Раствор для извлечения эмбрионов

Раствор для извлечения эмбрионов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к сельскому хот, зяйству, в частности к ветеринарии, трансплантации эмбрионов. Целью из^обретения является повышение технологичности приготовления раствора, возможность осуществления стерилизации любым способом, увеличение сроков хранения. Раствор для извлечения эмбрионов содержит в I л бидистиллированной воды хлористый натрий, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий кислый фосфорнокислый однрзамещенный. Ингредиенты в растворе находятся в следующем соотношении, г: хлористый натрий 8,2 - 8,7; натрий фосфорнокислый двузамещенный 2,17 - 2,8; калий кИслый фосфорнокислый однозамещенный 0,2 г 0,4. 4 табл./

„„ Ж,, 1713529 А1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 А 01 К 67/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (57) Изобретение относится к сельскому хо-., зяйству, в частности к ветеринарии, трансплантации эмбрионов. Целью изобретения является повышение технологичности приготовления раствора, возможность осуществления стерилизации любым способом, увеличение сроков хранения. Раствор для извлечения эмбрионов содержит в 1 л бидистиллированной воды хлористый натрий, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий кислый фосфорнокислый однозамещенный. Ингредиенты .в растворе находятся в следующем соотношении, r: хлористый натрий 8,2 — 8,7; натрий фосфорнокислый двузамещенный 2,17 — 2,8; калий кйслый

: фосфорнокислый однозамещенный 0,2—

0,4. 4 табл, (21) 4786215/15 (22) 05. 12.89 . (46) 23.02.92. Бюл, М 7

60.

° ю

les

ЪФ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (71) Научно-исследовательский институт животноводства Лесостепи и Полесья УССР (72) М.К.Дибиров, Ф.И.Осташко и

Н.Д. Безуглый (53) 612.646 (088,8) (56) Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. — M. 1983, с.231 и 232, табл.18.

Инструкция по трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных. — М„

1984, с.39 — 41, (54) РАСТВОР ДЛЯ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЗМБРИОНОВ

Изобретение относится к области сель-. ского хозяйства, в частности к ветеринарии, трансплантации эмбрионов. Известны растворы, предназначенные для работы с эмбрионами, в частности, для извлечения эмбрионов из организма самок млекопитающих. Эти растворы Игла, Хэма10, Среда-199 и другие с различными биологическими и синтетическими добавками, В состав Среды-199 в прописи Могдапаете1

1958, к примеру, входят аминокислоты, мг/л:

L-Алан ин 50

L-Аргинин-HCI 70

0L-Аспарагиновая кислота 60

L-Цистеин-H CI 0;1

L-Цистин 20

L-Глутаминовая кислота-.HzO 150

1=Глутамин 100

Глицин 50

L-Гистидин-Н CI 20

L-Гидроксипролин 10

DL-Иэолейцин 40

DL-Лейцин

1=Лизин-HCt

01=Метионин

01=Фенилаланин

}=Пролин

01=Серин

0(=Треонин

И=Триптофан

1=Тирозин . 01=Валин

Витамины, мг/л:

Аскорбиновая кислота . М-Биотин

Кальциферол

Са-Пантотенат

Холинхлорид

Ниацин

Ниацинамид и- Аминобензойная кислота

Пиридоксаль-НС1

Фолиевая кисиотэ

i-Иноэитол

Линадион

005 !.:

0,01

0;10

0.01— о:.м

6,62.5

©;625

6,Ю5 .6,01

0,66 .

ОЩ

1713529

1,15

Рибофлавин 0;01

Тиамин HCI 0,0.1

Витамин А (ацетат) 0,14

Поскольку эти растворы предназначены в большей степени для культивирования микроорганизмов, вирусов, культуры тканей и при контакте с внешней средой теряют свое первоначальное биологическое качество, в связи с этим применение их для извлечения эмбрионов иэ организма самок не получило широкого распространения в практике, кроме того, они очень дорогостояющие, Наиболее .широкое распространение для извлечения эмбрионов получил раствор

Дюлбекко следующего состава:

Натрий хлористый, 8,0

Калий хлористый 0,200

Натрий фосфат двузамещенный безводный

Калий фосфат однозамещенный 0,20

Магний хлористый 6-водный 0,10

Кальций хлористый безводный 0,10 Натрий пирувиат 0,036

Глюкоза 1,0

Вода бидистиллированная До 1000,0

Непосредственно перед применением в раствор дополнительно вносят 20 мл фетальной сыворотки и антибиотики (пенициллинкалиевая соль 0,03 мг/мл и стрептомицин 0,05 мг/мл). Концентрация водородных ионов (рН} раствора колеблется

7,05-7,4 и осмотическое давление 290-300 мосмоль.

