Рекомбинантная плазмидная днк @ 10fmd, кодирующая гибридный белок р204-as @ р @ с @ с @ - vpi/200-213/ р @ р @ s @ р @ ( 131-160) и штамм бактерий еsснеriснiа coli -продуцент гибридного белка р204- а @ р @ с @ с @ v pi/200-213/-р @ р @ s @ р @ - vpi /131-160/

Рекомбинантная плазмидная днк @ 10fmd, кодирующая гибридный белок р204-as @ р @ с @ с @ - vpi/200-213/ р @ р @ s @ р @ ( 131-160) и штамм бактерий еsснеriснiа coli -продуцент гибридного белка р204- а @ р @ с @ с @ v pi/200-213/-р @ р @ s @ р @ - vpi /131-160/

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к генетической инженерии; и представляет собой сконструированную In vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в состав которого входят антигенные детерминанты вируса ящура, промоторы ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок инициации трансляции, обуславливающий биосинтез полипептида, вызывающего при иммунизации экспериментальных животных образование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. coli - продуцент этого полипептида . Рекомбинантная плазмидная ДНК plOFMD кодирует иммуногенный полипептид Р204, в котором аминокислотная последовательность фактора некроза опухолей человека своим С-концом соединена с аминокислотной последовательностью AspProCysCys-VP1(200-

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ((9) ((!) (s()s С 12 N 15/42, 1/21

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4841272/13 (22) 20.06.90 (46) 07,04.92. Бюл, N. 13 (71) Институт биоорганической химии им.

M.M.Øåìÿêèíà и Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт (72) В.Г.Коробко, С.А.Филиппов, В.Н,Добрынин, Е.Ф.Болдырева, А.В.Микульскис, О.В.Некрасова, В.Н.Иванющенков, А.Н. Бурдов, Н.H.Äðÿràëèí и А.B.×åïópêèí (53) 575.224.2,577,2(058) (088.8) (56) Биоорганическая химия, 1989, т. 15, N.

4, с. 508-513, Биоорганическая химия, 1986, т. 12, М

3. с. 416 — 419. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК p10FMD, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДН ЫЙ БЕЛОК Р204-AspProCysCys-VP1(200213) ProProSerPro(131-160) И ШТАММ

БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI — ПРОДУ-.

ЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА Р204AspProCysCys-VP1(200-213)-РгоРго$егРго

-V P 1(131-160) (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии; и представляет собой сконструированную In

vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в состав которого входят антигенные детерминанты вируса ящура. промоторы ранней области бактериофага

Т7 и синтетический участок инициации трансляции, обуславливающий биосинтез

Изобретение относится к бимехнологии. в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную In.

vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, сополипептида, вызывающего при иммунизации экспериментальных животных образование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е, coll — продуцент этого полипептида. Рекомбинантная плаэмидная ДНК

p10FMD кодирует иммуногенный полипептид Р204, в котором аминокислотная последовательность фактора некроза опухолей человека своим С-концом соединена с аминокислотной последовательностью AsрРгоСузCys-V Ð1(200—

213) — РгоРго$егРго-VP1(131 160), в которую входят антигенные эпитопы белка оболочки УР1 вируса ящура (подтип Ал).

Она состоит из $аиЗА1/Hindlll- ôðàãìåíòà

ДНК плазмиды plNF314 Л, содержащего тандем промоторов А2 и АЗ ранней области бактериофага Т7, полусинтетический ген фактора некроза опухолей человека с искусственным участком инициации трансляции, терминатор транскрипции фага лямбда и

reí j3 -лактамазы, и Sau3A1/Hlndil!-фрагмента, содержащего синтетический ген, кодирующий пептидную антигенную детерминанту вируса ящура (штамм An), При трансформации плазмидой p10FMD компетентных клеток Е. coll SG20050 получают штамм — продуцент иммуногенного полипептида Р204. вызывающего образование антител, нейтрализующих штамм An вируса ящура. 2 с.п. ф-лы, 1. ил., 2 табл, держащую искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в состав которого входят антигенные детерминанты вируса ящура, промоторы ранней области бактериофага

1724691

45 синтеза

55

Т7 и синтетический участок инициации трансляции, обуславливающий биосинтез полипептида, вызывающего при иммунизации экспериментальных животных образование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. coll — продуцент этого полипептида.

Вирус ящура вызывает высококонтагиозное заболевание парнокопытных сельскохозяйственных животных, наносящее значительный ущерб, В качестве вакцины против ящура используют инактивированный вирус, Технология приготовления такой вакцины требует опасного крупномасштабного культивирования вирулентного вируса.

