Способ получения водорастворимой части человеческого рецептора малого сродства f @

Способ получения водорастворимой части человеческого рецептора малого сродства f @

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способам получения полипептидов, пригодных для борьбы с местными и системными аллергическими реакциями. Сущность изобретения заключается в разработке способа получения водорастворимой части человеческого рецептора FcЈ малого сродства (FcЈ R). Способ включает выделение водорастворимой части связывающего IgE фактора (Fct R) из лимфобластоидных клеток, анализ ее последовательностей при помощи гидролиза, выделение получаемых при этом фрагментов и определение их последовательностей , приготовление двух проб гибридизации, выделение и идентификацию генов, кодирующих человеческий рецептор Рс малого сродства, экспрессию дДНК FcЈR, экспрессию мРНК FcЈ R, получение экспрессионного вектора, содержащего последовательности ДНК, кодирующие водорастворимый фрагмент рецептора FcЈ , экспрессию этого растворимого фрагмента в микроорганизмах или клетках млекопитающих . ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБ 1ИК (я)з С 12 N. 15/12

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР!

y0 u ., g

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4203195/13 (22) 20.08.87 (31) 86111581.4 (32) 21.08.86 (33) EP (46) 15.04.92. Бюл. N. 14 (71) Тадамитсу Кишимото (J P) (72) Тадамитсу Кишимото, Масаки Суемура, Хитоши Кикутани и Эдвард Барсумиан (JP) (53) 675.224.2:577,2 (088.8) (56) Biofutur, 1987, М 54, 9, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОЙ ЧАСТИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА Fc МАЛОГО СРОДСТВА (57) Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способам получения полипептидов, пригодных для борьбы.с местными и системными аллергическими реакциями. Сущность изобреИзобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к способам получения полипептидов. пригодных для борьбы с местными и системными аллергическими реакциями.

Способ включает следующие операции.

1. Выделение водорастворимой части связывающего IgE фактооа (Рс R) из лимфобластоидных клеток.

2. Анализ последовательностей водорастворимой части человеческого рецепто-. ра Fc< малого сродства при помощи гидролиза, выделение получаемых при этом фрагментов и определение их последовательностей. а9> 5Uно 1 727533 АЗ тения заключается в разработке способа получения водорастворимой части человеческого рецептора Fc малого сродства (1=с R). Способ включает выделение водорастворимой части связывающего IgE фактора (Рсе R) из лимфобластоидных клеток, анализ ее последовательностей при помощи гидролиза, выделение получаемых при этом фрагментов и определение их последовательностей, приготовление двух проб гибридизации, выделение и идентификацию генов, кодирующих человеческий рецептор Fc малого сродства, экспрессию дДНК Гс R, экспрессию мРНК Рс R, получение экспрессионного вектора, содержащего последовательности ДНК, кодирующие водорастворимый фрагмент рецептора Рс, экспрессию этого растворимого фрагмента в микроорганизмах или клетках млекопитающих.

3. Приготовление двух проб гибридизации, Проба 1: получение трансформирующей ячейки Ес L дополнительной ДНК (далее дДНК) с использованием многостадийной циклической экстракции РНК, кодирующей полипептид (далее мРНК).

Проба 2: получение олигонуклеотидов формулы

Т

3 — TTc ACCTAGTTg AAG GT-5

А кодирующих аминокислотную последовател ь ность формул ы

Lys Trp — Ife Asn — Phe — G1ï, 1727533 экспрессионных носителей, содержащих следующим образом.

1. Выделение и очистка водораствориМоА части Fc< R, 30

Человеческие лимфобластоидные клетки В, например, клетки RPM1 — 8866, выделяют на поверхности Ес. R с молекулярной массой приблизительно 46 кд и отдают фрагмент с молекулярной массой приблизи- 35 тельно 25 кд в надосадочную жидкость культуры. В результате проведения опыта с использованием связанного с энзимом иммуносорбента, выделяют два моноклональ40

4. Выделение генов, кодирующих человеческий рецептор Fcz малого сродства, из матрицы PHK лимфобластоидных клеток, продуцирующих мРНК рецептора Fcz, синтез дДНК с последующей идентификацией ген, кодирующий рецептор Ес, с использованием двух маркированных проб, содержащих специфичную к клеткам Fc R L дДНК и олигонуклеотид, общий с геном рецептора

Fc малого сродства, и репликацией полученного таким образом гена рецептора

Fc<, 5. Экспрессия дДНК Fc< R.

6. Определение гена, кодирующего человеческий рецептор Fcg с использованием дДНК, полученной из носителей согласно п. 5.

7, Экспрессия мРНК Fc R.

8. Получение вектора содержащего последовательности ДНК, кодирующие водорастворимый фрагмент рецептора Fc u его О-гликозилированных производных, а также экспрессия этого растворимого фрагмента в микроорганизмах или клетках млекопитающихщих.

Описанные выше операции проводят ных антитела (далее именуется "метод эним"). Активность Ес R, выделяемая лимфобластоидными клетками RPM1 8866, выше в концентрированной надосадочной жидкости культуры, чем в солюбилизированных поверхностно-активным вещест.вом ПН вЂ” 40 мембранных рецепторах, хотя для получения Fc< R используют одинаковое количество, например, 10 клеток/мл.

Кроме того, после хроматографии очищенных надосадочных жидкостей на полиакрилатном геле с использованием додецилсульфата натрия и элюации из геля активности Fc< R обнаружена активность в областях 45 — 46 кд и 24 — 25 кд. При этом концентрированные надосадочные жидкости имеют более высокое содержание активности в области 25 кд, Поэтому в качестве источника рецептора используют бессывороточные надосадочные культуральные жидкости.

