Способ определения гепарина в плазме крови

Способ определения гепарина в плазме крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторном методам определения концентрации гепарина в плазме крови . Цель изобретения - повышение точности способа и его ускорение. Способ состоит в титровании плазмы крови водным раствором интерполиэлектролитного комплекса , состоящего из полиметилакрилата натрия, меченного флуоресцентной меткой, и поли-Г -этил-4--винилпиридиния бромида при осново-молярном соотношении компонентов 10:(1 -2): 1 и концентрации комплекса осново-молей/л по метакрилату. Раствор комплекса добавляют в плазму до достижения точки излома кривой зависимости интенсивности флуоресценции от количества добавленного комплекса с последуюа1им расчетом количества гепарина по калибровочной кривой. Изобретение позволяет повысить чувствительность способа в 20 раз и ускорить его не менее, чем в 4,5 раза, 1 табл.

сОюз сОветских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з G 01 N 33/52

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4786572/14 (22) 25.01.90 (46) 15.03,92, Бюл. М 10 (71) 2-й Московский медицинский институт им, Н. И. Пирогова (72) В. С, Ефимов, В. А. Кабанов, В. А. Изумрудов, Г. В. Афанасьева, М. Я. Розкин, А. Б.

Зезин и А. И. Смирнов (53) 612.015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1075164, кл. 6 01 N 33/48, 1983, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕПАРИНА В

ПЛАЗМЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторным методам определения концентрации гепарина в плазме кро. ви. Цель изобретения — повышение точности способа ui его ускорение. Способ

Изобретение относится к медицине, а частности к лабораторным методам определения концентрации гепарина в плазме крови.

Цель изобретения — повышение точности способа и его ускорение.

Способ осуществляют следующим образом.

Плазму крови разводят, добавляют водный раствор нестехиометрического интерполиэлектролитного комплекса, содержащего полиметакрилат натрия, ме-. ченный флуоресцентной меткой, и полиN-атил-4-винилпиридиний .брамид при осномольном соотношении компонентов

10:1 — 2:1 и концентрации комплекса 10 .—

10 основомолей по метакрилату..

„„ lJ „„1720005 А) состоит в титровании плазмы крови водным раствором интерполиэлектролитного комплекса. состоящего из полиметилакрилата . натрия, меченного флуоресцентной меткой, и поли-N-этил-4-. винилпиридиния бромида при основа-малярном соотношении компо- . нентов 10:(1 — 2):1 и концентрации комплекса

10 -10 осново-молей/л по метакрилату.

Раствор комплекса добавляют в плазму до достижения точки излома кривой зависимости интенсивности флуоресценции от количества добавленного комплекса с последующим расчетом количества гепарина по калибровочной кривой. Изобретение позволяет повысить чувствительность способа в 20 раз и ускорить его не менее, чем в

4,5 раза, 1 табл.

Добавление раствора производят аликвотами до появления резкого изменения интенсивности флуоресценции, т,е. до достижения точки излома (точки эквивалентности) на кривой зависимости интенсивности флуоресценции от количества О добавленного полиэлектролитного комплекса.

1

Расчет концентрации гепарина прово- д дят с использованием предварительно построенной калибровочной кривой зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации гепарина.

Пример 1. Плазму получают центрифугированием цельной крови, взятой в силиконированные пробирки, содержащие . 3,8,(-ный раствор цитрата натрия в объем1720005 ном соотношении 9:1 (15 мин со скоростью

3000 об/мин). Полученную таким образом плазму разводят раствором трис-буфера в соотношении 1;4.

Подготовительным этапом является построение калибровочного графика, пригодного для работы весь период использования приготовленного раствора интерполиэлектролитного комплекса, который может храниться в течение длительного времени (не менее месяца) в условиях бытового холодильника (+4 С). Для работы использовался раствор 0,04 основомоль/л полиметакрилата натрия (мол,масса 3500, одна пиреновая метка на 260 мономерных звеньев), раствор

0,01 основомоль/л поли-N-атил-4-винилпиридиний бромида (мол.масса 290000 (соотношением компонентов комплекса 1:3) и

0,05 M трис-буфер с 0,05 M NaCI, Раствор нестехиометрического интерполиэлектролитного комплекса готовят путем добавления к 0,5 мл раствора полиметакрилата натрия 0,67 мл раствора поливинилпиридиний бромида, затем добавляют 0,2 мл

0,1 М раствора гидроокиси натрия и 3,63 мл трис-буфера, Рабочий раствор готовят разведением исходного раствора интерполиэлектролитного комплекса до концентрации от 10 до 10 раствором 0,05 М

NaCl в трис-буфере.

