Рекомбинантная плазмидная днк р 9 f мд, кодирующая гибридный полипептид р199 - asp pro cys cys - vp1 /200 - 213/ - pro pro ser pro - vp1 /131 - 152/ pro cys gly и штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент гибридного полипептида р199 - asp pro cys gly - vp1 /200 - 213/ pro pro ser pro - vp1 /131 - 152/ - pro cys gly

Рекомбинантная плазмидная днк р 9 f мд, кодирующая гибридный полипептид р199 - asp pro cys cys - vp1 /200 - 213/ - pro pro ser pro - vp1 /131 - 152/ pro cys gly и штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент гибридного полипептида р199 - asp pro cys gly - vp1 /200 - 213/ pro pro ser pro - vp1 /131 - 152/ - pro cys gly

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехноло гии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плэзмидную ДНК. содержащую искусственный ген. кодирующий гибридный белок, в состав которого входят антигенные детерминанты вируса ящура, промоторы ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок инициации трансляции, обуславливающий биосинтез полипептида, вызывающего при. иммунизации экспериментальных животных образование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. соП-продуцент этого полипептида . Рекомбинантная плаэмидная ДНК p9FMD кодирует иммуногенный полипептид Р199, в котором аминокислотная последовательность фактора некроза опухолей человека своим С-концом соединена с последовательностью AspProCysCys- VP1()-ProProSerPro(131-152}-Pro CysGiy. Она состоит из Sau3Al/HInd III - фрагмента ДНК-плазмиды pINF 314. содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7. полусинтетический ген фактора некроза опухолей человека с искусственным участком инициации трансляции, терминатор транскрипции фага лямбда и ген /J-лактамазы и Sau3AI/Hlnd Ill-фрагмента, содержащего синтетический ген. кодирующий пептидные антигенные детерминанты вируса ящура (штамм А22). При трансформации плазмидной p9FMD компе тентных клеток Е.срН SG20050 получают штамм - продуцент иммуногенного полипептида Р199 вызывающего образование антител, нейтрализующих вирус ящура подтипа А22. 2 с.п.ф-лы, 2 табл.. 1 ил. xi СО 01

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 15/42, 1/21

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ аи ив

I (21) 4840266/13 (22) 20.06,90 (46) 30.04,92. Бюл. М 16 . (71) Институт биоорганической химии им.

М.М.Шемякина и Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт (72) В.Г.Коробко, В.Н.Добрынин, С.А..Филиппов, Е.Ф.Болдырева. О.В.Некрасова.

А.В.Микульскис. В.Н.Иванющенков.

А.Н.Бурдов, Н.Н.Дрягалин и А.В.Чепуркин (53) 575.224.2.577.2 (048) (088.8) (56) Биоорганическая химия. 1989, т. 15, М

4. с, 508-513.

Gene. l986, ч. 49, р. 187-197. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК P9FMD. КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ

ПОЛИП ЕПТИД Р 199 — AspP ro Cys CysVP1 (200-213)-ProProSerPro-VP1 (131152)-ProCysGly И ШТАММ БАКТЕРИЙ

ESCHERICHlA C0Ll — ПРОДУЦЕНТ ГИБ-.

РИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА Р199AspProCysCys-VP1 (200-213) ProProSerprpЧР1-(131-152)-Pro CysGly. (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную1п

vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую искусственный ген. кодирующий гибридный белок, в состав которого входят .антигенные детерминанты вируса ящура, пфомоторы ранней области бактериофага

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную ln ч Иго рекомбинантную плаэмидную ДН К,,содержащую искусственный ген, кодифующий гибридный белок. в состав которого входят

5Ц. 1730151 А1

Т7 и синтетический участок инициации трансляции, обуславливающий биосинтез полипептида. Вызывающего при. иммуниэа ции экспериментальных животных образование вируснейтралиэующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. coll — продуцент этого полипептида. Рекомбинантная плаэмидная ДНК

p9FMD кодирует иммуногенный полипептид Р199. в котором аминокислотная последовательность фактора некроза опухолей человека своим С-концом соединена с последовательностью. AspProCysCysНР1(200-213)-ProProSer Pro(131-152)-Pro

CysGly. Она состоит из ЗаиЗА!/Hind Illфрагмента ДНК-плазмиды jiNF 314, содер- жащего тандем промоторов А2 и АЗ ранней области бактериофага Т7, полусинтетический ген фактора некроза опухолей человека с искусственным участком инициации трансляции, терм 1натор транскрипции фага лямбда и ген Р-лактамазы и $аоЗА!/Hind !

