Штамм культивируемых клеток растений rноdiоlа rosea - продуцент фенольных соединений - адаптогенов

Штамм культивируемых клеток растений rноdiоlа rosea - продуцент фенольных соединений - адаптогенов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: биотехнология, культивирование биомассы растительных тканей и клеток, медицинская, пищевая и косметическая отрасли промышленности. Сущность изобретения: получен штамм культивируемых клеток растений Rhodiola rosea № 29, продуцирующий фенольные соединенияадаптогены. 3 ил.,1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si> s С 12 N 5/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

4 3

Ql

Ql о (21) 4909148/13 (22) 21.12.90 (46) 07.04.92. Бюл. № 13 (75) И. В. Александрова и А. Н. Данилина (53) 57.086.83(088.8) (56) Муравьева Д. А. Фармакогиозия-M.:

Медицина, 1978, с. 543-544. (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК

РАСТЕНИЙ RHODIOLA ROSEA — ПРОДУИзобретение относится к биотехнологии, а именно к получению на основе метода изолированных культур ценного растительного сырья, содержащего биологически активные вещества, необходимые для медицинской, пищевой и косметической промышленности.

Известно, что корневище растения

Rhodiola rosea L, семейства Crassulaceae используется в качестве лекарственного сырья.

Фармакологические исследования позволяют предположить, что большую роль в адаптогенном действии Золотого корня играют фенольные соединения, фенолоспирты и их гликозиды, содержащиеся в корневище родиолы розовой, Основной фенолоспирт здесь и-оксифенилэтанол, который содержится в сырье в основном в виде гликозида. Этот гликозид называют салидрозидом.

Содержание салидрозида варьируется в природном корне от 0,5 до 1% в зависимости от условий местообитания и фазы развития растения.

Родиола розовая растет в полярно-арктической и альпийской областях, основные промышленные заросли находятся на Алтае Ы 1725756 А3

ЦЕНТ ФЕНОЛЪНЫХ СОЕДИНЕНИЙАДАПТОГЕНОВ (57) Использование: биотехнология, культивирование биомассы растительных тканей и клеток, медицинская, пищевая и косметическая отрасли промышленности. Сущность изобретения: получен штамм культивируемых клеток растений Rhodiola rosea ¹ 29, продуцирующий фенольные соединенияадаптогены. 3 ил.,1 табл, на высоте 1500-2500 м над уровнем моря, Популярность Золотого корня привела к истощению его запасов. Плантационное воспроизводство его мало рентабельно.

Цель изобретения — получение штамма культивируемых клеток растений Rhodiola

roseae L семейства Crassulaceae,oáëàäàþщего способностью продуцировать фенольные соединения-адаптогены.

В качестве исходного сырья для получения каллусной ткани служили 4-5 междоузлий стерильно растущих проростков в возрасте 45 дней. Отбирали наиболее активные, хорошо растущие каллусы.

Штамм ЗК-1 депонирован в коллекции культивируемых клеток высших растений

Института физиологии растений АН СССР.

Коллекционный номер штамма 29.

Каллусная ткань выращивается при 2224 С, влажности 65-70 (, в темноте на агаризованной питательной среде в течение

25-28 сут.

Состав питательной среды, мг/л:

НН4МОз 16400-16600

КМОз 18900-19100

Са Clr2 Н20 4300-4500 или

1725756

1,052-1,072

2,220-2,240

0,020-0,022

0,0024-0,0026

0,0024-0,0026

СаСЦ6НгО 6400-6600

Mg S04 7НгО 3600-3800 или

Mg S04 б/в . 1800-1840

ИаНгР042НгО 2520-2540

КНгР04 б/в 2020-2040

НзВОз 0,610-0,630

ZnS04Hz0 0,850-0,870 или

ZnS04 7Íã0

MnS04 4нго или

MnS04 5НгО 2,400-2,420

KI 0,082-0,084

NагMo04 2НгО 0,024-0,026 или

NazMo04 б/в

CuS04 5H20

CoClz 6H20 или

CoClz б/в 0,0013-0,0015 трилон Б 37,365-37,385

FeS0< 7НгО 27,75-27,95 а-НУК 2,0

Аденин 1,0

Кинетин 1,0

Тиамин-хлорид 0,3-0,5

Мезоинозит 75,0-85,0

Гидролизат казеина 500,0

Сахароза 30000,0

Агар 7500-8500

НгО До1л рН среды 5,8-6,2

Для выращивания применяют банки объемом 200 мл, содержащие 50-60 мл питательной среды. Кратность рассева 1:8-9.

