Способ постановки реакции торможения непрямой гемагглютинации

Способ постановки реакции торможения непрямой гемагглютинации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, о частности к способам определения противостолбнячного иммунитета. Целью изобретения является упрощение, сокращение времени и повышение точности титрования столбнячного анатоксина при одновременном проведении реакции непрямой гемагглютииации и торможения непрямой гемагглютинации. Для достижения поставленной цели рабочая доза антигена титруется по отношению к стандартной Противостолбнячной сыворотке, антигенный столбнячный зритроцитарный диагностикум модифицируется путем внесения в жидкую фазу диагностикума. очищенного, концентрированного столбнячного анатоксина до концентрации, равной предварительно оттитрованной рабочей дозе, реакция проводится при комнатной температуре. 2 табл.

(19) ((I) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s 6 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

V, АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4761394/14 (22) 21.11.89 (46) 15,02.92, Бюл. М 6 (71) Молдавский научно-исследовательский институт профилактической и клинической медицины (72) С. Ф. Стовбун и Л, С. Порческу (53) 615.373(088.8) (56) Никитин B. М. Справочник методов иммунологии, Кишинев, 1982, с. 216-217, (54) СПОСОБ flOCTAHOBKN PEAKUNN

ТОРМОЖЕНИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к способам определения противостолбнячйого иммунитета. Целью изобреИзобретение относится к медицине, в частности к способам определения противостолбнячного иммунитета.

Целью изобретения является упрощение, сокращение времени и повышение точности титрования столбнячного антитоксина при одновременном проведении реакции непрямой гемагглютинации и торможения непрямой гемагглютинации.

Поставленная цель достигается благодаря найденной возможности титровать рабочую дозу антигена (очищенный концентрированный столбнячный анатоксин) по отношению к стандартной противостолбнячной сыворотке (ГИСК им.

Тарасевича); модифицировать коммерческий антигенный эритроцитарный столбняч-. ный диагностикум путем внесения в жидкую фазу диагностикума очищенного столбнячтения является упрощение, сокращение времени и повышение точности титрования столбнячного анатоксина при одновременном проведении реакции непрямой гемагглютинации и торможения непрямой гемагглютинации. Для достижения поставленной цели рабочая доза антигена титруется по отношению к стандартной йротивостолбнячной сыворотке, антигенный столбнячный эритроцитарный диагностикум модифицируется путем внесения в жидкую фазу диагностикума очищенного, концентрированного столбнячного анатоксина до концентрации, равной предварительно оттитрованной рабочей дозе, реакция проводится при комнатной температуре. 2 табл. ного анатоксина до концентрации, равной

Ъ предварительно оттитрованной рабочей дозе; проводить реакцию при комнатной температуре.

Предлагаемый способ снижает трудо- Я емкость постановки реакции, так как ликви- QQ дируется отдельный процесс раскапываниярабочей дозь| антигена (она вносится в ре-,0 акцию в составе антигенного эритроцитарного диагностикума); ускоряет не менее IBM на 1 ч получение результатов РТНГА, так как ликвидируется отдельный этап контакта испытуемых сывороток с рабочей. дозой антигена (в нашей модификации он происходит в присутствии антигенного эритроцитарного диагностикума), что позволяет ставить

РТНГА по той же рабочей схеме, что и РН ГА, т.е. действительно параллельно; ликвидируется надобность в антительном эритроци1712879

3 тарном диагностикуме для титрования рабочей дозы антигена, так как оно проводится по отношению к стандартной противостолбнячной сыворотке; ликвидируется необходимость в термостате, так как контакт испытуемой сыворотки с рабочей дозой антигена проводится при комнатной температуре; позволяет не только оценить специфичность РНГА по эффекту ее торможения, но и количественно откорректировать титр определяемых антител в испытуемой сыворотке, так как рабочая доза антигена оттитрована по отношению к стандартной протиаостолбнячной сыворотке к определенному, заранее выбранному количеству

Международных единиц (столбнячного анатоксина).

Способ осуществляется следующим образом. . Пример. Для осуществления предлагаемого способа проводят титрование рабочей дозы антигена к 0,1 ME/мл стандартной протиаоетолбнячной сыворотки (принятая величина защитного" титра при столбняке).