Компоненты растворяют в указанной последовательности и стерилизуют путем фильтрации под давлением через бактериальные фильтры типа Зейца или Милипоровые фильтры.

При изготовлении раствора Дюлбекко образуются труднорастворимые осадки углекислых и фосфорнокислых солей кальция и магния. В связи с этим соли кальция и магния растворяют отдельно и в виде раствора добавляют к основной части его, включающей остальные компоненты. Необходимость поэтапного изготовления раствора и его многокомпонентность, изменение качества при стерилизации, автоклавировании ионизирующими лучами, быстрое размножение микроорганизмов при контакте с внешней средой, при котором он приобретает токсичность, все это усложня. ет его применение и повышает стоимость.

Не обоснованно вносят в раствор для получения эмбрионов антибиотики и фе40

NaCI 8,2 — 8,7

МагНР04 2,17 — 2,8

КН2Р04 0,2 — 0,4

Для получения раствора приготовлены смеси ингредиентов, содержащие каждая в

1 л бидистиллированной воды различные соотношения (граничные и заграничные).

Данные сведены в табл.1. Каждая смесь готовится отдельно и подвергается измерению физико-химических параметров и выживаемости эмбрионов при инкубации в этих растворах, Эффективность растворов оценивают по способности эмбрионов культивироваться In vItro в предлагаемом растворе в течение 24 ч, в качестве контроля использован раствор Дюлбекко. Поскольку важным условием выживания является концентрация водородных ионов (рН) и осмомолярность, то в предлагаемом растворе эти показатели имеют оптимальные величины, необходимые для развития эмбрионов, а именно: 292 = 3,7 мосмоль и рН 7,1.

Преимуществом предлагаемого раствора по сравнению с известным является ! тальную сыворотку., в этом нет ни биологической, ни экологической необходимости.

Рабочей гипотезой для поиска более простого солевого раствора для изготовле5 ния эмбрионов, сохраняющего биологические качества эмбрионов и обладающего теми же физико-химическими параметрами, являлось следующее положение . эмбрион до определенной стадии обладает потенци10 альной возможностью развития (без внесения в раствор для извлечени-я дополнительных компонентов) и он эт@ свойство сохраняет в промывочной среда.

Используемые солевые растворы для

15 извлечения эмбрионов, в том числе и предлагаемый раствор Дюлбекко, обогащаютс из матки органическими и минеральными, е также биологически активными вещества-ми, которые сохраняют биологические качЕ20 ства эмбрионов и обеспечивает дальнейшее их развитие, Так же не обязЕтельно и делать солевой раствор сильй9 щелочной (более 7,0 — 7,1),для извлечения, эмбрионов, поскольку в самой маточной па25 лости среда щелочная.

Целью изобретения является повышение технологичности приготовления раствора, снижение стоимости, возможность осуществления стерилизации любым изве.30 стным способом и увеличение сроков хранения раствора.

В известном растворе, в состав которого входит на 1 л бидистиллированной воды

NaCI, Na2HPO4, КНгРОа. все укаэанные инг35 редиенты берут в следующем соотношении:

1713529

15

30

Таблица 1

Количество веществ на 1 л раствора, г

Опыт

Физико-химические показатели

Выживаемость брионов при инкубироаании 1п

vitro. в течение 24. ч, Осмотическое давление, мрсмоль

Бидистиллированная вода

Концентрация водородных ионов (рн), отн.ед.

Натрий фосфорнокислый однозамфщенный

Натрий хлористый

Калий фосфорнокислый однозамещенный. йредлагаемый

0,1

1000,0

278 й4,5

6,8

8,0 увеличение сроков хранения раствора, воэможность его стерилизации и приготовления, снижение затрат на его изготовление и снижение стоимости раствора более чем в

10 раз, Для подтверждения того, что предлагаемый раствор не уступает известному, поставлены опыты по выживаемости эмбрионов (табл.2). В табл.З приведены физические показатели растворов после использования.

Из табл. 2 видно, что при культивировании In vitro эмбрионов, полученных опытным раствором и известным раствором, разницы в их развитии и выживаемости не наблюдалось. А это касается концентрации водородных ионов (рН) и осмотического давления (табл.3), отклонения этих показателей от нормы в известном растворе больше. чем в предлагаемом.