Недостатком ее применения являются вспышки заболевания, вызванные не полностью инактивированным вирусом.

Вирус ящура представляет собой нуклеопротеид, состоящий из одной молекулы одноцепочечной значащей PHK и 60 копий каждого из капсидных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Поверхностный белок VP1 является главным антигеном и способен инициировать при вакцинации образование вирусней- рализующих антител.

Однако полученный в чистом виде иэ вирусной частицы или технологией рекомбинантных ДНК белок VP1 вызывает слабый иммунный ответ, и поэтому не может использоваться в качестве субьединичной вакцины.

Альтернативный подход к созданию субьединичных вакцин против ящура вытекает из наблюдения, что синтетические пептиды,, включающие аминокислотные последовательности 141 — 160 и 200 — 213 белка VP1, при иммунизации в виде коньюгатов с белком-носителем вызывают образование значительного уровня вируснейтрализующих антител.

Однако и в этом случае иммуногенность наиболее активного из этих пептидов остается в 100 — 1000 раз ниже, чем иммуногенность целого вируса.

Трудности в создании субьединичной вакцины можно преодолеть, используя для синтеза иммуногенного пептида технологию рекомбинантных ДНК.

Известна рекомбинантная плазмида

pFMD65, кодирующая гибридный белок, в котором аминокислотная последовательность Р-галактозидазы Е. coll соединена с повторяющейся последовательностью 141—

160 белка VP1 вируса ящура (штамм 01К).

Методами иммунодиффузии и иммуноферментного анализа показано, что гибридный белок, продуцируемый бактериями, содержащими рекомбинантную плазмиду

pFMD65, специфически связывается с антителами к целому вирусу ящура 01К и к фрагменту 136-148 капсидного белка VP1.

Известны рекомбинантные плазмиды рМО1-71, рМО1-72, рМ01-74 и рМО1-78, кодирующие гибридные белки, в которых единичная или повторяющиеся последовательности 137 — 162 поверхностного белка VP1 вируса ящура (штамм 01, BFS) слиты с последовательностью Р -галактозидазы Е. coll, Кодируемые этими плазмидами гибридные белки способны при иммунизации морских свинок вызывать появление вирусспецифических антител, взаимодействующих в иммуноферментном тесте и иммуноблоттинге с рекомбинантным антигеном.

Однако данные о способности получаемых антител нейтрализовать вирус и предотвратить инфекцию отсутствуют.

По принципу конструирования рекомбинантная плазмида pFMD65,. кодирующая гибрид Р-галактозидаза — антигенная детерминанта вируса ящура 01К, является наиболее близким к предлагаемому решением, Недостатком перечисленных плазмидных конструкций является то, что все они кодируют гибридные белки, в которых пептиды антигенных детерминант соединены с

Р-галактозидазой Е, coll. Однако сама бактериальная Р-галактозидаза является достаточно сильным иммуногеном. Кро -е того, доля пептидного фрагмента в таком сплавленном белке слишком мала. чтобы вносить существенный вклад в иммунный ответ.

Цель изобретения — конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК p10FMD, кодирующей биосинтез иммуногенного полипептида Р204, которые инициируют образование нейтралиэующих антител против штамма А22 вируса ящура, и бактериального штамма E. coll SG20050/p10FMD (ВКПМ В5297) — продуцента этого полипептида, обеспечивающего высокий уровень его биоКодируемый плаэмидой p10FMD иммуногенный полипептид состоит из аминокислотной последовательности фактора некроза опухолей человека, соединенной своим С-концом с последовательностью универсальной антигенной детерминанты вируса ящура (последовательность 200-213 аминокислот белка VP1), которая посредством пептидного спейсера ProProSerPro. обеспечивающего изгиб полипептидной цепи, соединена с последовательностью главной вариабельной антигенной детерминанты вируса ящура (последова1724691

10

25

55 тельность 131--160 белка VP1). Выбор этой последовательности обусловлен данными по локализации главного иммуногенного эпитопа вируса ящура и обеспечивает моделирование пространственной сближенности двух Q-спиралей антигенных детерминант. В структуре иммуногенных полипептидов последовательность фактора некроза опухолей человека соединена с последовательностью пептидных антигенных детерминант вируса ящура через дипептид

AspPro, что обеспечивает в случае необходимости воэможность отщепления иммуногенных пептидов в условиях мягкого кислотного гидролиэа.