Очистку Fc R с молекулярной массой примерно 25 кд осуществляют в колонках, содержащих 10 мг/мл очищенного моноклонального антитела, связанного с сефарозными шариками, В результате последовательной адсорбции культуральной жидкости на связанной с альбумином сыворотки крупного рогатого скота сефарозе и на связанной с мышиным иммуноглобулином сефарозе получают 70 / первоначальной активности (без улучшения удельной активности). После предварительной адсорбции рецепторному материалу дают связываться с сефарозой в течение 4 — 16 ч, при этом общая активность продукта элюации уксусной кислотой уменьшается, но удельная активность повышается до 83 ед/мкг и чистота увеличивается в 190 раз, В результате дальнейшей очистки рецептора хроматографией на колонне С вЂ” 4 с обращенной фазой и использованием линейного градиента 0 — 65 ацетонитрила и 0,1 трифторуксусной кислоты удельная активность повышается до

1630 ед/мкг и чистота рецептора увеличивается в 3710 раз. Однако степень извлечения составляет только 33 / первоначального материала. Очистке подвергают и солюбилизированную поверхностно-активным веществом мембрану Fc< R, но получаемая при этом удельная активность значительно меньше, чем при использовании культуральной надосадочной жидкости. Степень извлечения зависит от применяемого для элюации буфера, т,е. при осуществлении элюации

2,5 -ной уксусной кислотой с последующей быстрой нейтрализацией выход рецептора можно значительно повышать.

Очистка Ес ° R с использованием моноклональных антител в твердой фазе является недостаточной для получения чистого рецептора. Поэтому после элюации Fc< R подвергают дальнейшей очистке при помощи жидкостной хроматографии с обращенной фазой. При этом свежеэлюированный материал подают на колонку С вЂ” 4 и подвергают хроматографии с использованием линейного градиента 0 — 65 ацетонитрила.

Fc< R элюируется ацетонитрилом при концентрации 44 — 45 .

Активность Fc< R, получаемая в результате жидкостной хроматографии на колонке

С вЂ” 4, показывает одну полосу, соответствующую материалу с молекулярной .массой 25 кд, который проявляеточень высокуюактивность при проведении анализа методом эним. Следует отметить, что полоса 25 кд соответствует меньшему виду Ес R, который обнаруживается теми же моноклональ1727533 орастворимои части Рс В.

1П

Me t- Gl u-Leu-Gl n-Ча 1-S e r -Se r -Gl y- Ph e-Va 1- (N-КОни в во 4,)

Gly-Glu-Phe-I1å-Trp-Ча1-Asp-Gly-Ser-His-Val-Asp Tyr-Ser-AsnTrp-Ala-Pro-Gly-Gl u-Pro-ThrLys-Hi s-Ala-Ser -Hi s-Thr -Gl y- Ser-Tr p- I le-Gly-Leu-Ar g-Asn-Le u "Р- " y - — 20

I I /у -.ф/д - ф/

30

40

50

55 ными антителами после поверхностной иодинации и иммуноосаждения Fc„. R c использованием тех же антител. Предполагается, что части с 46 и 25 кд являются антигенно идентичными, причем последняя представляет собой водорастворимую часть

Fc,. R.

2. Анализ частичных последовательностей вод

3. Получение проб гибридизации.

Проба 1 (дДНК, специфичная относительно L-клеток, положительных в отношении Fc R).

Клетки L, имеющие недостаток тимидин-киназы (далее ТК), например, клетки

LtK, подвергают трансфекции высокомолекулярной ДНК из клеток RPM1 — 8866 и ТК. геном из вируса Герпес-симплекс. После селекции НАТ ТК положительные трансформанты обрабатывают биотинированным анти — Fc< R антителом (8-30) и FITC-авидином и классифицируют. В результате получают две трансформированные клетками L линии, L V-8-30 и L-Vl 8-30.

PH К получают из клеток L — Ч-8-30 с использованием гуанидина изотиоцианата и хлорида цезия. ДНК, дополнительную к мРНК из клеток L — V — 8 — 30, синтезируют обратной транскриптазой на олиго/dT/ïðàéмере. дДНК путем введения маркированной альфа- P-деокси-СТР гибридизируют с 10г кратным избытком пол и/А/ — P HK. полученной из клеток LtK . Реакционную смесь нанбсят на колонку с оксиапатитом. Не связанную однонитевую дДНК подвергают повторной гибридизации с поли/А/ -PHK, полученной из клеток LtK, Первую нить дДНК, специфичную в отношении трансформантов клеток L, положительных относительно Fcz R, используют в качестве пробы для обнаружения гена для Fc< R в ламбда-gt-10-библиотеке.

Проба 2: синтез смеси олигонуклеотидов формулы

On ределя ют последовательность аминокислотных остатков в Рс В с использованием трипсина и лизилендопептидазы, При обработке трипсином получают 11 фрагментов, а при обработке лизилендопептидазой — 12 фрагментов. Получались следующие фрагменты:

° т А А

3-ТТс ACCTAGTTG AAG GT — 5

А

Этот огигонуклеотид используют в качестве пробы для обнаружения гена для Fc -реE цептора.

4. Выделение и идентификация сред, содержащих ген, кодирующий человеческий

FcFR малого сродства. мРНК выделяют из клеток RPM1 — 8866 путем центрифугирования в градиенте хлористого цезия, экстракции фенолом и осаждения этанолом. Поли/А/ -PHK выделяют хроматографией на олиго/dT/öåëëþëîçå.

Поли/А/ -PHK используют в качестве

+ матрицы для получения дДНК с помощью обратной транскриптазы и олиго/dT/ïðàéмера. После обработки RN азой Н вторую нитку ДНК синтезируют при помощи ДНК полимеразы 1. ДНК модифицируют при помощи Т4 — ДНК-полимеразы с тем, чтобы удалить остаток 3 -выступов из первой нити

ДНК и лигируют в EcoR1-линкере. дДНК длиной более 1000 п.о. фракционируют и избыток линкеров удаляют хроматографией на колонке. дДНК клонируют в ДНК лямбдаgt10 фага по сайту EcoR1 и трансформируют в штамм 0600 hfe Escherichia coil.