Каллусная ткань от светло-серого и бежевого цвета (активно растущая) до коричневого и черного (старая); ростовой индекс 8-9 (по сырому весу), количество живых клеток 90-91 / при определении с помощью окрашивания 0,1/-ным раствором феносафранина.

Цитологическая характеристика.

Клетки неправильной угловатой формы, размеры 50-150 мкм, молодые клетки 25-50 мкм. В ткани встречаются отдельные сосудистые элементы, а также гидрозиды, B процессе роста клетки увеличиваются и отдельные достигают размера 370 мкм. Ядра в клетках, в основном, округлой формы, Они имеют от 1 до 8 ядрышек разного размера. Размеры ядер 10-60 мкм. Отдельные профазные ядра достйгают размера 90 мкм.

Динамика митотической активности представлена на фиг. 1.

Кариологическая характеристика.

Пределы варьирования по числу хромосом

100-600, модальный класс 116-170 (фиг. 2), Маркерные хромосомы отсутствуют.

Маркерные признаки: содержание фенольных соединений в пересчете на салидрозид 0,3, электрофоретический спектр растворимых белков — 15 полос {фиг, За), на

5 основании трех определений, электрофоретический спектр экстераз — 13 изоформ (фиг.

Зб, на основании трех определений), размах интенсивности по числу хромосом — 100-660 при модальном классе, содержащем 11610 170 хромосом (фиг. 2). Способность к морфогенезу отсутствует, Штамм культивируемых клеток Rhodiola

rosea ЗК-1 ¹ 29 является продуцентом фенольных соединений-адаптогенов. Способ15 ность штамма накапливать фенольные соединения определяет его активность. Для предлагаемого штамма в воздушно-сухой ткани на 25 сутки роста суммарное количество фенольных соединений в пересчете на

20 салидрозид составляет 0,25-0,357 на АСВ

{абсолютно сухие вещества), Фенольные соединения определяли спектрофотометрическим методом с использованием фиазореактива.

25 Для хранения штамма используют метод пересевов (продолжительность цикла выращивания 25-28 суток).

Пример. Каллусную ткань в количестве 1,5 г высевают в сосуд с 60 мл питатель30 ной среды следующего состава,мг/л;

МН4ИОз 16500

КМОз 19000

СаС г 2НгО 4400

Mg S04 7НгО 3700

35 NaHzP04 2Нг0 2530

КНгР04 б/в 2032

НзВОз 0,620

Zn S04 Í20 0,860

MnS04 4НгО 2,230

40 KI 0,083

NagMo04 2НгО 0,025

CuS04 5Íã0 0,0025

СоС!г 6НгО 0,0025 трилон Б 37,375

FeS04 7НгО 27,85 а-НУК 2,0

Аденин 1,0

Кинетин 1,0

Тиамин-хлорид 0,4

50 Мезоинозит 80,0

Гидролизат казеина 500,0

Сахароза 30000,0

Агар 8000,0

НгО До1л

55 рН среды 5,9

Выращивают 26 суток при температуре

22-24 С в темноте, Вес полученной биомассы составляет 22,8 г (380 г/л), сухой вес 0,78 г (13 г/л), Количество салидрозида составляет

0,33/ на АСВ.