И-фрагмента, содержащего синтетический ген, кодирующий пеп.идные антигенныедетерминанты вируса ящура (штамм An). При (,л) трансформации плазмидной p9FMD компетентных клеток E. соИ. SG20050 получают ц штамм — продуцент иммуногенного полипептида Р199. вызывающего образование антител, нейтрализующих вирус ящура подтипа Атл. 2 с.п.ф-лы, 2 табл.. 1 ил..антигенные детерминанты вируса ящура, промоторы ранней области бактериофага

Т7 и синтетический участок инициации . трансляции, обусловливающий биосинтез полипептидов. вызывающих при иммунизации экспериментальных животных образо1730151 вание вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. coll — продуцент этого полипептида.

Вирус ящура вызывает высококонтагиозное заболевание парнокопытных сельскохозяйственных животных, наносящее значительный ущерб странам с высокоразвитым животноводством, В настоящее время в качестве вакцины против ящура используют инактивированный вирус. Технология приготовления такой вакцины требует небезопасного крупномасштабного культивирования вирулентного вируса. Главным недостатком ее применения являются вспышки заболевания, вызванные неполностью инактивированным вирусом.

Вирус ящура представляет собой нуклеопротеид,-состоящий иэодной молекулы одноцепочечной значащей РНК и 60 копий каждого иэ капсидных белков ЧР1, ЧР2, ЧРЗ .и VP4. Установлено, что поверхностный белок VP1 является главным антигеном и способен инициировать при вакцинации образование вируснейтрализующих антител. Однако полученный в чистом виде из вирусной частицы или технологией рекомбинантных ДНК белок VP1 вызывает слабый иммунный ответ.

Альтернативный подход к созданию субьединичных вакцин против вируса ящера вытекает из наблюдения, что синтетические пептиды, включающие аминокислотные последовательности 141-160 и

200-213 белка VP1 вызывают образование значительного уровня вируснейтрализую.щих антител при иммунизации этими пептидами в виде коньюгатов с белком-носителем. Однако и в этом случае иммуноген. ность наиболее активного из этих пептидов остается в 100-1000 раз ниже, чем иммуногенность целого вируса, Отмеченные трудности в создании субьединичной вакцины можно преодолеть, используя для синтеза иммуногенного пептида технологию рекомбинантных ДН К.

Известна рекомбинантная плазмида

pFMD65, кодирующая гибридный белок, в котором аминокислотная последовательность В-галактозидазы Е. coll соединена с повторяющейся последовательностью 141160 белка VP1 вируса ящура (штамм 01К).

Методами иммунодиффузии и иммуноферментного анализа показано, что гибридный белок, продуцируемый бактериями, содержащими рекомбинантную плазмиду

pFMD65. специфически связывается с антителами к целому вирусу ящура 01К и к фрагменту 136-148 капсидного белка ЧР1.

20

Известны рекомбинантные плазмиды

pM0t — 71, рМ01-72, рМО1-74 и рМ01 — 78, кодирующие гибридный белок, я котором единичная или повторяющееся последовательности 137-162 поверхностного белка

VP1 вируса ящура (штамм 01, BSF) слиты с последовательностью Р-галактоэидазы Е.

coll. Кодируемые этими плазмидами гибридные белки способны при иммунизации морских свинок. вызывать появление вирусспецифических антител, взаимодействующих в иммуноферментном тесте и иммуноблоттинге с рекомбинантным антигеном.