Гибридизацией колоний идентифицируют те, которые специфичны в отношении

Fc R, При этом используют указанные выше пробы.

Отбирают 23 из примерно 30000G клонов, которые гиоридизируются с обеими пробами.

1727533

5 10 15

Net Glu Glu Gly G1n Tyr Ser Glu 11е Glu Glu Leu Pro Arg Arg

ATG GAG GAA GGT CAA TAT TCA GAG АТС GAG GAG СТТ ССС AQG AGG

ТАС CTC CTT ССА QTT ATA AQT СТС TAG СТС CTC GAA GGG TCC TCC

20 25 30

Arg Cys Сув Arg Arg Gly Thr Gln Ile Val Leu Leu Gly Leu Val

CGG TGT TGC AGG CGT GGG ACT CAG ATC GTG CTG CTG GGG CTG GTG

ОСС ACA ACG ТСС GCA ССС TGA GTC TAG САС GAC QAC ССС GAC C4C

35 40 45

Thr Ala Ala Leu Trp Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Trp

АСС GCC GCT CTG TGG GCT GGG CTG CTG ACT CTG CTT CTC CTG TGG

TGG CGQ CGA GAC АСС CGA ССС SAC GAC TGA GAC GAA GAG GAC ACC

50 55 60

His Trp Asp Thr Thr Gln Ser Leu Lys Gln Leu Glu Glu Arg Ala

CAC TGG GAC ACC ACA CAG AGT CTA AAA CAG CTG GAA GAG AGG GCT

GTG АСС CTG TGG TGT GTC ТСА GAT TTT GTC GAC CTT CTC TCC CGA

65 70 75

Ala Arg Asn Val Ser Gln Val Ser Lys Asn Leu Glu Ser Hi s His

GCC CGG AAC GTC TCT CAA GTT ТСС AAG AAC TTG GAA АОС CAC CAC

CGG GCC TTG CAG AGA GTT CAA AGG ТТС TTG AAC CTT TCG GTG QTG

-з г

80 85 90

Gly Asp Gln Met Ala G1n Lys Ser Gln Ser Thr Gln Ile Ser Gln

GGT GAC CAG ATG GCG CAG AAA ТСС CAG ТСС ACQ CAG ATT ТСА CAG

CCA CTG GTC TAC CGC GTC TTT AGG GTC AGG TGC GTC TAA AGT GTC

95 100 105

Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Glu Gln Qln Arg Leu Lys Ser Gln

GAA CTG GAG GAA CTT CGA GCT GAA CAG CAG AGA TTG AAA TCT CAG

CTT GAC CTC CTT GAA GCT CGA CTT GTC GTC TCT AAC TTT AGA GTC

110 115 120 Авр Ьеи Glu Leu Ser Trp Asn Leu Asn Gly Leu Gln Ala Asp Leu

ОАС TTG GAG CTG TCC TGG ААС CTG AAC GGG CTT CAA QCA QAT

СТО AAC СТС GAC AGG АСС TTG GAC ТТО ССС QAA GTT CGT CTA QAC

5, Экспрессия дДНК для Fc R.

Вставку EcoR1, содержащую дДНК для

Fc» R и выделенную из описанного лямбда

gt10 клона, лигируют с переваренным

EcoR1 плазмидным вектором рСЕМ вЂ” 4, тм обозначенным LE392. Этот вектор содержит два промотора SP6 и Т7 в противоположной друг другу ориентации, дДНК для Fc,R можно сразу же транскрибировать в мРНК. дДНК переваривают BamH1 и полученную

ДНК применяют в качестве матрицы для синтеза мРНК при помощи SP6 PHK-полимеразы. Полученную PHK впрыскивают в ооциты Xenopus, После двухдневной инкубации ооциты лизируют и определяют наличие Fc< R методом эним с использованием двух анти-Рс Я антител 3 — 5 и 8 — 30, которые распознают различные эпитопы на Fc

5 направлениях. Сегмент ДНК между обоими

S40 ранними промоторами удаляют гидролизом эндонуклеазой EcoR1 и заменяют на вставку дДНК pFc< R — 1/pDE2 — Fc< R — 1/.

Клетки оз7 трансфецируют pDE2 — дДНК Fc<

10 R. Анализ показывает, что 307ь трансфецированных клеток подтверждает, что дДНК кодирует молекулу Fc: R, 6. Определение нуклеотидной последовательности дДНК для Ес В.

15 Полная нуклеотидная последовательность и связанная с ней последовательность аминокислотных остатков представлены ниже. При этом кодирующая последовательность имеет следующую фор20 мулу:

1727533

125 130 135

Ser Ser Phe Lys Ser Gln Glu Leu Asn Qlu Arg Asn Qlu Ala Ser

AGC AGC TTC AAG TCC CAG GAA TTG AAC GAG AGG AAC GAA GCT TCA

TCG TCG AAG AGG GTC AAC TTG TTG CTT CGA AGT

140 145 150

Asp Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu G1u Чаl Thr Lys Leu Arg Met

GAT TTG CTG GAA AGA CTC CGG GAG GAG GTG ACA AAG CTA AGG ATG

CTA AAC GAC CTT TCT GAG GCC CTC CTC САС ТОТ ТТС GAT ТСС TAC

155 160 165

Glu Leu Gln Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu

GAG TTG CAG GTG TCC AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACQ TGC CCT GAA