Рекомбинантная плазмидная ДНК

p10FMD, кодирующая иммуногенный полипептид Р204, характеризуется следующими.признаками: кодирует аминокислотную последовательность гибридного белка— фактор некроза опухолей человека—

AspProCysCys-VP1(200-213)-ProProSerPro

-VP1(131 — 160); имеет мол.м. 2,49 Мд (3,81 т. п,о.); состоит из Sau3AI /Hindi II — фрагмента ДНК плазмиды рТМР314Л, содержащего тандем промоторов А2 и AÇ ранней области бактериофага Т7, полусинтетический ген фактора некроза опухолей человека с искусственным участком инициации трансляции, терминатор транскрипции фага лямбда и ген j3-лактамазы (3,66 т.п.о.). Sau3AI/Hlndlll — фрагмента, содержащего синтетический ген, кодирующий пептиды антигенных детерминант вируса ящура (штамм A22); а также содержит в качестве генетического маркера ген /3-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой p10FMD клеток Е. coll ê пенициллиновым антибиотикам, уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях вправо от сайта BstEII: BamHI —. 73 нуклеотида, Вд!И вЂ” 154 нуклеотида, Xhol—

174 нуклеотида, Hindlll — 241 нуклеотида, Ncol — 574 нуклеотида, Pst i 2418 нуклеотидов.

На схеме изображены лигэзные сшивки синтетических олигонуклеотидов в двухцепочечные ДНК (сегменты А и В), кодирующие пептиды — антигенные детерминанты белка оболочки VP1 вируса ящура (подтип

A22).

Для получения двухцепочечных ДНК, кодирующих антигенные детерминанты вируса ящура (сегменты А и B) амидофосфитным способом синтезируют двенадцать олигонуклеотидов величиной от 14 до 43 нуклеотидных звеньев, которые затем соединяют при помощи ДНК-лигазы.

Для дальнейшего конструирования используют рекомбинантную плазмиду

pTNF314 Л, которая является производной плазмиды pTNF311h с измененной с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза С-концевой частью искусственного гена фактора некроза опухолей человека. В результате в самый С-конец гена был введен уникальный для этой плаэмиды рестриктный сайт Bglll. ДНК плазмиды pTNF3146 расщепляют эндонуклеазами ВдЪ! и Н! пд lil, больший фрагмент выделяют и лигируют с избытком нефосфорилированного сегмента

А. Аликвоту реакционной смеси исполь.".уют для трансформации компетентных клеток Е. со11 НВ101. Трансформанты высевэют на

1 В-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина, и скрининг колоний проводят гибридизацией с 5 -t P)-меченным олизг гонуклеотидом Vill. Из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК pSFMD, строение которой подтверждают рестриктным анализом с помощью эндонуклеаз

HaeIll и Mspi, а также определением нуклеотидной последовательности части плаэмидной ДНК между сайтами рестриктаз

Hindi l l u BamHI.

Для конструирования новой рекомбинантной плазмиды p10FMD плазмидную

ДНК p8FM0 сначала линеариэуют гидролизом эндонуклеазы Pstl,.à затем полученную таким образом линейную форму ДНК подвергают действию рестриктазы Kpnl. Из образовавшейся смеси фрагмент величиной около 2,2 т.п.î. выделяют электрофорезом в

1 геле легкоплавкой агарозы. С другой стороны ДНК плазмиды pTNF314h, гидролизуют смесью рестриктаз Bg31 и Pstl. Выделенный электрофорезом как описано

PstI/Bglll — фрагмент величиной около 1,6 т.п.о. лигируют в присутствии большого избытка синтетического сегмента В с

Pstl/Êðï(— фрагментом ДНК плазмиды

p8FMD величиной около 2,2 т.п.о, Частью лигаэной смеси трансформируют компетентные клетки Е, со11 НВ101; трансформанты высевают на 1,77;-ный 1 В-агар, содержащий 50 мкгlмл эмпициллина. Скрининг проводят путем in situ гибридизации колоний с

5 -(Р)-меченным олигонуклеотидом Xiii, Выделенную из гибридиэующихся колоний

ДНК плаэмиды p10FMD: анализируют при помощи рестриктаз Mspl и НаеИ1и ее структуру подтверждают определением нуклеотидной последовательности в районе клонирования сегмента В.