Однако данные о способности получаемых антител нейтрализовать вирус и предотвращать инфекцию отсутствуют.

По принципу конструирования рекомбинантная плазмида pFM065, кодирующая гибрид Р-галактозидаза-антигенная детерминанта вируса ящура 01К вЂ” является.- наиболее близкой к предлагаемой.

Основным недостаткам перечисленных выше плаэмидных конструкций является то, что все они кодируют гибридные белки, в

25 которых антигенные детерминанты соединены с )3-галактозидазой E. coll. Применение таких гибридов в качестве вакцин вояд ли возможно, поскольку сама бактериальная Р-галактоэидаза является достаточно

30 сильным иммуногеном; кроме того, доля пептидного фрагмента в таком сплавленном белке слишком мала, чтобы вносить существенный вклад в иммунный ответ.

Сконструирована рекомбинантная

35 плазмидная ДНК p9FMD, кодирующая биосинтез иммуногенного полипептида Р199, который индуцируетсбразование нейтрали- эующих антител против подтипа An вируса ящура, и бактериальный штамм Е. coll.

40 ВКПМ В-5296 — продуцент этого полипептида, обеспечивающий высокий уровень его биосинтеза.

Кодируемый плаэмидой p9FMD иммуногенный полипептид состоит из аминокис45 лотной последовательности фактора некроза опухолей человека, соединенной своим С-концом с последовательностью универсальной антигенной детерминанты вируса ящура (последовательность 200-213

50 аминокислот белка ЧР1), которая, в свою очередь, посредством последовательности .ProProSerPro, обеспечивающей изгиб полипептидной цепи, соединена с последовательностью главной вариабельной ан55 тигенной детерминанты вируса ящура. (последовательность 131-152 белка ЧР1).

Выбор последовательности антигенного полипептида обусловлен имеющимися в литературе данными по локализации главного

1730151 иммуногенного эпитопа вируса ящура и обеспечивает моделирование пространственной сближенности двух а-спиралей анти- . генных детерминант, которое. по-видимому, имеет место в вирусной частице. 5

Рекомбинантная плазмидная ДНК

p9FMD, кодирующая иммуногенный- полипептид Р199, характеризуется следующи ми. признаками: кодирует аминокислотную поСле+ 10 довательность гибридного белка . фактор некроза опухолей человека —:

AspProCysCys.-VÐ1 (200-213)-ProProSerProVP1 (131-152)-ProCysGly; имеет мол.м, 2,49 Мд (3,81 т.п.о.), 15 состоит из

Sau3AI/Hindi l1-фрагмента ДН К плазмиды р TNF314 Л, содержащего тандем проматоров А2 и AÇ ранней области бактериофага

Т7, полусинтетический ген фактора некроза. 20

- опухолей человека с искусственным участком инициации трансляции, терминатор транскрипции. фага лямбда и ген Р-лактамазы (3,66 т.п.о.), ЯацЗА1/Н! пб111-фрагмента, содержаще- 25

ro синтетический ген. кодирующий пептиды антигенных детерминант вируса ящура (подтип An); содержит в качестве генетического маркера ген 30

Р-лактвмаэы, детерминирующий устойчи-. вость трансформированных плазмидой

p9FMD клеток E. coli к пенициллиновыман-. тибиотикам, уникальные сайты узнавания рестрик- 35 ционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях вправо от сайта BstEll: BamHI.— 73 нуклеотида, BgllI—

154 нуклеотида, Hindtll — 229 нуклеотидов, Nco1 — 562 нуклеотида, Pstl-2406 нуклеоти- 40 дов.

