение 5-30 мин.

Отличительными признаками предлагаемого способа являются: 1) осуществление экстракции РНК из клеток в присутствии

0,01-0,04 М СаСЬ: 2) осаждение РН К из экстракта в форме кальциевой соли с последующим. разрушением комплекса обработкой минеральной кислотой.

Предлагаемый способ позволяет сократить время выделения конечного продукта, т.е. Р Н К в 3 раза (с 14,5 до 4-5 ч) и увеличить степень чистоты целевого продукта с 78 до

90 — 97; .

1708845

Формула изобретения

Способ получения рибонуклеиновой кислоты из клеток дрожжей, предусматривающий экстрагирование биомассы раствором хлористого натрия при слабощелочных рН и повышенной температуре и осаждение

PHКизэкстракта„отличаю щийся тем, что, с целью повышения степени чистоты целевого продукта и сокращения продолжительности процесса, в раствор для экстракции PHK вносят СаС1 в концентрации 0,01—

0,04 М и РНК осаждают в виде кальциевой сали путем внесения в экстракт CaCiz в концентрации ОЛ вЂ” 1,0 M с последующим переводом соли РНК в свободную кислоту обработкой минеральной кислотой.

Составитель Н.Александрушкина

Техред М,Моргентал Корректор М.Макс ими шинец

Редактор А.Долинич

381 аз 403 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

fl р и м е р 1. В реакционный сосуд вносят 400 мл Н20, 25 мл 4 M MaC!, 15 мл 1

M CaCb и 60 мл 0,625 M ИаОН. После доведения раствора до кипения к нему прибавляют 100 t сухого БВК (биомасса Candida 5 ааИоза производства Новополоцкого завода БВК). Смесь перемешивают в течение

15 мин, после чего биомассу дрожжей осаждают центрифугированием (5000 g, 10 мин) и промывают 200 мл раствора, содержаще- 10 го 0,2 М NaCI и 30 мМ СаС!2.

Супернатанты, полученные после обоих центрифугирований, объединяют и в суммарный раствор (500 мл) вносят 40 мл 2М

CaCiz (конечная концентрация 0,16 М) и об- 15 разовавшийся Qca40K кальциевой соли PHK отделяют центрифугированием (5000 g, 10 мин). Осадок суспендируют в 75 мл Н О, прибавля1от к суспенэии 0,35 мл 1М HzSO4 и суспензию перемешивают в течение 15 20 мин. Осадок РНК отделяют центрифугированием (5000 g, 10 мин), промывают 100 мл

l-!26 и высушивают при 60 С в термостате, Выход препарата РНК составляет 5,57 г, он содержит 97 основного вещества, что 25 соответствует выходу 72 от теоретически возмо>кного, ."; зличины о ношений Е2бО:Е230 и

Еяд: =яя Раствора целевого продукта составляют 2,2 и 0,4/ саответственно. 30

Содержание фосфата.9,24 0 .

П р и и е р 2, Условия выделения совпадают с описанными в примере 1, эа исключением того, что вместо дрожжей Cattdida

maltosà используютдрожжи Saccitatotttyces 35

ceravisiae, Candida scottii u Candida заЫ оп1со1а. Степень чистоты целевого продукта 96,1; 95,2 и 95.8 соответственно, а выход целевого продукта (от теоретически возмо>кного) 71,8; 72,3 и 72,7 в порядке 40 перечисления обьектов.

Пример 3, Условия примера совпадают с описанными в примере t за исключением того, что используются различные концентрации СаС!р (0-70 мМ) в среде для 45 экстракции PHK и различные концентрации

СаС!2 (40-1000 мМ}, вносимого в экстракт для осаждения PHK.

Требованию получения целевого продукта не только с высокой степенью чистоты (до 97 ), но и с высоким выходом (60 — 73,90 ) удовлетворяют сочетания анализируемых параметров, предусматривающих концентрации CaClz в среде экстракции 10-40 мМ и концентрации СаО2 вносимого в экстракт для осаждения PHK 100 — 1000 мМ.

Таким образом предложенный способ позволяет получить до 73,9 % от теоретически возможного количества РНК из эукариотических клеток (дрожжи), причем достигается высокий уровень чистоты конечного продукта до 97,1%. "àòðàòû же времени на всю процедуру составляют всего

4-5 ч. Предлагаемый метод технологичен и может быть успешно использован в условиях производства без дополнительных научных исследований, Применение предлагаемого изобретения внесет существенный вклад в обеспечение потребности медицины, сельского хозяйства и научных исследований как в самой РНК, так и получаемых из нее нуклеозидах рибо ряда.