Способ выявления микобактериального антигена

Способ выявления микобактериального антигена

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: иммунология, диагностика инфекционных болезней. Сущность изобретения: к 0,1 %-ной водной суспензии латекса АКР-2 рН 7,6-7,8 добавляют у-глобулйн , выделенный из гипериммунной кроличьей антисыворотки к микобактериям. Смесь инкубируют Зч при комнатной температуре . Сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированием от несвязавшегося у-глобулина, отмывают бидистиллированной водой рН 7,6-7,8 однократно. Свободные альдегидные группы латекса блокируют 1 %-ным водным раствором глицирина рН 8,6-8,8 в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный конъюгат суспендируют в 1 %-ном растворе глицина рН 8,6-8,8. Постановку реакции агглютинации латекса осуществляют в 1%- ном водном растворе глицина. 1 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 33/569

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4658418/13 (22) 13.01.89 (46) 30.03.92,Бюл. N. 12 (71) Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РСФСР (72) З.Г.Воробьева, А.Л,Лазовская и

Ю,В.Лукин (53) 576.8.077.34 (088,8) (56) Труды. МХТИ, 1985, вып. 135, с. 88. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИАЛЬНОГО АНТИГЕНА (57) Использование: иммунология, диагностика инфекционных болезней. Сущность изобретения: к 0,1 -ной водной суспензии латекса AKP-2 рН 7,6 — 7,8 добавляют у-глоИзобретение относится к иммунологии, а именно к диагностике инфекционных болезней, Цель изобретения — повышение точности способа, Пример 1. Постановка реакции латекс-агглютинации с антигеном из

M.smegmatis.

К 0,5 мл 0,1%-ной водной суспензии ла- . текса AKP — 2 (рН 7,6-7,8) добавляют 10,0 мг у-глобулина, выделенного из гипериммун- . ной кроличьей антисыворотки . к

М,smegmatis. Смесь инкубируют в течение

3 ч при комнатной температуре с осторожным помешиванием. Сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированием при 3000 об!мин и отмывают от несвязавш е го с я у-глобулйна бидистил лиро ванной водой (рН 7,6 — 7,8) однократно. Свободные

anьдегидные группы латекса блокируют 1%ным водным раствором глицина(рН 8,6 — 8,8) „„5U„„ 1723526 А1 булин, выделенный из гипериммунной кроличьей антисыворотки к микобактериям.

Смесь инкубируют 3ч при комнатной температуре. Сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированием от несвязавшегося глобулина, отмывают бидистиллированной водой рН 7,6-7,8 однократно. Свободные альдегидные группы латекса блокируют 1%-ным водным раствором глицирина рН 8,6 — 8,8 в течение 30 мин при комнатной температуре, Полученный коньюгат суспендируют в 1 g -ном растворе глицина рН 8,6 — 8,8. Постановку реакции агглютинации латекса осуществляют в 1 ном водном растворе глицина. 1 табл, в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный коньюгат суспендируют в

2,5 мл 1 -ного раствора глицина (рН 8,68,8). Контрольный коньюгат —. латекс после инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в 1 g,-ном водном растворе глицина. Постановку реакции проводят в планшетах для иммунологических реакций, Антиген готовят из М.smegmatis путем ультразвукового разрушения бактериальных клеток. Концентрация белка в первой лунке

100 мкг. Титрование до разведения 1:1024 проводят двухкратным разведением его 1 (,ным водным раствором глицина (рН 8,6). В каждую лунку с 50 мкл раствором антигена добавляют по 50 мкл антительного латексного диагностикума.

Контроль: 50 мкл сенсибилизированного латекса и 50 мкл 10/О-ного водного раствора глицина (рН 8,6);

1723526

50 мкл контрольного латекса и 50 мкл

1 -ного водного раствора глицина (рН 8,6);

20 мкл контрольного латексэ и 50 мкл раствора антигена в первом разведении.

В реакции с сенсибилизированным латексом агглютинация с образованием "зонтика" (+++) наблюдалась в титре 1;32, зонтик (++) — в титре 1:64, "кружок" (+) — в титре

1:128.

В контрольных пробах все реакции отрицательные (осадок в виде точек), Пример 2. К 5,0 мл 0,1 -ной водной суспензии латекса (рН 7,6) добавляют

10,0 мг глобулинэ, выделенного из гипериммунной кроличьей антисыворотки к

M.avlum. Смесь инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре, осторожно помешивают. Сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированием при

3000 об/мин и отмывают от несвязавшегося у-глобулина бидистиллированной водой (рН 7,6) однократно. Свободные альдегидные группы латекса блокируют 1%-ным водным раствором глицина (рН 7,6) в течение

30 мин при комнатной температуре. Полученный коньюгат суспендируют в 2,5 мл

1 /,-ного водного раствора глицина (рН 8,8).