На чертеже изображены схемы лигазных сшивок синтетических олигонуклеотидов в двухцепочечные ДНК(сегменты А и 8),кодирующие пептиды — антигенные: детер- 45 минанты белка оболочки VP1 вируса ящура (штамм An). Для получения этих двухцепо. чечных ДНК амидофосфитным способом синтезируют одиннадцать олигонуклеотидов величиной от 13 до 43 нуклеотидных 50 звеньев, которые затем соединяют при-помощи ДНК-лигаэы как указано на чертеже. .:

Для дальнейшего конструирование используют рекомбинантную плазмвду

pTNF314 Ь которая является производной 55 плазмиды pTNF311 b,с измененной с помощью слигонуклеотид-направленного мутагенеэа С-концевой частью искусственного гена фактора некроза опухолей человека. 8 результате в самый С-.конец гена был введен уникальный для этой плаэмиды рестриктный сайт Bglll. ДН-плазмиды

pTNF314 Ь расщепляют эндонуклеаэами

Bglll и Hindi l1, больший фрагмент выделяют и лигируют. с избытком нефосфорилированного: сегмента А. Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coil

Н8101, Трансформанты высевают íà L8arap, содержащий 50 мкг/мл ампициллина. и скрининг колоний проводят гибридизацией с 5 (Р)-меченным олигонуклеотидом

Vll. Иэ гибридизующихся клонов. выделяют плазмидную ДНК p7FMD; строение которой подтверждают рестриктным анализом с помощью эндонуклеаз Нае111 и Mspl. а также определением нуклеотидной последовательности части плазмидной ДНК. между сайтами рестриктаз Hind. И! и ВавН!.

Для конструирования. новой рекомбинантной плазмиды p9FMD плазмидную

ДНК p7FMD сначала линеариэуют гидролизом эндонуклеазы Pstl, а затем полученную таким образом линейную форму ДНК подвергают действию рестриктазы Крп!. Иэ образовавшейся смеси. фрагмент величиной . около 2;2 т.п.о. выделяют электрофореэом в

1;,-ном геле легкоплавой агарозы. С другой стороны ДНК-плаэмиды pTNF314 Лгидролиэуют смесью рестриктаз Bglll è Pstl. Выделенный электрофорезом как описано, выше Pstl/Bglll-фрагмент величиной около

1,6 т.п.о. лигируют в присутствии большого избытка синтетического сегмента 8 с

Pstl/Крп1-фрагментом ДНК плаэмиды

p7FMD величиной около 2,2 т.п.о, Частью лигазной смеси трансформируют компетентные клетки Е, соИ НВ101; трасформанты высевают на 1,77; 1 В-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг проводят путем in situ гибридизации колоний с 5-!

f Р)-меченным олигонуклеотидом Xfl. Выделенную из гибридизирующихся колоний

ДНК плазмиды p9FMD анализировали при помощи рестриктаз Mspl u Нае1И и ее структуру подтверждали определением нуклеотидной последовательности в районе клонирования сегмента В.

Рекомбинантная плазмида p9FMD кодирует иммуногенный пептид Р199, который представляет собой белок фактора некроза опухолей человека, слитый через дипептид AspPro с последовательностями антигенных детерминант подтипа An вируса ящура.

Для получения бактериального штамма— продуцентов иммуногенного полипептида

1730151

Р199 плазмидой p9FMD трансформируют компетентные клетки E. coll SG20050.

Полученный таким образом штамм Е.

coll ВКПМ В-5296 характеризуется следующими признаками, Морфологические признаки. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах.

При росте на агаре "Дифко" колонии круглые, гладкие, прижаты, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте в жидких средах (на минимальной. среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40 С при оптимуме рН 6,8-7,0. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до

300 мк/мл), обусловленную наличием плазмиды, а также к тетрациклину(до 30 мкг/мл}, благодаря наличию транспозона.

Штамм Е. coll ВКПМ В-5296 обусловливает конститутивный синтез больших количеств {свыше 25g> тотального клеточного. белка бактерий) иммуногенного полипептида Р199, способного при иммунизации животных вызывать образование антител, нейтрализующих вирус ящура подтипа An.

Пример 1. Химический синтез и лигирование олигонуклеотидов.

Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе System 1 (Beckman) с ,наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3-конца к 5-концу с not мощью защищенных фосфамидитов — 5 диметокситрил-N-ацил-2 -дезоксинуклеоэид1

3 -0-(метоксидиизопропиламино)-фосфиI тов, активированных тетраэолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А, размер пор 40-80 мкм), к которому через 3-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузкаЯО-30 мкмоль/г). После проведения конденсации промывают смолу смесью тетрагидрофуран-пиридин-вода (5:3:2), По окончании синтеза защитные группы удаляли последовательной обработкой тиофе нолятом триэтиламмония и концентрированным аммиаком. При этом происхо5

55 дит отделение олигонуклеотида от носителя. 5-Диметокси-тритильную группу удаляют кислотной обработкой, и олигонуклеотид очищают электрофорезом в 207; ПААГ, содержащем 7М мочевину, Выход — 1 — 5 о,е.

Лигазная сшивка. Смесь 250 пмоль каждого из нефосфорилированных олигонуклеотидов (I) и (ЧИ) и 200 пмоль каждого из фосфорилированных олигонуклеотидов (И)(Vl) нагревают. 10 мин при 90 С в 100 мкл буфера; содержащего 20 MM трис-НО, рН

7,5, и 10 мМ М9С12, затем медленно охлаждают до 15 С, прибавляют rATP до концентрации 0,2 мМ, дитиотреит до концентрации

5 мМ и 100 ед. Т4 ДН К-лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15 С, затем депротеинизируют двукратной фенольной экстракцией фенолом; ДНК высаживают этанолом и продукты сшивки выделяют при помощи электрофореза в 157; ПААГ. содержащем ? М мочевину, Нужный полинуклеотид выделяют из геля электроэлюцией на 0ЕАЕ-бумагу

0Е-81, которую промывают несколько раз

ТЕ-буфером (10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,5 мМ

ЕОТА) и этанолом. Нуклеотидный материал элюируют при помощи 1,5 М раствора NaCI в TE-буфере и обессоливают на колонке с сефадексом G 50. Выход сегмента А — 160 пмоль. Аналогичным образом получают сегмент В. Выход — 150 пмоль.

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК p7FMD.

Клетки бактерий Е. соИ Н В101, содержащие плаэмидную ДНК pTNF314 Л, выращивают при 37 С в LB-бульоне, содержащем

100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем плазмидную ДНК выделяют в соответствии с процедурой щелочной денатурации с модификациями, заключающимися в том, что к супернатанту, полученному после подкисления ацетатом натрия, прибавляют РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл, смесь инкубируют 20 мин при 37 С, экстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1:1) и ДНК высаживают этанолом.

Осадок растворяют в ТЕ-буфере, содержащем 1 М NaCI, прибавляют полиэтиленгликоль РЕ6-6000 до концентрации 1,5о, выдерживают 1 ч при 0 С, центрифугируют

10 мин при 10000 об/мин; осадок промывают 70 этанолом. высушивают и растворяют в ТЕ-буфере. Выход плазмидной ДНК определяют спектрофотометрически при

260 нм с использованием коэффициента экстинкции 20 о,е./мг.

К раствору 2 мкг плазмиды pTNF314 Ав

30 мкл буфера й, содержащего 20 мм трисНО, рН 7,5, 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCI2, 7 мМ меркаптоэтанол, инкубируют со смесью ре9 1730151 10

20

5000 об/мин). промывают раствором 10 мМ 25

CaClz и через 3 ч используют для трансфор- 30 мации-. С этой целью 5 мкл лигазной смеси . смешивают с 50 мкл 0,05 М СаС1г, затем прибавляют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают при 0 С. затем 2 мин при 42 С и снова 10 мин при О С, после 35 чего прибавляют 2 мл LB-бульона, инкубируют 1 ч при 37 С и аликвоты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл). Клоны бактерий, содержа40

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды 55 стриктаз Hlndlll u Bglll (по 10 ед. каждой) в течение 1 ч r.ðè 37 С. После инкубации реакцию останавливают двухкратной экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1). и векторный фрагмент очищают электрофорезом в 17ь геле легкоплавкой агарозы, ДНК выделяют методом замораживания — оттаивания и высаживают 70 этанолом. K раствору 0,2 мкг полученного таким образом вектора в 20 мкл буфера L, содержащего 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 MM М9С!г, 0,2 мМ

rATP и 5 мМ дитиотреит. прибавляют 0.1 мкг сегмента А и 20 ед. Т4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15 С, затем аликвоту (1/4) реакционной смеси используют для трансформации компетентных E; coll.