Измерение проводят на флуориметре

lY3 CS, длина волны возбужденйя 343 нм, длина волны регистрации 395 нм.

Для построения калибровочного графика в кювету, помещенную в флуориметр, вносят 2,0 мл разведенной плазмы, добавляют 10 мкл раствора интерполиэлектролитного. комплекса и регистрируют значение интенсивности флуоресценции как.начальную точку калибровочной кривой, Затем новую порцию плазмы, содержащую

0,005 ЕД гепарина, титровали рабочим раствором интерполиэлектролитного комплекса порциями по 10 мкл. Точка излома зависимости интенсивности флуоресценции от количества добавленного раствора полиэлектролитного. комплекса соответствует оттитрованному гепарину.

Аналогичная процедура проводится с образцами плазмы, содержащими 0,01;

0,015; 0,02; 0,025; 0,03 и т.д. до количества

1,0 ЕД гепарина.

Процедура исследования тестируемого образца плазмы протекает 8 пределах одной минуты и заключается в последовательном добавлении аликвот (10 мкл) нестехиометрического полиэлектролитного комплекса в рабочую кювету флуориметра, По точке излома кривой флуоресценции на калибровочной кривой определяется реальное значение количества гепарина в тестируемом образце плазмы.

Чувствительность метода 0,005 ЕД/мл.

К 1 мл образца плазмы кролика добав5 ляют 0,1 мл 0,001 j -ного раствора гепарина фирмы "Рихтер" (Венгрия) с активностью

130 ЕД/мг. В процессе титрования раствором интерполиэлектролитного комплекса в концентрации 10 5 точка излома наступает

10 после внесения шестой порции титрующего агента (60 мкл), что составляет по калибровочному графику 0,0275 ЕД. Результат подтверждает. соответствие установленного количества гепарина внесенному в плазму

15 перед титрованием. Титрование продолжалось 20 с.

Пример 2. По методике, описанной в примере 1, определяют концентрацию гепарина в плазме крови массой 4 кг, в кра20 евую вену уха которого введен гепарин в дозе 50 ЕД/кг. Кровь берут через 5 мин после введения антикоагулянта. Используют раствор интерполимерного комплекса в рабочей концентрации 10 . В результате

25 титрования плазмы интерполиэлектролитным комплексом в указанной концентрации определена точка излома, которая соответствует 0,175 ЕД гепарина. Титрование продолжается 45 с.

30 Пример 3. В плазме крови кролика, полученной в условиях, описанных в примере 2 и по методике, описанной в примере 1, определяют концентрацию гепарина с использованием рабочей концентрации ин35 терполиэлектролитного комплекса, равной

10 . В результате титрования плазмы интерполиэлектролитным комплексом в указанной концентрации определена точка излома, которая соответствует 0,175 ЕД ге40 парина. Титрование продолжается 40 с, Пример 4. Определение гепарина проводят, как в примере 1 при разных соотношениях компонентов полиэлектролитного комплекса и его концентрации 10

45 основомоль/л, Данные представлены в таблице.

Таким образом, преимуществами предложенного метода перед известным являются предел обнаружения гепарина в

50 плазме 0.005 ЕД (в 20 раз выше, чем по известному способу) и экспрессность метода-определение длится не более 60 с (по известному способу не более 45 мин) за счет определения концентрации гепарина

55 только в одном объеме плазмы крови при многократно повторяемой манипуляции последовательного добавления к ней постоянного объема водорастворимого нестехиометрического интерполиэлектролитного комплекса, содержащего флуорес1720005 центную метку. В случае массовых обследований время трудозатрат снижается более, чем в 4 раза.

Составитель Н.Гуляева

Редактор И.Сегляник Техред М.Моргентал Корректор М.Кучерявая, Заказ 769 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения

Способ определения гепарина в плазме крови, включающий титрование плазмы раствором нестехиометрического интерполиэлектролитного комплекса на основе соли поликарбоновой t " кислоты и полимерного основания, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа и его ускорения в качестве, интерполиэлектролитного комплекса используют водный раствор полиметакрилата натрия, меченного флуоресцентной меткой, и полиN-этил-4-винилпиридиния бромида при ос5 новомолярном соотношении компонентов

10 — 2:1 и концентрации комплекса 10

10 з основомоль/л по метакрилату, раствор комплекса добавляют в плазму до достижения точкой излома кривой зависимости ин10 тенсивности флуоресценции от количества добавленного комплекса с последующим расчетом количества гепарина по калибровочной кривой,