Рекомбинантная плаэмида p10FMD кодирует иммуногенныйполипептид Р204, который представляет собой белок фактора

1724691 некроза опухолей человека, слитый через дипептид AspPro с последовательностью антигенной детерминанты подтипа А22 вируса ящура. .Для получения бактериального штамма — продуцента иммуногенного полипептида

Р204 плазмидой p10FMD трансформируют компетентные клетки Е. coll SG20050, Полученные таким образом штаммы E.

colt SG20050/p10FMD (В КПМ В-5297) характеризуются следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамьтрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут.на простых питательных средах, При росте на arape "Дифко" колонии круглые, гладкие, прижаты, мутные, блестящие, серые, край ровный, При росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки, Клетки растут при температуре от 4 до

40 С при оптимуме рН от 6,8 до 7.0. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.р. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам.

Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды, а также к тетрациклину (цо 30 мкг/мл), благодаря наличию транспозона.

Штамм E. coll SG20050/p10FMD обуславливает конститутивный синтез больших количеств (свыше 25 тотального клеточного белка бактерий) иммуногенного полипептида Р204, способного при иммунизации животных вызывать образование антител, нейтрализующих штамм Azz вируса ящура, Пример 1, Химический синтез и лигирование олигонуклеотидов..

Синтез олигонуклеотидов выполняюттвердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе System 1 (Beckman) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3 -конца к 5 -концу с помощью защищенных фосфамидитов — 5диметокситритил-N-ацил-2-дезоксинуклеозид-3 5

-0-(метоксидиизоп роп илами но)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5 — 0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А, размер частиц 40-80 мкм), к которому через 3 -сукцинатную связь присоединяют первое нуклеоэидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют описанный синтетический цикл, но после реакции кон5 денсации проводят промывку смолы смесью тетрагидрофуран — пиридин-вода (5:3:2). После окончания синтеза защитные группы удаляют последовательной обработкой тиофенолятом триэтиламмония и кон10 центрированным аммиаком. При этом происходит отделение олигонуклеотида от носителя. 5 -Диметокситритильную группу удаляют кислотной обработкой, и олигонуклеотид очищают электрофорезом в 20 15 ном ПААГ, содержащем 7М мочевину.

Выход 1-5 о.е.

Лигазную сшивку проводят следующим образом, Смесь 250 пмоль каждого из нефосфорилированных олигонуклеотидов (I) и

20 (Х) и 200 пмоль каждого из фосфорилированных олигонуклеотидов (Н) — (V), (И1!) и (IX) нагревают 10 мин при 90 С в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5) и 10 мМ MgC4, затем медленно охлаждают до

25 15 С, прибавляют гАТР до концентрации 0,2 мМ, дитиотреитдо концентрации 5 мМ и 100 ед-. Т4 ДНК-лигазы; Смесь инкубируют 6 ч и ри 15 С, затем депротеинизируют двукратной фенольной экстракцией фенолом. ДНК

30 высаживают этанолом, продукты сшивки выделяют при помощи электрофореза в

15 -ном ПААГ, содержащем 7 M мочевину.

Нужный полинуклеотид выделяют из геля электроэлюцией на ОЕАЕ-бумагу ОЕ-81, ко35 торую промывают несколько раз ТЕ-буфером (10.мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,5 мМ EDTA) и этанолом. Нуклеотидный материал элюируют при помощи 1,5 М раствора NaCI в

ТЕ-буфере и обессоливают на колонке с се40 фадексом G-50. Выход сегмента А 180 пмоль. Аналогичным образом получают сегмент В. Выход 160 пмоль.

Пример 2, Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК p8FMD.

45 Клетки бактерий Е. coll НВ101, содержащие плазмидную ДНК pTNF314b, выращивают при 37 С в LB-бульоне, содержащем

100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем плазмидную ДНК выделяют в

50 соответствии с обычной процедурой с модификациями, заключающимися в том, что к супернатанту, полученному после подкисления ацетатом натрия, прибавляют РНКазу А до концентрации t0 мкг/мл, смесь инкуби5 руют 20 мин при 370С, зкстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1:1) и ДН К высаживают этанолом. Осадок растворяют в TEбуфере, содержащем 1 М NaCI, прибавляют полиэтиленгликоль PEG-6000 до концентрации 1,5%, выдерживают 1 ч при 00С цент1724691

55 рифугируют 10 мин при 10000 об/мин, а осадок промывают 70;ь-ным этанолом, высушивают и растворяют в ТЕ-буфере. Выход плаэмидной ДНК определяют спектрофотометрически при 260 нм с использованием 5 коэффициента экстинкции 20 о.е. / мг.