Контрольный конъюгат — латекс после инкубации а 1 -ном водном растворе глицина (рН 7,7) в течение 30 мин при комнатной температуре. Антиген из M,avium готовят путем ультразвукового разрушения бактериальных клеток. Концентрация антигена в первой лунке 200 мкг. Титрование антигена проводят 1 /-ным водным раствором глицина (рН 8,8) способом двукратного разведения, В каждую лунку с 50 мкл раствора антигенэ добавляют по 50 мкл антительного латексного диагностикума. Контрольные постановки реакции латекс-агглютинации, как в примере 1.

Агглютинация частиц лэтексэ наблюдалась до титра 1:512.

В контрольных пробах все реакции были четко отрицательные (осадок латекса в виде точек).

Пример 3. К 0,5 мл 0,1 /-ной водной суспензии латекса (рН 7,8) добавляют

10,0 мкг>глобулина, выделенного из гипериммунной кроличьей антисыворотки к

М.vatlae, Дальнейшая обработка латекса, как в примере 2, с использованием для отмывки. коньюгата бидистиллированной воды (pH 7,8), а для блокирования свободных альдегидных групп — 1 /-ного водного раствора глицина (рН 7,8). В качестве рабочего используют 1 -ный водный раствор глицина (рН 8 8). Реакцию латекс-агглютинации проводятссуспензией клеток ELl>K, концен5

40 трация которых в первой лунке 75 мкг. Постановка реакции и контроль, как в примере

Агглютинация частиц латекса наблюдалась до концентрации бактериальных клеток 4,5 мкг.

В контрольных пробах все реакции были четко отрицательные (осадок латекса в виде точек), Сравнительная постановка реакции агглютинации латекса с антительным латекСным диагностикумом, полученным сенсибилизацией антителами против

М.bovis в водной среде (рН 7,8), осуществляют с антигенными препаратами из

М,bovis, BCG, M.tuberculosis, М.avium, М iortuitum, М smegmatisl.

По предлагаемому способу(разводящая жидкость: 1 -ный водный раствор глицина, рН 8,6), а по известному способу разводящая жидкость: 1О/-ный раствор глицинэ в

0,85 / -ном растворе NaCI, забуференном фосфатн ы м буфером, р Н 8,6.

Исходная концентрация белка в исследуемых дезинтегратах микобактерий

2 мг/мл; исходная концентрация микобактериальных клеток 1,5 мг/мл.

Полученные результаты приведены в таблице, Результаты реакции контрольного латекса с исследуемыми препаратами по предлагаемому способу во всех реакциях были отрицательными. В сравниваемом способе во всех разведениях с контрольным латексом наблюдалась спонтанная агглютинация.

Таким образом, сенсибилизация латекса антителами в бидистиллированной воде и постановка реакции в водным растворе глицина позволяет повысить специфичность реакции латекс-агглютинации за счет ликвидации явлений спонтанной агглютинации.

Формула изобретения

Способ выявления микобактериального антигена, включающий сенсибилизацию латекса антителами при рН 7,6-7,8, блокаду свободных альдегидных групп глицином при рН 7,6 — 7,8, смешивание полученного диагностикума с раствором исследуемого микробного дезинтеграта при рН 8,6 — 8,8 и учет результатов по агглютинации латекса, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, сенсибилизацию латекса проводят в бидистиллированной воде, а перед смешиванием диагностикум и микробный дезинтеграт разводят в 1 /-HQM водном растворе глицина.

1723526

S

lO о

L

S с

>Х

Х

Iо

Э

l0

С0

ЛЕ

S х

Э

СХ

Э

Ш а

S а с

0ъ

Ю о о о с о о с

1

1 1

1

1

1

1 1

1 1

I .Д 1

I ° О 1

I . 1

I е 1

1 1 1

1

СЧ 1

1 т —

+! +l +i и

1 о

Ф

1с

S

Э

)X

Э

С5

tg с с

Ф а

С:

+ +

+ + ф

+ +

+l я

lo о

У о

К

tg

Х с

Ф

S

Х

С5

CL

С !

+ +

+ + +

+ + +

t5

Х о

I5

I» о о

+l +i

1 б б

+1 1!

С!0

Ф

Х

0 а.

>Х

4I

Х

Э

S бX

1 н

Я

° л о .о

Е бС5 а

Ф °

Х IC

S S

Ссб CL

Э Э

Ч Сб

IС5 а

Э

S

Ф ч бЯ

Z!

Ф з с

Ф с о о

Л»

lС5

CL

С5 с

Ф

CL

Сб М сч м

tC

X а а

Ф Ф

Сб O

СХ

S S . а а

Ф Ф

o o

СС IC

S X а а

Ф Ф

o o ..

IC

S а

Э

СЪ

Z о

Э

Iс

1

Ф

1S

IZ

fg о

X

=г

fg

S

IQ с

L б

tg

1 о

Э бIg с

S

:Г

Ig

I

1 !