СТС AAC GTC САС AGG TCG ССО AAA CAC ACG TTG TGC ACG GGA CTT

170 . 175 180

Lys Trp I1e Asn Phe Gln Arg Lys Cys Tyr Tyr Phe Оlу Lys Gly

AAG TQG ATC AAT ТТС CAA CGG AAG TGC ТАС TAC TTC GGC AAG GGC

TTC АСС TAG ТТА AAG GTT GCC ТТС ACG ATG ATG AAG CCG TTC CCG

185 190 195

Thr Lys Q1n Trp Чаl His Ala Arg Tyr Аlа Cys Asp Asp Met Glu

АСС AAG CAG TGG GTC CAC ОСС CQG ТАТ QCC TGT GAC GAC ATG GAA

TGG ТТС GTC ACC CAG GTG CGG QCC ATA CGG АСА CTG CTG TAC СТТ

200 205 210

Gly Gln Leu Val Ser Ile His Ser Pro Qlu Glu Gln Asp Phe Leu

QGG CAG CTG GTC AQC ATC САС AGC CCQ GAG GAG CAG GAC TTC CTG

ССС QTC GAC CAG TCQ TAG GTG TCG GGC СТС CTC GTC CTG AAG GAC

215 220 225

Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly Leu Arg Asn

ACC AAG CAT GCC AGC САС АСС GGC ТСС TGG ATT GGC CTT CGG AAC

TGG ТТС QTA CGG TCG GTG TGQ CCG AQQ ACC TAA CCG GAA GCC ТТО

230 235 240

Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Val Азр Gly Ser His Val

TTQ GAC CTG AAG GGA GAG ТТТ ATC TGG GTG GAT GGG AGC CAT GTG

AAC CTG GAC ТТС CCT СТС AAA TAG .ACC САС CTA ССС TCG GTA САС

245 250 255

Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gln

GAC TAC AGC AAC TGQ QCT ССА GGG GAQ ССС АСС AGC CQG AGC CAG

CTG ATG TCQ TTG ACC CGA GGT ССС CTC GQG TGG TCG GCC TCG GTC

260 265 270

Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg G1y Ser Gly Arg Trp Asn Asp

GGC GAG QAC TGC GTG ATG ATG CGG GGC TCC GGT СОС TGG AAC GAC

CCG СТС CTG ACG САС ТАС ТАС GCC CCG AGG ССА GCG АСС TTG CTQ

275 280 285

Ala Phe Cys Asp,Arg .Lys Ьец Gly Аlа Тхр Чаl Суз Азр Arg Leu

GCC ТТС TGC GAC CGT AAQ CTG GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG CTG

CGG AAG ACG CTG GCA TTC GAC CCG CGG АСС CAC ACG CTG GCC GAC

290 295 300

Ala Thr Cys Thr Pro Pro Аlа Ser Glu Qly Ser Ala Glu Ser Met

ОСС ACA TGC ACG CCG ССА GCC AGC GAA GGT ТСС GCQ GAG TCC АТО

CGG TQT ACG TGC GQC GGT СОО TCG СТТ ССА AGG CGC СТС A60 TAC

1727533

305 З1О 315

Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro

GGA ССТ GAT TCA AGA CCA 6АС CCT GAC GGC CQC CTG ССС АСС ССС

CCT GGA CTA AGT TCT GGT CTG GQA CTG CCG GCG GAC GGQ TGG GGG

Ser Аlа Pro Leu His Бег

TCT GCC ССТ СТС CAC ТСТ

AGA CGG GGA GAG GTG AGA

TGA

ACT

15

25

Met

ATG

TAC

G1u Leu Gln Чаl Ser $ег Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu

GAG TTG CAG GTG ТСС AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA

CTC ААС GTC CAC AGG TCQ CCG AAA CAC ACG-TTG TGC ACG GGA CTT

Lys Trp Ile Asn Phe Gln Arg Lys Сув Tyr Tyr Phe Qly Lys Gly

AAG TQG ATC AAT ТТС CAA CGG AAG TGC TAC TAC TTC GGC AAG GGC

TTC ACC TAG TTA AAG GTT GCC TTC ACG ATG ATG AAG CCG ТТС CCQ

Thr Lys Gln Trp Чаl His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu

АСС AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TAT GCC TGT GAC GAC ATG GAA

TGG ТТС GTC ACC CAG GTG CGQ GCC ATA CGG АСА CTG CTG TAC CTT

Gly Gln Leu Чаl Ser Ile His Ser Pro Glu Glu Gln Asp Phe Leu

GQQ CAG CTG GTC AGC ATC САС AGC CCG GAG GAG CAG GAC ТТС CTG

ССС GTC GAC CAG TCG TAG GTQ TCG GGC СТС CTC GTC CTG AAG GAC

Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly Leu Arg Asn

АСС AAG САТ GCC AGC CAC АСС GGC ТСС TGG ATT GQC CTT CQG AAC

TGG TTC GTA CGG TCG GTG TGG CCG AGQ ACC TAA CCG GAA GCC TTG

Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Пе Trp Val Asp Gly Ser His Val

TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT ATC TQG GTG GAT GGG AGC CAT GTG

AAC CTG GAC TTC CCT СТС AAA TAG ACC CAC CTA ССС TCG GTA САС

Большое количество растворимого Рс и с молекулярной массой 25 кд обнаруживается в культуральной надосадочной жидкости клеток RPM1 — 8866. N-концевой аминокислотный остаток (Met) растворимого Fc

259, 273, 282 и 288), которые, вероятно, образуют дисульфидные связи и представляют собой структуру, устойчивую к воздействию п ротеолитических энзимов.

Поэтому С-концевая область (150 — 321) соответствует растворимому Fc< R, который представляет собой продукт протеолитического расщепления связанного с мембраной Fc R.

7. Экспрессия мРНК для Fc„.R.

Поли/А/ -PHK получают из клеток различного типа и анализируют на экспрессию мРНК для Fc R. Основную полосу длиной

1700 оснований обнаруживают в B лимфобластоидных клеточных линиях (RPM1 — 8866 и RPM1-1788), pre B клеточной линии

FL Ф 8 — 2 и в двух трансформантах Fc< R L клетки. но не в клетках РСЕR . включающих две линии лимфомы, Т клеточной линии (СЕМ) и в трансформантах клетки, которых экспримируют другой В клеточный антиген (CD20). Кроме того, мРНК для Fc< R не обнаруживается в обычных Т клетках, тогда как обычные В клетки экспрессируют такое же количество мРНК для Fc< R, что и В лимфобластоидные линии.