Трансформацию проводят следующим образом. Предварительно клетки Е. colt H8191 высевают на агар, содержащий среду М9, 0,2 глюкозы и 2 мкг/мл тиамина. Единич. ную колонию вносят в 50 мл питательного бульона LB и выращивают при 37 С до мутности 0,3 — 0,5. Затем клетки охлаждают. осаждают центрифугированием (10 мин, Mg Clz, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора CaClz и выдерживают при

0 С в течение 30 мин. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 M щие целевую плаэмиду p7FMD. идентифицируют гибридизацией с одним из олигонуклеотидов P — Vll, входящих в созг став клонируемого сегмента А. Из гибридизующихся с этой пробой клонов выделяют плазмидную ДНК, строение которой подтверждают рестриктным анализом с помощью рестриктаэ Hael I I u Mspl.

Окончательно структуру рекомбинантной плазмиды p7FMD подтверждают определением нуклеотидной последовательности плазмиды в области вставки синтетической

ДН К.

Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК p9FM0..

p7FMD в 80 мкл буфера R прибавляют 20ед. каждой из рестрикционных нуклеаз РЫ и

Kpnt и инкубируют 90 мин при 37 С. АнаЛиз полноты гидролиза и выделение векторного

Kpnt/Pstl-фрагмента (2,2 т.п.о.) проводят

50 при помощи электрофореза в 1 -ном геле легкоплавкой агарозы. Одновременно 10 мкг ДНК плазмиды pTNF314 b в 100 мкл буфера R обрабатывают 1,5ч при 37 С 20 ед, каждой из реотриктаз Bglll и Kpnl, после чего фрагмент величиной около 1.6 т.п.о.. содержащий синтетический гей антигенной детерминанты, выделяют при помощи электрофореза в 17ь геле легкоплавкой агарозы: как описано в примере 1. Далее этот фрагмент (0,2, мкг) соединяют в присутствии 0,3 мкг сегмента В с векторной. ДНК (1,5 мкг) при помощи 30 ед. Т4 ДНК лигазы в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15 С. Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coll

НВ101. Трансформанты высевают на агаризованную среду. содержащую ампициллин (50 мкг/мл). Скрининг бактериальных клонов, содержащих рекомбинантную плаэмиду p9FMD, проводят гибридизацией колоний 1и situ c P-меченным олигонукле32 отидом (ХИ). Из клонов, гибридизирующихся с радиоактивной пробой, выделяют плазмидную ДНК p9FMD. строение которой подтверждают гидролизом рестриктазами

Mspl и Haelll, а также определением нукле- . отидной последовательности в районе вставки синтетического дуплекса.

Пример 4. Получение штамма-продуцента иммуногенного полипептида, вызывающего образование антител, нейтрализующих вирус ящура подтипа An.

Плазмидой p9FMD трансформируют компетентные клетки Е. coll SG20050 по методу, описанному в примере 1, и получают штамм Е. соИ ВКПМ 8-5296 — продуцент иммуногенного полипептида, вызывающего образование антител, нейтрализующих вирус ящура подтипа Агг. Иммунные свойства полипептида из штамма-продуцента подтверждены иммуноблоттингом.

Пример 5. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного полипептида

Р199 (биологические испытания).

Для иммунизации лабораторных животных выделенный из биомассы штамма-продуцента рекомбинатный белок Р199 при определенной концентрации смешивают в равном объемном соотношении с неполным адъювантом Фрейнда.

Гр;-ппе морских свинок или кроликов массой соответственно 0,5 или 2,0 кг вводят вакцинирующий раствор однократно или двукратно в обьеме 1,0 мл в дозе 150-200 мкг.