Удельная плотность известного и предлагаемого растворов одинаковы до и после использования этих растворов для извлечения эмбрионов, Учитывая, что эмбрибны находятся"в те- 25 чение малого времени в промывочной жидкости при извлечении их из матки, а также тот факт, что в этот период жизни не велики физиологические потребности эмбриона в питательных веществах, а зти необходимые питательные вещества эмбрион для поддержания физиологической функции получает иэ промывочной жидкости матки, поскольку промыеочная жидкость из матки обогащается пролефератом железистого эпителия эндометрия, содержащим полный комплекс биоорганических веществ в достаточном количестве, нет необходимости вносить в раствор дополнительно питательные вещества, В связи с этим главным является под- 40 держание физико-химических параметров раствора, а именно этого добиваются, используя предлагаемый раствор. Предлагаемый раствор позволяет испольэовать любой способ стерилизации. что невозможно осуществить в известном способе. Для подтверждвния преимущества предлзгаемого -. раствора проведены опытные испытания растворов для изучения физико-химических свойств их после стерилизации ускоренны- ми электронами и автоклавированием. Данные сведены в табл.4.

Из табл.4 видно, что при стерилизации известного раствора ускоренными электронами так же как и при кипячении наблюдается изменение цвета раствора, он приобретает желтую окраску. При этом входящие в состав известного раствора прототипа и глютаминовая кислота деполимеризуются и при этом изменяется и качественный состав. При этом концентрация водородных ионов известного раствора сдвигается в щелочную сторону, что отрицательно сказывается на выживаемости эм-. брионов.

Данные. вытекающие из табл.4, убежда. ют в том, что известный раствор, при воздействии на него факторов внешней среды, менее устойчив как по качественному составу, так и по физико-химическим параметрам, чем предлагаемый раствор.

Формула изобретения

Раствор для извлечения эмбрионов, со,держащий бидистиллированную воду, хлористый натрий, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий кислый фосфорнокислый однозамещенный, о т л и ч а ю.шийся тем, что, с целью повышения . технологичности приготовления раствора; возможности осуществления стерилизации любым способом, увеличения сроков хранения, он содержит ингредиенты в следующем соотношении. г/л бидистиллированной âoды:

Хлористый натрий 8,2 — 8,7

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 2,17 — 2,8

Калий кислый фосфорнокислый однозамещенный 0,2-0,4

1713529

Продолжение табл.1, Количество веществ на 1 л раствора, г

Физико-химические показатели

Опыт

Бидистиллированная вода

Осмотическое давление, мосмоль

Натрий хлористый

0,2

0,4

0,45

0,5

1000,0

1000,0

1000,0

1000,0

284+4,0

292+ ;7

298 3,8

310 ь5,03

2,17

2,5

2,8

3,0

8,2

8,5

8,7

9,0

3

6,9

7,16

7,28

7,4

53

62

Контроль Раствор Дюльбекко и-5

294+.0,2

7,3

Таблица 2

Таблица 3

Концентрация водородных. ионов н

Плотность среды

Раствор

Осмомолярность, мосмоль до исполь- после исзования пользования после использования до использования до использования после использования

Левый рог

Правый рог

7,2 +0,05

7,45+0.06

7,44+-0,04

1,05

Дюльбекко(п =7)

Предлагаемыйый и =8

300 8,2

294+4,4

310+8,5

296+4,5

7,1+0,55

7,16+0,03

7,2й0,08

1,05

Таблица 4

Бактериологическое иссле ование, Раствор цвет

Концентрация водоо ных ионов Н до стерилизации после стерилизации после сте илиза ии до стерилизации до стерилизации после стерилизации

Ускоренными элект нами

Кипячением

Предла гаемый(п «9) Отсутствие роста микробов (-)

Отсутствие микробов

Бесцветный

Бесцветный

Рост мик. робов(+) Бесцветный

7,1

Дюльбекко(п -7) Рост микробов (+) То же

Желтый

Желтый

7,2

7,3

Составитель Е. Кузнецова

Техред М.Моргентал Корректор О. Кундрик

Редактор Н. Бобкова

Заказ 641 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Натрий фосфорнокислый однозамещенный

Калий фосфорнокислый однозамещенный

Концентрация водородных ионов (рН) отн.ед.

Выживаемость змбрионов при инкуби ровании In

vitro в течение 24 ч,