Раствор 2 мкг плаэмиды pTNF314h, в 30 мкл буфера R, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5), 50 MM NaCI, 10 мМ МдС12,7мМ меркаптоэтанол, инкубируют со смесью ре- 10 стриктаз Hindtll и В91П (по 10 ед.каждой) в течение 1 ч при 37 С. После инкубации реакцию останавливают двукратной экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1) и векторный фрагмент очищают электрофоре- 15 зом в 1 -ном геле легкоплавкой агарозы, Д Н К выделя ют методом замораживания/оттаивания и высаживают 70 -ным этанолом, К раствору 0,2 мкг полученного таким образом вектора в 20 мкл буфера L, 20 содержащего 20 м М трис-Н С! (р Н 7,5), 10 мМ

MgClz, 0,2 мМ rATP и 5 мМ дитиотреит, прибавляют 0.1 мкг сегмента А и 20 ед, Т4 ДНКлигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15 С, затем аликвоту (1/4) реакционной смеси ис- 25 пользуют для трансформации компетентных Е. coil, Трансформацию проводят следующим образом. Предварительно клетки Е. coll НВ101 высевают на агар, со-. держащий среду М9, 0,2 глюкозы и 2 30 мкг/мл тиамина, Единичную колонию вно.сят в 50 мл питательного бульона LB и выращивают при 37 С до мутности 0,3 — 0,5.

Затем клетки охлаждают, осаждают центрифугированием (10 мин, 5000 об/мин), про- 35 мывают раствором .10 мМ Mg Clz, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1

М раствора CaClz и выдерживают при 0 С в течение 30 мин. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М CaClz и 40 через 3 ч используют для трансформации. С этой целью 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл 0,05 M CaClz, затем прибавляют

150 мкл суспензии. компетентных клеток, выдерживают и ри 0 С, затем 2 мин и ри 42 С 45 и снова 10 мин при 0 С. после чего прибавляют 2 мл LB-бульона, инкубируют 1 ч при

37ОС и аликвоты высевают на чашки с LBагаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл). Клоны бактерий; содержащие целе- 50 вую плазмиду pSFMD, идентифицируют гибоидиэацией с одним из олигонуклеотидов

P-VIll, входящих в состав клонируемого сегмента А. Из гибридизующихся с этой пробой клонов выделяют плазмидную ДНК, строение которой подтверждают рестриктным анализом с помощью рестриктаз НаеИ1 и Mspl. Окончательно структуру рекомбинантной плазмиды p8FMD подтверждают определением нуклеотидной последовательности плазмиды в области вставки синтетической ДН К.

Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК p10FMD.

К раствору 10мкг ДНК плаэмиды pSFMD в 80 мкл буфера R прибавляют 20 ед, каждой из рестрикционных нуклеаз Pstl u Kpnl u инкубируют 90 мин при 37 С. Анализ полноты гидролиза и выделение векторного

Kpnl/Pstl — фрагмента (2,2 т,п.о.) проводят при помощи электрофореза в 1 -ном геле легкоплавкой агарозы. Одновременно 10 мкг ДНК плазмиды рТЙЕ314Л в 100 мкл буфера R обрабатывают 1,5ч при 37 С 20 ед. каждой иэ рестриктаз Bglll и Kpnl, после чего фрагмент величиной около 1,6 т.п.о., содержащий синтетический ген антигенной детерминанты, выделяют при помощи электрофореза в 1 g,-ном геле легкоплавкой агарозы, как описано в примере 1. Далее этот фрагмент (0,2 мкг) соединяют в присутствии

0;3 мкг сегмента В с векторной ДНК(1,5 мкг) при помощи 30 ед. Т4 ДНК лигаэы в 50 мкл буфера 1 в течение 6 ч при 15ОС. Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coll

НВ101, Трансформанты высевают на агаризованную среду, содержащую ампициллин (50 мкг/мл). Скрининг бактериальных клонов, содержащих рекомбинантную плазмиду p10FMD, проводят гибридизацией колоний 1и situ c P-меченным олигонуклеотидом (XIV). Из клонов, гибридизующихся с радиоактивной пробой, выделяют плазмидную ДНК p10FM0, строение которой подтверждают гидролизом рестриктазами

Mspl и Haelli, а также определением нуклеотидной последовательности в районе вставки синтетического дуплекса.

