Способ иммуноэлектроосмофореза

Способ иммуноэлектроосмофореза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к иммунологии, в частности к методу количественного имму-ноэлектрофореза, и может быть использовано для изучения количественных изменений антигенов. Цель изобретения - количественное определение антигена способом встречного электроиммуноосмофореза. Для осуществления способа проводят 'анализ антигена методом встречного иммуноэлектрофореза и после окрашивания пластины вырезают участки геля с окрашенным преципитатом, элюируют их 0.1%-ным раствором додецилсульфата натрия в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0. с последующим фотометрированием элюата. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)s G 01 N 33/561

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

5=A В, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4655809/14 (22) 27.02.89 (46) 23.02.92. Бюл. N. 7 (71) Северо-Кавказский научно-исследовательский институт фитопатологии (72) В,В.Чигрин, И.И.Соколов и И,С.Каневчева (53) 615.373 (088.8) (56) Nature. 1964, 201, 4924, 1092-1094. (54) СПОСОБ ИММУНОЭЛЕКТРООСМОФОРЕЗА (57) Изобретение относится к иммунологии,. в частности к методу количественного иммуИзобретение относится к иммунологии, в частности к методу количественного иммуноэлектрофореза, и может найти применение при изучении количественных изменений специфических антигенов.

Цель изобретения — количественное определение антигена способом встречного электроиммуноосмофореза при использовании поливалентных сывороток.

Способ осуществляется следующим образом.

Проводят анализ антигена методом встречного иммуноэлектроосмофореза, окрашивают образующиеся преципитаты Кумасси 8-250.

Для определения количества антигена иммунофореграмму подвергают стандартной обработке (сушка, окраска. промывка), затем вырезают участок фореграммы с окра. Ж 1714511 А1 ноэлектрофореза, и может быть использовано дляя изучения количественных изменений антигенов, Цель изобретения — количественное определение антигена способом встречного электроиммуноосмофореза. Для осуществления способа проводят анализ антигена методом встречного иммуноэлектрофореза и после окрашивания пластины вырезают участки геля с окрашенным преципитатом, элюируют их 0,1%-ным раствором додецилсульфата натрия в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0, с последующим фотометрированием злюата. 2 табл. шенными преципитатами. Площадь вырезаемого участка где А — расстояние между центрами лунок, мм;

 — диаметр лунки+.4 мм (2 мм с каждой. стороны лунки), мм, Перед вырезанием сухой гель смачивают дистиллированной водой. Вырезанный участок фореграммы с окрашенным преципитатом .злюируют 0,2 M ацетатным буфером, рН 5.0; содеожащим 0,1%-ный додецилсульфат (ДДС) Na, при 50 С в тече- ; ние 1 ч.

Экстракт фотометрируют при 565 нм, а вычисление проводят исходя из.соотношения оптических плотностей растворов ана1714511

Таблица 1 лизируемого образца и наиболее близкого по окраске контрольного образца с известным содержанием антигена.

Пример 1. Навеску (1 г) листьев пшеницы, зараженных ржавчинным грибом, растирают в 0,1 М трис-глициновом буфере, рН 8,6, содержащем 0,1 аскаорбата натрия (5 мл). Экстракт центрифугируют при 6 тыс, g и сгущают криодиализом до

1/10 исходного объема. 0,05 мл надосадочной жидкости наносят в верхние лунки фореграммы. Размеры фореграммы определяются размером стекол, на которые нанесен гель.

Шесть лунок на фореграмме содержат определяемый антиген в известных концентрациях. В нижние лунки вносят антисыворотку с титром 1:128. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см и силе тока 1,5 MA/см. Участок фореграммы с окрашенными преципитатами вырезают, как описано. Окраску элюируют 3 мл 0,2 M Naацетатного буфера, рН 5,0, содержащего

0 1 g, ДДС Na, в течение 1 ч при 50 С. После замеров оптической плотности при 565 нм подбирают образец с известным содержанием антигена, оптическая плотность которого наиболее близка оптической плотности анализируемого образца. Далее из соотношения этих оптических плотностей определяют концентрацию ржавчинных антигенов в анализируемом образце и проводят пересчет на 1 г сырого веса.

В каждом образце грибные антигены определялись параллельно и методом ракетного электрофореза по Лоуреллу.

В табл. 1 представлены результаты сравнения определения грибных антигенов в листьях пшеницы методом ракетного алектрофореза и количественного электроосмофореза.

Как видно из табл.1, при определении грибного белка методом ракетного электро5 иммунофореза по Лореллу с использованием поливалентной сыворотки, реагирующей с множественными антигенами гриба, получаются резко (в 3-4 раза) заниженные результаты по сравнению с теми, которые дает

10 предлагаемый способ, предусматривающий фотометрирование красителя, связанного комплексом антиген — антитело.

Пример 2. К экстракту здоровых листьев пшеницы добавляют определенный

15 объем гомогената из уредоспор стеблевой ржавчины с известным содержанием белка и проводят определение антигена в экстракте методом количественного электрофореза.

Результаты определения приведены в

20 табл.2, Как видно из табл,2, предлагаемый способ отличается хорошей чувствительностью и точностью в достаточно широком диапазоне концентрации, 25

Формула изобретения

Способ иммуноэлектроосмофореза, включающий иммунопреципитацию с по30 мощью встречного иммуноэлектрофореза, окраску образующихся преципитатов, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью количественного определения антигена, после завершения иммуноэлектроосмофореза

35 вырезают участки геля с окрашенным преципитатом, элюируют их 0,1/-ным раствором додецилсульфата натрия. в 0,1 M ацетатном буфере рН 5,0 с последующим фотометрированием элюата.

1714511

Таблица 2

Составитель И. Баш каев

Редактор О.Юрковецкая Текред М.Моргентал . Корректор О.Кундрик

Заказ 689 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101