Для этого в микротитраторе Такачи в объеме 0,05 мл готовят серийные разведения антигена — очищенного концентрированного столбнячного анатоксина (ОСА}, начиная с разведения 1:125, на следующем раство.рителе: физиологический раствор (рН=7,2—

7,25) с добавлением до 1% нейтрального формалина, В каждый ряд серийных разведений ОСА добавляют по 0,05 мл стандартной противостолбнячной сыворотки, первоначально содержащей а 1 мл 0,2; 0,1;

0,05: 0,025 ME столбнячного анатоксина, Указанные разведения готовят иэ цельной стандартной противостолбнячной сыворотки, содержащей в 1 мл 4 ME столбнячного анатоксина. Состав растворителя указан выше. В последствии их подвергают всем манипуляциям, обычным для испытуемых сывороток (инактивация, истощение, разведение 1;10), т.е. в конечном, готовом для постановок виде в 1 мл укаэанных выше разведений стандартной сыворотки, учитывая дополнительное разведение 1:10, будет соответственно содержаться 0,02, 0,01;

0,005; 0,025 МЕ столбнячного анатоксина.

Для каждого разведения сыворотки готовят два ряда серийных разведений ОСА-дубль результата. После встряхивания пластины оставляют на 1 ч при комнатной температуре, а затем закапывают коммерческий столбнячный эритроцитарный антигенный диагностикум (СД), встряхивают иммунологический планшет и оставляют при комнатной температуре до оседания зритроцитов (1,5-2 ч), После оседания зритроцитов учитывают результаты титрования рабочей дозы антигена. За рабочее разведение антигена принимается то разведение ОСА, которое способно полностью связать столбнячный анатоксин концентрацией ме5 нее 0,1 МЕ/мл (в перерасчете на цельную сыворотку, не разведенную 1:10) и не способное полностью нейтрализовать сыворотки, содержащие 0,1 МЕ/мл и более, что в первом случае выражается отсутствием arr10 лютинации СД, а во втором случае в наличии агглютинации СД. Для использованной серии ОСА рабочее разведение равнялось

1:1000.

Определив рабочую дозу ОСА, добав15 ляем цельный ОСА в коммерческий столбнячный эритроцитарный антигенный диагностикум в количестве, адекватном рабочей дозе. Пример: берут 99,9 мл 0,5% СД, добавляют 0 1 мл цельного GCA, перемеши20 вают и после оседания зритроцитов удаляют из надосадка 0,1 мл, Получают 99,9 мл 0,5

СД, содержащего в жидкой фазе ОСА в разведении 1 .1000 .

После этого проводят контроль пра25 вильности разведения рабочей дозы антигена, В лунки иммунологических планшетов закапывают по 0,05 мл стандартной сыворотки, содержащей 0,2; 0,1; 0,05; 0,025

МЕ/мл столбнячного анатоксина (истощен30 ных, инактивированных, разведенных 1:10), на каждое разведение по 3 лунки. Затем во все лунки добавляют по 0,05 мл СД,содержащего ОСА в рабочем разведении. В лунках, содержащих стандартную сыворотку в

35 концентрации 0.,2 и 0,1 ME/мл (в перерасчете на цельную, не разведенную 1;10),при правильно подобранном разведении ОСА должна быть агглютинация, а в лунках с сывороткой, содер>кащей 0,05 и 0,025 ME/мл, 40 она должна отсутствовать. После контроля правильности разведения рабочей дозы

ОСА такой модифицированный диагностикум (МД) может хранится а бытовом холодильнике и использоваться для.постановки

45 РТНГА длительное время (срок наблюдения

6 мес).

Постановка РТНГА проводится параллельно с РНГА. В микротитраторе Такачи, в объеме 0,05 мл, делают серийные разведе50 ния испытуемых сывороток, подготовленных к реакции по обычной для РНГА методике (инактивация, истощение, разведение 1:10). Разведение каждой сыворотки дублируется в других рядах — один для

55 РНГА, второй для РТНГА. В первый ряд(для

РНГА) закапывается СД, во второй ряд(для

РТНГА) — МД, содержащий кроме сенсибилизированных зритроцитов не фиксированный на эритроцитах ОСА в рабочей дозе.

После оседания зритроцитов (через 1,5-2 ч) 1712879 6 производится учет результатов. Реакция сопровождается общепринятыми серологическими контролями (контроль сыворотки, контроль СД и МД).