Пример 4, Получение. штамма— продуцента иммуногенного полипептида, вызывающего образование антител, нейтрализующих штамм Azz вируса ящура.

Плазмидой p10FMD трансформируют компетентные клетки Е. со11SG20050 по методу, описанному в примере 1, и получают штамм Е, coll ВКПМ В-5297 — продуцент иммуногенного полипептида, вызывающего образование антител, нейтралиэующих штамм Azz вируса ящура.

Пример 5. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного полипептида

Р204 (биологические испытания).

Для иммунизации лабораторных животных выделенный из биомассы штамма— продуцента рекомбинантный белок Р204 при определенной концентрации смешивают в равном объемном соотношении с неполным адъювантом Фрейнда. Группе морских свинок или кроликов массой соот1724691

Таблица 1

Количество животных

Средний титр

ВНА

Кратность введения

Интервал введения, ни

Доза. мкг

Группа животных

5,2

6,6

150

Таблица 2 ветственно 0.5 или 2,0 кг вводят вакцинирующий раствор однократно или двукратно в обьеме 1,0 мл в дозе 150-200 мкг. Вторую иммунизацию проводят через 38-42 дня после первой, Вируснейтрализующие антитела определяют на 47-60 день после первой иммунизации на культуре клеток свиной почки против 100 ТЦД о вируса ящура подтипа А22.

На 47-55 день после первой иммунизации морских свинок заражают введением

500 ИДщ вируса ящура Azz, адаптированного к организму морских свинок, и определяют протективный эффект.

Данные титрования вируснейтрализующих антител и протективный эффект, исследованные на кроликах и морских свинках, приведены в табл. 1 и 2 соответственно.

Таким образом, рекомбинантный белок

Р204, выделенный из биомассы штамма— продуцента ВКПМ В-5296, обладает защитным действием против вируса ящура подтипа А22 и индуцирует высокий уровень вируснейтрализующих антител у кроликов и морских свинок, Формула изобретения

".. Рекомбинантная плазмидная ДНК р10ЕМО, кодирующая гибридный белок

Р204-As p Pro Cys Cys-VP1(200-213)

ProProSerPro(131-160), мол,м. 2,49 Мд и размером 3,81 т.п.о., содержащая ЯавЗА1Hindi! — фрагмент ДН К-плаэмиды

5 рТМРЗ14Л с тандемом промоторов А2 и АЗ ранней области бактериофага Т7, полусинтетическим геном фактора некроза опухолей человека и искусственным участком инициации трансляции, терминатором

10 транскрипции фага лямбда и геном Р-лактамазы размером 3,66 т.п.о.; Hindi 1l-ЗаиЗА1— фрагмент с синтетическим геном, кодирующим пептиды антигенных детерминант вируса ящура штамм Ап; генетический маркер

15 — ген Р-лактамаэы, детерминирующий устойчивость к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенные на следующих расстояниях вправо

20 от сайта ВэсЕ!!:BamH1 — 73 нуклеотида, Bglf! — 154 нуклеотида, Xhol — 174 нуклеотида. Н!пб!!! — 241 нуклеотид, Nco1 — 574 нуклеотида, Pst1 — 2418 нуклеотидов.

2. Штамм бактерий Escherlchia coll

25 ВКПМ В-5297 — продуцент гибридного белка

Р204-AspProCysCys-ЧР1 (200-213)

ProProSerPro-VP1 (131-160).

1724691

I Л1 й.Ч

СЛТССТААСССТАССССТЛААТАСТСТССТС GGTATGGGCCGTA GGAGATGATTGCCATGGCCATTTATGAGACGACCACCATACCCGGCATCTCCTÑÒÀтх v .VIII IZ

СТАС CCTCTGGCTGCTCGAGTTGCT ЬТСАССТТСССАСТТА

GATCTTGGAGACCGACGAGCTCAACGACGAGTCGAAGGCTGAATTCGА х

СЕГМЕНТ А х:r

GATCCTTGTTGTAGACACAAACAGAAAATC TGCACCTGCAAAAGAACAACATCTCTGTTTGTCTTTTAGTAACGTGGACGTTTTXII

Gl.иЬеиЬеиРгоРгоЯегРгоАаиЛрThr х111

СААСТТТТСССТССТТСТССТААСССТАС

GTTGAAAACGGAGGAAGAGGATTGC

vIX

СЕГМЕНТ В

Составитель В. Коробко

Редактор И. Дербак Техред М.Моргентал Корректор M. Шароши

Заказ 1150 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж- 35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101