8. Получение вектора, содержащего последовательность ДНК, кодирующую водорастворимый фрагмент рецептора Fc< R.

Водорастворимая часть рецептора Fc

14

1727533

Asp Туг $ег Авп Тгр А1а Рго

GAC TAC AGC AAC TGQ GCT ССА

СТО ATG TCG TTQ ACC CGA GGT

Gly

GGG

ССС

Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gln

GAQ ССС ACC AGC CGG AGC CAG

CTC GGG TGQ TCQ GCC TCG GTC

Qly Glu Asp Cys Ual Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp

GGC GAG GAC TGC GTG ATG ATG CGQ GGC ТСС GGT CGC TGG ААС GAC

ССО СТС CTG ACG CAC ТАС ТАС GCC CCG AGG ССА GCG АСС TTG CTQ

Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu

GCC TTC TGC GAC CGT AAG CTG GG AAG АСО CTG GCA ТТС GAC

Ala Thr Cys Thr Pro Pro А1а

QCC АСА TGC ACG CCG CCA GCC

CGG TGT ACG TGC GGC GGT CGG

Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro

GGA CCT QAT TCA AGA ССА GAC CCT GAC GGC CGC CTG ССС АСС ССС

ССТ GGA CTA AGT TCT GGT CTG GGA CTG CCG GCG GAC QGG TGG GGG

Ser Ala Pro Leu His Ser

ТСТ GCC CCT СТС САС TCT TGA

AGA CGG GGA GAQ GTG AGA ACT

30

40

50

Включающая мембрану область Fc

Такая сигнальная последовательность может применяться дополнительно и в положении перед дДН К, кодирующей водорастворимую часть.

Получают новый рекомбинантный водорастворимый фрагмент, имеющий по крайней мере одно место О-гликозилирования, а также новые плазмиды, содержащие эти последовательности ДНК, и рзРс R-1.

Получают последовательность дДНК, в которой дДНК по крайней мере для части аминокислот 1 — 148 франмента Fc R отсутствует, так что имеются только последовательность, кодирующая часть протеина мембраны, и часть, кодирующая водорастворимый фрагмент дДНК всего рецептора.

Часть последовательности дДНК, кодирующей аминокислоты 1 — 148, заменена на подходящий фрагмент дДНК, кодирующий эукариотную сигнальную последовательностьь.

EcoR1 BamH1 вставку дДНК BSF-2 длиной 1,2 т.п.о. получают путем переваривания pBSF — 2.38 с помощью llindlll и BamH1.

Полученный фрагмент, содержащий всю дДНК BSF — 2, подвергают перевариванию с помощью Hinf1 и 3 -концы обрабатывают

Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu

GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG CTQ

CCG CQG ACC САС ACG CTG GCC GAC

Ser Glu О1у Ser Ala Glu Ser Met

AGC GAA GGT TCC GCQ QAG ТСС ATG

TCG CTT CCA AGG CGC CTC AGG TAC фрагментом Кленова ДНК полимеразы. После переваривания с помощью Kpnl полученный фрагмент Kpnl-Hinf1 длиной 110 п,о„содержащий доминантную последовательность BSF-2, клонируют в pGEM4 после переваривания с помощью,Kpnl u SmaL

Один из отобранных клонов размножают и обозначают как pBSF2-L8. pBSF2 — L8 подвергают перевариванию с помощью BamH1 и 3 -концы обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы, Переваренную

Hindlll и Pstl, дДНК Fc

С целью сравнения биологической активности протеинов, полученных клонами pFc< R — 1, psFc< R-1, р Л NFc R-1 и рЛ NFc

R-1 с помощью BamH1, а р Л NFc< R — 1 и р Л NFc R 2 — с помощью EcoR1. ПолученЕ ные фрагменты применялись в качестве матрицы для синтеза мРНК с использованием SP6 РНКполимеразы. Полученные мРНК впрыскивают в ооциты xenopus ieavis, После двухдневного инкубирования активность Fcq R в кутуральных надосадочных жидкостях и лизатах ооцитов определяют методом эним с использованием анти-Fc< R антител 3 — 5 и 8-30, которые распознают два различных эпитопа на FcsR. В лизатах PB u культуральной надосадочной жидкости

1 П/554

EBI-49б:

5 6ААСТОСАООТОАОСТСТ66ТТТСОТТТОСААСАСТТОСССООАААААТО

Е BI-497

3 CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTÒÀÑÑTÀG 5

Sau3A с тем, чтобы восстановить соответствующие кодоны формул

G l uL euG 1 n Va lSe rS e r GlyPhe 9h 1CysAsnThr Cys ProG1 uLys Try

5 ОААСТОСАООТОАОСТСТООТТТСОТТТОСААСАСТТОСССООАААААТО 3

3 CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTTACCTAG 5

Sau3A ооцитов, в которые впрыскивают транскрипты рГс Я вЂ” 1, р ЬИРс Я вЂ” 1 и р ЛNFc

Водорастворимый фрагмент Fc< R из ооцитов проявляет способность к связыванию иммуноглобулина Е при помощи модифицированного метода эним, заключающегося в использовании анти-Fc< R-антител 3 — 5, иммуноглобулина Е и человеческого AP-антииммуноглобулина.

При этом надосадочная жидкость ооцитов, в которые впрыскивали мРНК pSFc R — 1, инкубируют на покрытых антителом 3 — 5 пластинах, которые затем последовательно инкубируют с человеческим иммуноглобулином Е и AP-антииммуноглобулином Е. Выделившийся из ооцитов фрагмент Fc R образует комплекс с иммуноглобулином Е.

В качестве контроля проводят связывание с нетрансформированной надосадочной жидкостью из ооцитов, буфером и надосадочной жидкостью из клеток RPM1 — 8866.

Надосадочную жидкость ооцитов подвергают дальнейшему опыту по определению способности к торможению образования розеток между фиксированным ох РВС, покрытым человеческим иммуноглобулином Е, и клетками SKW6 — CL4, несущими Ес R на своей поверхности.