1.

1

1

1 б

1

1

I

1

1

l

I

1

1

1

1

1

1

1

1 1

1 1

1 I I I

1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

I 1

1 О 1

1» 1

I 1

1 1

1 1

1 1

I сЧ 1 м

1 ! % — 1

l l

I 1

I 1

1 1 (О 1

1»- 1

1 1

1 — 1

1 1

1 1

I 1

1 1

I CO 1

1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

1 - 1

1 . 1

4 — — 4

l 1

1 cV 1 м б

I » 1

I т — I

1 1

I 1

1 I б

I ъО 1

1» I

I 1

1 ! I

Г 1

1 I .I б

I cO

I W l

1» 1

I t

1 1

1 1

1 1

1 -Ф I

1 1 — I

I l

l I

I 1

1 1

1 СМ 1

I W I

1»- 1

1

I

1

I

I

1

1

1

1

1

1 !

1

+ Ф +

+ + + + l Iф С5 а CL

L IЭ вЂ” N Ф

Н

IC K

S S

tg a a. в.л

Ф Ф Ф Ф

Ч о о Ч44 б»

С5

CL

L. с4 Ф

К IC Х

S л а а m44 сб o ч3

1 1

+ 4 + +

1 б

11 111

1 1 +! I +

О и

Со

С4

Y СС

S а а Ф а

e e С Ф

o o ы и

1723526

1

I (1

l

l !

1

1

1

I

)

° 1 (1

1 (l

I

I

1

1

1 !

1

1 (I (1 !

1

1

1 1

Г 1 (1

) 1! ) ) I 1!

1 -2 1

I ).) 1

1 I

1 - !

1 I

1 1

1 (СЧ 1 м

l I (- 1 (1!

I (1

1 i(.) I

I - 1.

I 1

1 1

1 1

1 1, 1 1

1 1

l 00 I

1 l °

1 - l! 1

1 1

1 -Ф 1

l л. I

1 ) I

1 1

Г 1

1 1

1 1

1 Г) 1

1 л 1

1 - ) :Г

S (lO

Щ

lZ ( х л а

)Я л

0)

Z (D

% с о с о

Z с

Э

lS

Z о

Y о

% о о а.

)S т

lo (D (()

Y

3 о

+ +

+ +

М

X

Z

Э т

Э с

Ф (() х о

Х

У о

})Х о (о

М

S (Z л

CL

Э с

1 1

)S

Э

Щ ()(}

) с (D

Ф

Ф х о=

)D S о

С S

+:

° ë

Э а, I- С

Э (D

=Г S

Ф IЩ

X }о л

I л

>)

Y т

О) с

Я

О)

Z ( о (()

r

lZ о

Ф

+ +

+ + 1

1 I I

+ +

+ +

+ + !

I I 1

+ (-С ) (() ()) о в о а а

) о

).) в (:) )т

Z

Э

s

Iт

f()

)т

Э с о

Бл

И

2 и

) и и о и (Ч

S к х

S }а Э э. с

О Ы.( и (б

Б

И в

s

Y (1

S )- S а во. э с в

О У О

Е

)(D с

Х

)ч м

S (). "Y ():

S S }-S а а в а в в с в

О О) У О) (О а

Ф

Э

Cl (:

S а в () а

Э

Cl

Э

L) 1

I

)

I

1

1

1

1

)

1

1 (I

I

l

1

1

l

1

1

I

1

1

1

1

I (l

l

l

1

1

1

1

1 ! (l !

I

1

1

1

1

1

)

l !

1

1

1

1

I

S

Z

Э с

Э а

S а с

О)

lQ о о о

): о о

S

Z

L

Щ ! о

ID

}с

S

Y (()

Э (() х о т о о! (-4 f

1)О 1

I (1 I .(— — (1 I

1 1 (4

1 М 1

1 . I

1 ) — 1

1 (1

I 1

1 I

I О

1 I ! 1

1 - I

1 1

I 1

1 1

1 1

1 CO 1

1 1

I )- () 1

Г 1 (1

1 -1

1 ч 1

I ° I

1 1

l 1

1 1

1 I

1 ()(1

1 1

1 1

1

I

1 ! ! (1 (1

I

1

1

1

I

1 (t

+ + + +

+ +++ + +1 Ф

I + + ) (1 I

I !

1

)

I

+ 1 (1

I

+ 1

+

1

1 .1

1

1

+ 1

+ 1

+ 1

+ 1 (I

+ 1

+ 1

+ 1

+ I

1

1

+ 1

1

1

1 1

1

I !

1

1 1

1

1

I

1 1

1

1

1

I 1

I .1

t

1 1

1

1

+1(1

1 (1

1

1

1

1

1

I

1 ((1

К 1

S I