Учет и трактовку результатов проводят на примере испытуемой сыворотки, содержащей 0,8 ME/ìë столбнячного антитоксина.

По сравнению РНГА с испытуемой и со стандартной сыворотками устанавливают, что. титр испытуемой сыворотки равен 0,8

МЕ/мл. При этом конец реакции в РНГА при определенной активности СД определяется в восьмой лунке. В то же время конец реакции в РТНГА определяетея в четвертой лунке, т.е. она соответствует концентрации анатоксина в цельной сыворотке, равной 0,1

ME/мл, так как антитоксин в 5, 6, 7 и 8 лун ках (где он присутствует согласно P Н ГА) полностью связался рабочей дозой ОСА. Но в испытуемой сыворотке столбнячных антител в 8 раз больше (4 лунка — 0,1 ME/ìë; 3-я—

0,2 МЕ/мл; 2-я — 0,4 ME/мл; 1-я — 0,8

МЕ/мл},.т,е. 0,8 МЕ/мл, Сокращение ряда агглютинации по сравнению с РНГА с 8 до

4 лунок говорит в свою очередь о специфичности реакции. Таким образом, результат

PНГА подтверждается и качественно и количественно.

Если при данных условиях конец реакции в РТНГА будет как и в РНГА определяться в 8-й лунке, то торможения не произошло, т,е. реакция не специфична и результат учитывать нельзя.

Возможен вариант, когда по РНГА конец реакции в 8-й лунке, а по РТНГА в 1 или

2. Следовательно, по РТН ГА титр сыворотки значительно ниже, чем llo РНГА(по РТНГА—

0,1-0,2 ME/мл, а по РНГА-0,8 МЕ/мл),т.е. специфические антитела в испытуемой сыворотке присутствуют, но РНГА завысила результат и в окончательном варианте титр анатоксина в испытуемой сыворотке уста навливается по РТНГА — 0,1 — 0,2 МЕ/мл, Пригодность данного способа базируется на данных, свидетельствующих, что введение в состав столбнячного эритроцитарного антигенного диагностикума рабочей дозы антигена (ОСА) никак не

- отражается на активности сенсибилизированных эритроцитов, так как при отмывании от растворенного не связанного антигена они приобретают первоначальные свойства. Многочисленные (более 100) параллельные с общепринятым способом постановки.

PTH.ГА показали, что совмещение этапа контакта свободного антигена с испытуемой сывороткой и этапа контакта с ней эритроцитарного диагностикума никак не влияет на качество реакции, ее вид не отли10. нации в РТНГА при использовании термо15

25

35

55 чается от общепринятого варианта РТНГА, артефактов не наблюдалось.

Параллельным титрованием 83 сыворбток было изучено влияние температурного фактора на ход реакции (см. табл. 1). При этом установлено, что при инкубации сывороток и рабочей дозы антигена в термостате (1 ч при 37 С) торможение идет более полно, т.е. сокращение ряда агглютистата примерно на 2 разведения (2 лунки) больше, чем при комнатной температуре (20-25ОС). Однако при этом сохраняется очень высокая прямая корреляция результатов обоих вариантов постановки — коэффициент корреляции — 0,91, что позволяет в предлагаемом способе исключить использование. термостата и проводить реакцию при комнатной температуре.

При 387 параллельных исследованиях со 100 сыворотками была проверена повторяемость результатов предлагаемого способа постановки РТНГА. При этом ни в одном случае не было определено расхождений, более чем на одно разведение, что для серологии не считывается существенным,.а в 223 случаях (57,6 + 5,0%) отмечены полные совпадения результатов реакции, что говорит о практически полной воспроизводимости результатов в предлагаемой модификации постановки РТН ГА.

В двух опытах было проведено титрование рабочей дозы очищенного концентрированного столбнячного анатоксина по стандартной сыворотке, которое для использованной серии ОСА выявило наличие зависимости между разведением антигена и его нейтрализующей способности, что позволило придать результатам РТНГА свойства, позволяющие определять с ее помощью титр анатоксина в испытуемой сыворотке, т.е, корригировать результат

РНГА не только качественно на предмет специфичности, но и количественно, что отличает предлагаемый способ от общепринятой методики.

Сводные данные обобщих и отличительных существенных признаках предлагаемого способа и прототипа приведены в табл. 2.