Последовательность Fc< R экспрессировать под контролем промотора бактериофага Lambda/ÐL/.

Чувствительный к температуре аллель этого репрессорного гена может включать вектор, который содержит полную последовательность Рс R. Если температуру повышают до 42 С, то репрессор инактивируется и промотор экспримируется на своем максимальном уровне.

Могут применяться системы промотор—

1О оператор или их части, например арабинозный оператор, колицин-Е>-оператор, галактозный оператор, щелочной фосфатазный оператор, трп-оператор, кисксилозный Аоператор, tac-оператор и другие.

Плазмиду pRH 100 переваривают с помощью Sstl. Затем 3 -выступы удаляют и линеаризованную плазмиду подвергают дефосфорилированию. После экстракции фенолом и хлороформом, электрофореза, электроэлюации и осаждения линеаризованный вектор лигируют со вставкой, получаемой следующим образом.

Плазмиду pGEM4-Fc

392 с Hindlll и повторного введения в

25 pGEM4длинного фрагмента EcoR1 и Hindi ll, переваривают с EcoR1 и Hindlll. Затем выступающие 5 -концы затупляют с помощью фрагмента Кленова ДН К-пол имеразы 1, после чего 5 -фосфатные группы удаляют, После

ЗО очистки полученный фрагмент гидролизуют

Sau ЗА и больший фрагмент выделяют, Так как в результате этой операции удаляют не только 5 -область, но и нуклеотиды для первых

N-концевых аминокислот водорастворимой части, синтезируют два олигодеоксинуклео35 тида формул зом

Название

Последовательность

NF 1 тсалаССТСЛТАТСЛАтаАОАТТСССАТСТАТТТТСАСТОСТатТТТатт (50-

GGC (53-меГ ) NF Э CGCTG TTCCTCCÎCÒTTÎÎCTÑCTCCËGÒÑAACACTÀCTÀÑTÎÀËÉÀCG

3NACTGCTC TTC GCT (70-МЕр) 17 (без кодона ATG, так как он содержится в промоторно-операторно-линкерной системе плазмиды pER103).

Вставки лигируют с линеаризованным вектором ДНК и трансформируют в Е.coli

НВ101, отбирают устойчивые к ампициллину колонии. Плазмиды исследуют путем рестрикционного анализа. Плазмиду отбирают и обозначают как рРН 246.

Дополнительно к прокариотам могут применяться дрожжевые культуры.

Гены водорастворимой части человеческого рецептора Fc

321 можно экспрессировать в дрожжах, если применять ADH1-промотор вместе с ADH1терминатором. Дрожжевой экспрессионный вектор можно получать за счет получения: а) плазмиды, содержащей дрожжевой

AD H1-терминатор; б) плазмиды, содержащей дрожжевой

ADH1-промотор и дрожжевой ADH1-терминатор; в) плазмиды, содержащей дрожжевой

ADH1-промотор, ген, кодирующий дрожжевую доминантную последовательность

MF а, мультиклонирующее место и дрожжевой ADH1-терминатор; г) плазмиды, содержащей ADH1-промотор, последовательность, кодирующего водорастворимую часть человеческого рецептора

Fc,. R малого сродства, и ADH1-терминатор; д) трансформации полученной плазмидной ДНК в дрожжевом векторе.

При этом получают плазмиду, содержащую экспрессионную кассету без доминантной последовательности MF a, и плазмиду, содержащую экспрессионную кассету с доминантной последовательностью MF а .

Операции проводятся следующим обраа) АОН1-терминатор выделяют из плазмиды pl014. ADH1-терминатор субклонируют в плазмиде pUC18 по сайтам Hindlll u

1727533 18

SphI и получают плазмиду pWS 214$4. По1 сле гидролиза pws 214S4 рестриктазами

Sphl и ЯаП меньший фрагмент выделяют злектрофорезом в агарозном геле.

5 Фрагмент, содержащий ADH1-терминатор, подвергают лигированию с векторной

ДН К, полученной перевариванием

BluescrIbe M13 рестриктазами Sall u Sphl c последующей очисткой электрофорезом в

10 агарозном геле.

Лигированную ДНК трансформируют в

Е.coli IM101 и отбирают колонии, устойчивые к ампициллину. Плазмиду этих колоний обозначают как pRH241. Эта плазмида содержит имеющий примерно 340 п.о. фрагмент с ADH1-терминатором. б) ADH1-промотор выделяют из плазмиды pY-IDB-HulFN-омега-1, т.е. плазмиды для получения человеческого интерферона

2О омега 1. Плазмиду переваривают рестриктазой Sphl, затем удаляют 3 -выступ с использованием ДНК полимеразы 1 в присутствии

dGTP и повторно гидролизуют рестриктазой Xho1, Электрофорезом в агарозном геле выделяют фрагмент размером 400 п.о. и подвергают его легированию с адапторной парой формулы

ЕВ1-410: 5 AATTGGAAGGATC 3

Е В1 — 429: 3 CCTTCCTAG-р 5

B липкий конец лигируют с адапторной парой формулы

E B1 — 418: 5 р TCGAGCACGTGGTAC 3

ЕВ1 — 424: 3 CGTGCAC 5

Реакции лигирования проводят одновременно. После очистки электрофорезом в агарозном геле ДНК лигируют с ДНК плазмиды

pRH241 по сайтам EcoR1 и Крп1 и трансформируют ее в Е.coli. Колонии исследуют на наличие плазмиды с правильной конструкцией, которую обозначают как pRH242.