Вторую иммунизацию проводят через

38-42 дня после первой, Вируснейтралиэующие антитела определяют на 47-60 день после первой иммунизации на культуре кле12

1730151

Таблица 1

Результаты биологических испытаний рекомбинантного белка

Р199 на кроликах

Группа живо- Количество Доза, мкг Кратностьвве- Интервал вве- Средний титр тных животных ения ения, ни ВНА Io г

1 4 1

150

4.8.

6.4

Таблица 2

Результаты биологических испытаний рекомбинантного белка

Р199 на морских свинках ток сВиной почки против 100 ТЦД50 Вируса ящура подтипа An.

На 47-55 день после первой иммунизации морских свинок заражают введением

500 ИД5о вируса ящура An, адаптированного к организму морских свинок, и определяют протективный аффект.

Данные титрования вируснейтрализующих антител и протективный эффект приведены втаб. 1 и2.

Таким образом. рекомбинантный белок

Р199, выделенный из биомассы штаммапродуцента ВКПБ 8-5296, обладает защитным действием против вируса ящура подтипа An и индуцирует высокий уровень вируснейтрализующих антител у кроликов и морских свинок.

Формула изобретения

1. Рекомбинантнзя плазмидная ДНК

p9FM0; кодирующая гибридный полипептид Р199-AspProCysCys — VP1 (200-213)—

ProProSerPro-VP1(131-152)-ProCysGly, мол.м, 2,49 Мд и размером 3,81 т.п.о., содержащая Sau3AI — Hind Ш вЂ” фрагмент ДНКплазмиды pTNf314 Ьс тандемом промоторов А2 и АЗ ранней области бактериофагз

Т7, полусинтетическим геном фактора некроза опухолей человека и с искусственным

5 участком иницииации трансляции, терминатор транскрипции фага лямбда и геном флактамазы размером 3,66 т.n.;

Hind lII — Sau3AI — фрагмент с синтетическим геном, кодирующим пептиды — анти10 генные детерминанты вируса ящура подтип

Ад; генетические маркеры; ген Р-лактамазы. обеспечивающий устойчивость пенициллиновым антибиотиком; уникальные сайты узнавания рестрикционными зндо15 нуклеаззми, а расположенные на следующих расстояниях вправо от сайта BstEII:

BamHI — 73 нуклеотида, Bgl II — 154 нуклеотида; Hind lli — 229 нуклеотидов; йсо! — 562 нуклеотида, Pstt — 2406 нуклеотидов.

20 2. Штамм бактерий Esherichia coli ВКПМ

B.-5296 — продуцент гибридного полипептидз Р199 — AspProCysCys VP1(200-213)—

РгоProSerPro-ЧР1(131-152)ProCysGly.

1730151

I III IV

GATCCTAACGGTACCGGTAAATACTCTGCTG GGTATGGGCCGTA GGAGATGATTGCCATGGCCATTTATGAGACGACCACCATACCCGGCATCTCCTÑÒÀII и

LeuG и.Рго еиА с аРгоСуа у7егТег

СТАС CCTCTGGCTGCTCCTTGTGGTTAATA

САТСТТССАСАСССАСОАССААСАССААТТАТТССА

VII

СЕГМЕНТ А

АврРгоСуаСуаАгЯН 1айуаСХпйуаП.еП еАХаРгоА а

XI

GATCCTTGTTGTAGACACAAACAGAAAATC TGCACCTGCAGAACAACATCTCTGTTTGTCTTTTAGTAACGTGGACGTХII

1ysGl ïéåèéåèÐãîÐãîÂåãÐãîÀàïÑÕ уН1а

ХХХХ

AAACAACTTTTGCCTCCTTCTCI:TAACGGTAC

TTTGTTGAAAACGGAGGAAGAGGATTGC

VIX

СЕГМЕ3й В

Составитель В.Коробко

Техред М.Моргентал Корректор 8.Гирняк

Редактор А.Лежнина

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101

Заказ 1489 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5