Таким образом, предлагаемый способ имеет следующие преимущества перед,общепринятым способом: внесение в реакцию . рабочей дозы антигена в составе эритроцитарного диагностикума позволяет ставить

РТНГА одноэтапно, что не Менее чем на 1 ч ускоряет учет результатов и дает возможность учесть реакцию одновременно с

РНГА; доза антигена титрования по отношению к стандартной сыворотке позволяет количественно корригировать титры .

1712879

Таблица1

Степень торможения результатов РНГА в РТНГА при использовании термостата и без него при титрований сывороток подей

О г

6 7 8 Всего

4 лунки лунки лунки лунок лунок лунок лунок

2 лунки

18 8

3 лунки

-4 лунки

24 8

2 13

5 лунок

6 лунок

7 лунок

8 лунок

23. 36 21

Всего анатоксина по РНГА при возможных ошибках; постановка реакции становится менее трудоемкой, ликвидируется необходимость в дополнительном оборудовании (термостат) и реагентах (антительный диагностикум).

Формула изобретения

Способ постановки реакции торможения непрямой гемагглютинации, включающий предварительное определение . рабочей дозы специфического антигена с последующим выявлением соответствующих специфических антител в исследуемой сыворотке после внесения специфического антигена и антигенного эритроцитарного диагностикума по торможению агглютинации, отличающийся тем, что, с целью упрощения. сокращения времени и повышения точности титрования столбнячного ана5 токсина при одновременном проведении реакции непрямой гемагглютинации и торможения непрямой гемагглютинации, рабочую дозу антигенв — очищенного кон.центрированного столбнячного анатоксина

10 определяют при титровании со стандартной противостолбнячной сывороткой, вносят антиген в состав эритроцитарного антигенногодиагностикума и используют на первом этапе постановки реакции торможения не15 прямой гемагглютинации при комнатной температуре.

1712879

Таблица2

Характеристика способа-прототипа и предлагаемого способа постановки реакции торможения непрямой гемагглютинации

Способ"прототип

Предлагаемый способ постановки

РТНГА

Материалы и оборудование, необходимые для реакции

Эритроцитарный антигенный столбнячный диагностикум (коммерческий) .

Стандартная противостолбнячнвя сыворотка (коммерческая ) Очищенный концентрированный столбнячный неадсорбированный жидкий анатоксин (коммерческий)

Не нужен

Антительный столбнячный эритроцитарный диагностикум (коммерческий не выпускается) Термостат

Не нужен

Титрованив рабочей дозы антигена

Постановка РНГА со столбнячным антительным эритроцитарным диагностикумом, рабо, чая доза 2-4 антигенных единицы

Схема постановки и условия реакции

1-й этап - Контакт рабочей дозы антигена 1-этап - закапывание модифицированного антис испытуемой сывороткой (термостат, I ч, генного эритроцитарного диагностикума, содер37 С). жащего в своем составе рабочую дозу антигена и сенсибилизированные антигеном эритроциты, 2-й этап - закапывание эритроцитарного реагирование свободного антигена с испытуемой антигенного. диагностикума, контакт с сывороткой, а затем несвязавшегося анатоксина испытуемой сывороткой и оседание сенсис аитигенным столбнячным эритроцитарным диагнобилизированных эритроцитов {комнатная стикумом комнатная температура, 1, "2 ч . температура, 1,5-2 ч

Время Ло учета реакции

2,5"3 ч

l>5-2 ч

Информация получаемая в результате реакции

Специфичность поставовки РНГА Специфичность постановки РНГА

Точность определения титра анатоксина в испытуемой сыворотке по РНГА с возможном его коррекцией по РТНГЯ.

Составитель П.Бонарцев

Редактор В.Трубченко Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор О.Кундрик

Заказ 533 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101,Эритроцитарный антигенный столбнячный дна гностикум > коммерческий)

Стандартная противостолбнячная сыроротка (коммерческая)

Очищенный концентрированный столбнячный неадсорбированный жидкий анатоксин (коммерческий) Постановка РТНГА с серийными разведениями столбнячного. анатоксина по отношению к стандартной противостолбнячной сыворотке в концентрациях 0,2; О,1; 0,05; 0,025 НЕ/мл, ра" бочая доза — разведение анатоксина, способное связать полностью столбнячный анатоксин концентрацией менее О,1 НЕ/мл.