4g B) Химический синтез пептида MFa осуществляют с использованием предварительно синтезированных олигонуклеотидов:

19 1727533 20

CAGCTTCA6CTGGAAТТТОА6САОТТТС6ТСТТСЛОТЛОТА6Т6ТТОЛСТ

ООАОСАОССЭЛХОСО АООА (lo-мер ) МР 4

ОААОСТОТСА1 СООТТАСТСТОАСЧ ТООААООТОАС ITCGACGYTG CT (4я -мец

MF 6 GСЛЛАЛСАОСААСОТСОАЛОТСЛССТТССРАОТСАОЛОТЛЛССОЛТОА (4p -ме.,) MF 7 GTTTTCÑÑAÒÒÑTÑÑËËÑÒÑCËÑTËAÑËËÑGGÒÒTGTTGÒÒCAÒÒAËÑ

АСТАСТАТТОСАТСОРТТОСТ (69-мер ) МГ 8 ССТТАОСАОСААТСОАТОСААТАОТАОТОТТААТ6ААСААСАААСС6ТТ6

TTAGTGGAGTTGGAGAATG (6%мер ) MF 9 ОСТЛРООЛАОААООТGTTTCTTT GACAAGAGGCCTCTGCAGGAATTCT (49 -gegj

МГ 10 СТАОАОАЛТТССТОСЛОАООССТСТТСТССАААОАААСАССТТСТТ (46-МЕр) EBI-491:

5 TCGAGCTCATATACAATGG ATG GAA TTG CAA GTT TCC TCT

GGT TTC GTT TGT AAC АСТ TGT CCA GAA AAG TG

EBI-495:

3 CGAGTATATGTTACC ТАС CTT AAC GTT CAA AGG AGA ССА

AAG CAA ACA TTG TGA АСА GGT СТТ ТТС ACC TAG

1 (ЯаоЗА

Олигонуклеотиды MF2 — MF9 подвергают фосфорилированию. После прекращения реакции путем нагревания получают следующие смеси: MF1 и МРг; M F3 и MF4;

MF5 и MF6; MF7 и MF8; MF9 и MF10. После нагревания и охлаждения пять растворов объединяют и лигируют. К полученному раствору добавляют линеаризованную ДНК плазмиды pRH 242, полученную путем переваривания с помощью Xho1 и ХЬа1 и последующей очистке электрофорезом. Раствор лигируют и трансформируют в Е.coll IM101, Плазмиды полученных колоний исследуют путем переваривания с помощью Xho1 и

ХЬа1. При этом те плазмиды, которые содержат вставку длиной примерно 290 п,о. клонируют с М13мр8 с последующим анализом последовательностей. Плазмиду, содержаI щую правильную вставку, отбирают и обоз30 начают как pRH243.

r) Последовательность, кодирующую водорастворимую часть человеческого рецептора Fc< R малого сродства, выделяют из плазмиды pGEM4 путем переваривания с помощью Hindlll и EcoR1 и липкие концы дополняют с использованием фрагмента

Кленова ДНК-полимеразы 1 из Е.coll. Большой фрагмент подвергают фефосфорилированию и очистке, а затем гидролизуют с помощью Sau3A. Так как при этом удаляется нетолько 5 -область, но и нуклеотиды первых 18 N-концевых аминокислот водорастворимого фрагмента, начиная с аминокислоты 150, синтезируют два олгинодеоксинуклеотида

21 1727533 22 с тем, чтобы восстановить полный ген с ис- пользованием дрожжевого кодона формулы

Met

5 TCGAGCTCATATACA ATG

3 CGAGTATATGT TAC

XhoI

155 160 1б5

Glu Leu G1n Val $ек Ser Gly Phe Ча1 Cys Asn Thr Cys. Pro Glu

GAA TTG CAA GTT ТСС TCT GGT ТТС GTT TGT AAC АСТ TGT CCA GAA

СТТ AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA ACA GGT CTT

Lys Trp

AAG TG

ТТС АСС TAG

Sau3A

EBl-430:

5 ATGGAATTGCAAGTTTCCTCTGGTTTC ATG GAA TTG CAA GTT ТСС

TCT GGT ТТС GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG

EBI-437:

3 TACCTTAACGTTCAAAGGAGACCAAAG ТАС CTT AAC GTT CAA AGG

AGA ССА AAG CAA ACA TTG TGA АСА GGT CTT TTC АСС TAG 5

Sau3A

l с тем, чтобы восстановить полный ген с использованием дрожжевого кодона формулы

Met

5 ATG

3 TAC

GIu Leu Gln Ual $ег Ser Gly Phe Val Cys.Asn Thr Cys Pro Glu

GAA TTG CAA GTT ТСС TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA

CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA ACA TTG TGA АСА GGT CTT

Полученные олигонуклеотиды ренатурируют и лигируют с фрагментом Sau3A и

EcoRf c использованием лигазы Т4 ДНК.

Вставку лигируют ДНК, плазмиды

pRH242 по сайтам Xba1 и Xho1 и трансформируют в Е.coll!М101. Плазмиды полученных колоний исследуют при помощи рестрикционного анализа. Плазмиду, содержащую правильную вставку, отбирают и обозначают как pRH244. д) Последовательность, кодирующую водорастворимую часть человеческого рецептора Fc R малого сродства, выделяют из

I плазмиды pGEM4-Рс R путем переваривания с помощью Hindi ll ЕсоЮ и концы дополняют с использованием фрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 из E.coll. Меньший фрагмент подвергают дефосфорилированию и очистке, Так как Kindlll режет дДНК Fc< R примерно 50 п.о. после первой аминокислоты, 30 вставку подвергают гидролизу с помощью

Sau3A. Так как при этом удаляют не только

5 -область (в направлении конца). но и нуклеотиды первых 18 N-концевых аминокислот водо растворимого фрагмента, синтезируют два олигонуклеотида формул

Lys Тгр

AAG TG

TTC ACC TAG

Sau3A

Олигонуклеотиды ренатурируют, фрагмент Sau3A и ЕсоЯ1 добавляют и подвергают лигированию с помощью ДН К лигазы Т4.

Полученный фрагмент подвергают очистке путем электрофореза, электроэлюции и осаждения известными методами.