1725756

Увеличение активности по сравнению с контролем, о

Коли- Показатель чество активности опытов в импульсах

М +Л

Условия опыта

Доза, мл/кг

Вводимый препарат

82,83«-16,4

259,7

0,001

С предварительной физической нагрузкой

10,0

Настойка из культуры тканей родиолы розовой

Физиологический раствор (контроль)

Настойка

Контроль

Настойка

Контроль

Настойка

Настойка

Настойка

Контроль

100

31.89 «-7,1

10,0

240,8

232

100

0,05

13

12

12

12

12

5,0

5,0

2,5

2,5

10,5

5,0

2,5

5,0

104 15+ 6 2

43,25«13,5

85,07 17,5

36,67«-18,6

101 16,4

104,2 «-18,6

100,6 «-17,5

92,0"-13,5

0,05

0,05

0,05

0,05

Без нагрузки

Для оценки адаптогенного действия препарата из культуры ткани родиолы розовой были проведены испытания на белых нелинейных мышах-самцах массой

18-22 г.

Настойку из культуры ткани родиолы розовой получали путем экстрагирования сухой биомассы культуры 40%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:10.

Перед введением препарата животным настойку упаривали на роторном испарителе при комнатной температуре до сухого остатка, а затем, добавляя к сухому остатку дистиллированную воду, доводили ее объем до исходного уровня. Сухой осадок экстракта полностью растворялся в воде, образовывая жидкость светло-желтого цвета.

Препарат из культуры ткани родиолы розовой вводили животным внутрибрюшинно. При этом диапазон исследуемых доз составил 0,05-0,2 мг на 20 г веса (2,5-10,0 мл/кг).

Действие адаптогенных препаратов способно проявляться лишь на фоне утомления (угнетения). Поэтому перед исследованием влияния препарата на активность животные помещались на третбан и получали предварительную физическую нагрузку в виде бега по "непрерывно бегущей дорожке" в течение 15 мин при скорости 23 м/мин, что составило 3/4 от максимально переносимой нагрузки (продолжительности бега животных). После снятия животного с третбана оно помещалось сразу в камеру "Аниме кса" (фирма Л КБ, Ш веция) специального счетного устройства, где активность оценивалась числом импульсов, являющихся ин5

30 тегральным выражением двигательной активности животного в камере за 5 мин.

Исследуемый препарат вводили подопытным животным за 40 мин до помещения на третбан. Контрольным животным за

40 мин до помещения на третбан внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в объемах, аналогичных испытуемому препарату.

Аналогичные измерения были проведены с животными, не получившими предварительной нагрузки на третбане.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице.

Как видно из данных таблицы, настойка из культуры ткани родиолы розовой в дозах 2,5-10 мл/кг веса животного существенно увеличивает активность животных при предварительной физической нагрузке (132-160% по сравнению с контролем) и не оказывает стимулирующего действия на экспериментальных моделях без предварительного физического утомления (полученное различие статистически. незначимо).

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о выраженном адаптогенном действии настойки из биомассы радиолы розовой, Заявляемый штамм является первым для культивируемых клеток Rhodiola rosea семейства Crassulaceae перспективен для выращивания в промышленных условиях.

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток растений Rhodiola rosea ВСКК-ВР ¹ 29-продуцент фенольных соединений-адаптогенов.

1725756

g4

Р2

12

29 с>

Л8

Числа хромосом

la3t а þ

А!ОС В О

Исо Ф сйсо WCOCh

O ОН С!!СЧ тВСО нсцс!! сис!! Смс!!См ! I ! I

СЧС Эс3 I&CO WCCIW

СООЪО OI СОЧ !О !

- - С!! СМ СМ Ol &l C!I соо ю с! !Оwсо нннн

I I

СОРОн

CQ cOW нннн

tDcD Сс! н Dl (Ч

Онн н н ! I

I lAtO C

0>Он ог

О>нн н н

РЭ: 1

Д! CO.

2Ф

Z,2 zoo

+ 1В ф1б

1ф 12

3 10

Ф

3 08

Pb

f0 12 14 1б 1Þ Ю 22 М 26 Щ Ю В РиЯ)

IC (Щ

1725756

Составитель И, Александрова

Редактор Н. Лазаренко Техред М.Моргентал Корректор О. Кравцова

Заказ 1188 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101