Способ определения хемотаксиса лейкоцитов

Способ определения хемотаксиса лейкоцитов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии. Целью изобретения является повышение точности и производительности определения миграцииклеток при иммуноэпидемиологических исследованиях. Выделенные из крови обследуемых лиц лейкоциты в количестве 1,0-1,5 млн/мл вносят в лунки планшет, содержащие питательную среду, с размещенными в них несколькими капиллярами. Капилляры предварительно заполняют составом, содержащим агар и питательную среду при их соотношении соответственно равном

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01,N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

HO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4765876/14 (22) 30.11.89 (46) 15.02.92. Бюл. ЬЬ 6 (71) Институт иммунологии (72) M. 3. Саидов и Ei. В. Пинегин (53) 615.3?5(088.8) (56) Иммунологические методы. Под редакцией Р. Фримеля. М.: Медицина, 1987, с.

333-338. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЕМ0ТАКСИСА ЛЕЙКОЦИТОВ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии. Целью изобретения является повышение точности и производительности определения миграции

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике нарушения хемотаксиса лейкоцитов у обследуемых лиц, Целью изобретения является повышение точности и увеличение производительности способа определения хемотаксиса.

Способ осуществляется следующим образом.

Объектом исследования служит гепаринизированная кровь в количестве 2 мл, ко-. торую смешивают с 2 мл 1 %-ной желатины, отстаивают при 37 С в течение 10-15 мин.

Надосадок извлекают, отмывают в среде

199, просчитывают клетки и составляют клеточную взвесь с концентрацией 1 млн/мл..

Затем готовят состав для заполнения капилляров. Для этого берут навеску 20 мг порошка arapa (Difeo), К ней добавляют 1 мл среды

199. Выдерживают смесь в течение 20 мин (, ЯХ„„1712880 А1 клеток при иммуноэпидемиологических исследованиях. Выделенные из крови обследуемых лиц лейкоциты в количестве 1,0-1,5 млн/мл вносят в лунки планшет, содержащие питательную среду, с размещенными в них несколькими капиллярами. Капилляры предварительно заполняют составом, содержащим агар и питательную среду при их соотношении соответственно равном (0,81,0):100. Капилляры инкубируют в течение

8 — 10 ч„извлекают из лунок планшет и измеряют длину пробега мигрировавших клеток .с помощью микроскопа с окуляром-микрометром. Производительность способа увеличена в 4-5 раз, а точность — в 3-5 раз выше, чем в способе-прототипе. 3 табл.

««и при комнатной температуре для набухания и пропитывания агара. Затем агар в среде

199 помещают в водяную баню, где при температуре кипящей воды происходит расплавление агара. Далее золю агара дают остыть до 50-55 С и в него вносят при перемешивании 1 мл среды 199, содержащей CO

0,16 мл (8%) эмбриональной телячьей сыво- (, 9 ротки,0,0008 г (0,04%) глютаминовой кислоты и 0,01?2 мг (из расчета 0,86 мг на 100, мл среди) N-формилметионилоеых пептидое.

Капилляры плоские, 5-канальные,40,25 мм, заполняют агаровым золем, для чего их . опускают в вертикальном положении в вышеописанный состав, представляющий собой жидкость (т — 50 — 55 С). Для застывания жидкости в капилляре их оставляют при комнатной температуре, после чего извлекают. Далее клеточную взвесь раскапывают по 0,1 мл в лунки планшет. Туда же в верти1712880

Таблица 1

Таблица 2

10

10

Показатель

Конт аль

70+ О,S

n = --10

12 + 0,4 и-10

50 + 0,5 и =10

38й 0,4 п=10

Длина* и обега

15 + 0,5 и= l0 кальной позиции помещают капилляры опытные и контрольные. Инкубируют 10 ч„ извлекают капилляры и измеряют длину пробега мигрировавших клеток с помощью микроскопа с окуляром-микрометром (ув.

10х25).

Пример . 1. Нейтрофильную взвесь получают путем седиментации на градиенте плотности MPR-М, Чистота, выделенных нейтрофилов составила 95-98 ф, жизнеспособность 98 jo по исключению трипановог0 синего, Осуществление способа отличается от описанного в примере тем, что нейтрофилы вносят в лунки планшет в количестве 1,5 млн/мл, Капилляры заполняют смесью следующего состава: эмбриональная телячья сыворотка 13 мл, глютаминовая кислота 0,06 r, N-формилметиониловые пептиды 0,0086 мг, агар 0,8 г, среда 199 до 100 мл, а инкубацию проводят в течение 8 ч.

Результаты опыта по определению длины пробега в 10 каналах капилляров представлены в табл. 1.

Результаты миграции нейтрофилов из чистой взвеси представлены в табл. th 2.

Результать1, указанные в таблицах и примерах, соответствуют числу делений линейки в окуляре при увеличении. окуляр 10, обьектив -25. При необходимости для перевода результатов в миллиметры, полученные значения делят на 25. Разбросы .определения миграции в каналах капилляра составляют 1,6 — 3, Результат фиксируется в виде средней арифметической, Ошибка опыта Р - — 100 $ = 2,7 (,, п1

Сравнительный анализ предлагаемого способа и способа-прототипа представлен в табл. 3.

Под порядковыми. номерами (1,2 и т.д.)

5 представлены по способу-прототипу абсолютное количество мигрированных клеток на обратной стороне мембраны, а по предлагаемому способу — длина пробега с помощью окуляра-микрометра (ув. 10Х25).

10 Как видно иэ таблицы, ошибка опыта способа-прототипа превосходит ошибку предлагаемого способа в 3-5 раз при определении хемотаксиса, т.е. точность предлагаемого способа в 3-5 раз выше по

15 . сравнению со способом-прототипом.

Формула изобретения

Способ определения хемотаксиса лей20 коцитов, включающий их выделение и определение длины пробега мигрирующих клеток, отл ича ю щи йс ятем,что,с целью повышения точности способа и увеличения его производительности, лейкоциты в коли25 честве 1,0 — t,5 млн,наносят в лунки планшет с питательной средой, в них в вертикальной позиции размещают капилляры, заполненные средой, содер>кащей в 100 мл эмбриональную телячью сыворотку 8-13 мл, 30 глютаниновую кислоту 0,04 — 0,06 г, N-формил-метиониловые пептиды 0,0086-0,86 мг, агар 0,8-1 г, инкубируют в течение 8-10 ч,, извлекают капилляры и измеряют длины пробега мигрирующих клеток с помощью

35 микроскопа с окуляром-микрометром.

1712880

Таблица 3

Составитель Б.Мануйлов

Редактор В.Трубченко Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор Н,Король

Заказ 533 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r Ужгород, ул.Гагарина, 101 о 226,620

m = 71.663 рр%

* С внесением ХА.

0=17

m =0,7

Р=1,8 сг= 2.2

m = 0,66

Р 2,7