Вставку лигируют с ДНК плазмиды

pRH243 по сайтам Есор, и Stul и трансформируют в Е.coll IM101. Полученные колинии исследуют с помощью рестрикционного анализа. Плазмиду, содержащую правильную вставку, отбирают и обозначают как

pRH245. е) Плазмиды pRH244 и pRH245, состоящие из промотора ADH1, доминантного гена IVIFa (только в случае pPH245), водорастворимого гена Fc„. R и терминатора

ADH1, гидролизуют рестрйктазами Hiodlll u

BamH1 и лигируют с дрожжевой плазмидой

plDB207 или УЕр13.

Плазмиду LE392 или pGEM4 (рЕс- R — 1) переваривают при помощи Hindlll и EcoR1.

Фрагмент ДНК, начинающийся с нуклеотида 584, клонируют в плазмиду pGEM4, по сайтам Hindlll и EcoR1. Один из отобранных клонов размножают и обозначают как рANFc R-1.

Плазмиду LE392 или pGEM4 (рРс R-1) гидролизуют с помощью EcoR1 и получают фрагмент, содержащий дДНК длиной примерно 1,7 т.п.о (Fc R). Полученный фрагмент частично переваривают с помощью Sau3A с тем, чтобы удалить последовательность дДНК, кодирующую цитоплазменный домен, например, для аминокислот 1 — 23, и фрагмента дДНК, начинающего с нуклеотида 254, лигируют с 26-мерным линкером формулы

5 — GATCTGAGTCATGGTACCATGACTCA — 3 с тем, чтобы восстановить стартовый кодон

АТС на 5-конце и рестрикционное место

Крп1. Лигированный фрагмент клонируют в плазмиду pGEM4 по сайтам Крп1 и EcoR1.

Путем гибридизации отбирают клоны, у которых область предположительного цитоплазменного домена отсутствует. Один клон отбирают, размножают и обозначают как р Л NFc R — 2.

Общие материалы и методы.

Моноклональные анти-Fc

5 (g> ) и 8-30 (,и ) получались путем гибри-

1727533

24 дизации P3U1 миеломы с клетками мышиной селезенки, иммунизированными клетками RPM1-8866. Антитело 8 — 30 распознает эпитоп, смежный с местом связывания иммуноглобулина рецептора Fc, и может блокировать связывание иммуйоглобулина с лимфобластоидными клетками

8866. Антитело 3 — 5 распознает другой эпи1О топ íà Fc R и не может эффективно блокировать связывание иммуноглобулина с его рецепторами, Эти антитела осаждают в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях полипептиды с молекулярной массой 46 кд и 25 кд. Моноклональные антитела очищают путем осаждения 50 -ным насыщенным сульфатом аммония и последующей гелевой фильтрации с использованием сефарозы 6В (в случае иммуноглобулина М) или ионнообменной хроматографии с использованием сефадекса (в случае иммуноглобулина С1). Поликлониальный мышиный

55 иммуноглобулин G выделяют таким же образом.

Предварительно очищенный материал

Fc< R подают на колонку, уравновешенную водой, содержащей 0,1 трифторуксусной кислоты, и элюированную линейным градиентом ацетонитрила, содержащего 0,1 о трифторуксусной кислоты. При этом ацетонитрил применяют в количестве 0,5 мл/мин с соблюдением линейного градиента от 0 до

65о в течение 60 мин. Элюированный материал замораживают и лиофилизируют перед исследованием на активность методом эним.

Синтезированные олигодеоксинуклеотиды очищают путем электрофореза на полиакриламидном геле.

Пример А. Получение плазмиды pY—

i D B-Hu I F N-омега1. а) Получение дрожжевого промотора

АОН1.

8 мкг плазмиды pES103 переваривают с

BamH1 и Xho1 в 500 мкл раствора. Промотор длиной около 1450 п.о. отделяют в 1 -ном агаровом геле и осаждают. Фрагмент суспендируют в 40 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис, 1 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (далее ЭДТУ), рН 8). Плазмиду pES103 получают за счет введения в pUC18 переваренной BamH1 и Xho1 плазмиды AX 11 длиной около 1450 п.о. б) Подготовка вектора pIDB207.

10 мкг plDB207 линеаризуют при помощи BamH1, С целью предотвращения последующего повторного связывания удаляют

5 -концевые фосфатные группы путем обра- ботки фосфатазой кишечника теленка. Линейную форму отделяют в 1 -ном агаровом

25 геле от неразрезанной плазмиды. Полученный вектор ДНК растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера, в) Экспрессионный вектор для интерферона типа омега 1.

50 мкл плазмиды pRHW12 линеаризируют при помощи Hindi ll, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 и очищают путем электрофореза в агаровом геле. Для получения соединяющихся с промотором концов к концам линейного

pRHW12 присоединяют линкер Xho1.

Путем обработки 100 единицами. Xho1 освобождают специфические относительно

Xho1 клейкие 5 -выступы. Снабженный

Xho1-концами линейный pRHW12 очищают путем электрофореза в агаровом геле, добавляют 5 мкл промотора (со стадии "а"), лигируют и осаждают. ДИК суспендируют и режут при помощи BamH1. ДНК получают очисткой в агаровом геле.

r) Лигирование фрагментов.

Готовый экспрессионный вектор hollучают лигированием фрагмента BamH1 (промотор и ген интерферона типа омега 1) с вектором pIDB207. д) Трансформация.

Клетки Е.coli НВ101 трансформируют путем добавления раствора лигированной

ДНК и культивируют на LB-агаровых пластинках; содержащих 100 мкг/мл ампициллина. Выбирают 12 из полученных клонов и выделяют содержащиеся в них плазмиды.

После анализа плазмид при помощи рестрикционного анализа и электрофореза в агаровом геле отбирают плазмиду, имеющую правильную конструкцию. Ее обозначают как pY-IDB — HulFN-омега 1.

Пример Б. Конструкция экспрессионной плазмиды pRH100.

ДНК плазмиды pER103 р