Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа - продуцент l - метионина

Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа - продуцент l - метионина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, продуцирующего L-метионин, который может быть использован в качестве добавки в корм животным и как лекарственный препарат . Целью изобретения является получение прототрофного штамма бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-4167, обладающего более высоким уровнем биосинтеза L-метионина по сравнению с известными. Штамм способен накапливать в ферментационной среде до 3,5 г/л L-метионина, не нуждается в экзогенных аминокислотах, устойчив к ингибирующему действию DL-этионина в концентрации 10мг/мл. 1 табл. mS Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4838128/13 (22) 16.04,90 (46) 30.04.92. Бюл. N. 16 (71) Одесский государственный университет им. И.И.Мечникова и Всесоюзный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) И.И.Броун, М.M.Ãócÿòèíåð, О.Б,Полодиенко, В.Н.Тоцкий, Ю.Д.Цыганков и А.Ю.Чистосердов (53) 663.15 (088.8) . (56) Патент США N 3729381, кл. С 12 P 13/12, 1970.

Патент Японии ¹ 4995, кл, С 12 P 13/12, 1984.

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий; продуцируемого L-метионин, который мо.жет быть использован в качестве добавки в корм животным и как лекарственный препа- рат.

Известен штамм бактерий Corynebacterium gIutamicum АТСС 21608 — продуцент L-метионина, Штамм получен путем селекции на устойчивость к ингибирующему . действию 10 структурных неметаболизИруемых аналогов аминокислот и является ауксотрофным по треонину. При его использовании максимальное накопление метионина (3,4 г/л) достигается за 72 ч ферментации.

Недостатком штамма является его ауксотрофность flo треонину. требующая экзогенного внесения треонина или его Ы 1730152 А1 (я)5 С 12 Р 13/12, С 12 N 1/20//(С 12

N 1/20, С 12 R 1:40) (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUD0M0NAS

PUTIDA — ПРОДУЦЕНТ L-МЕТИОНИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, продуцирующего L-метионин, который может быть использован в качестве добавки в корм животным и как лекарственный препарат. Целью изобретения является получение прототрофного штамма бактерий

Pseudomonas putida ВКПМ B-4167, обладающего более высоким. уровнем биосинтеза

1=метионина по сравнению с известными, Штамм способен накапливать в ферментационной среде до 3,5 г/л L-метионина, не нуждается в экзогенных аминокислотах, устойчив к ингибирующему действию DL-зтионина в концентрации 10 мг/мл. 1 табл. источника в среду культивирования, что удорожает ее..

Известен штамм бактерий Pseudoтопаз sp. — продуцент =метионина, Штамм получен путем селекции на устойчивость к ингибирующему действию двух неметаболизируемых аналогов (DL-этионину и L-ами- Ql но-P-оксивалериановой кислоте). Штамм ) продуцирует 0,400 г/л метионина.

Недостаток штамма — низкий уровень образования метионина.

Целью изобретения является получение прототрофного штамма бактерий

Pseudomonas putida ВКПМ В-4167, обладающего более высоким уровнем биосинтеза

L-метионина по сравнению с известными.

Штамм получают следующим образом.

Бактериальную суспензию выращивают до начала логарифмической фазы роста (2-3 10 клеток/мл) в бульоне на качалке. в

1730152

Клетки собирают центрифугированием, отмывают и ресуспендируют в 0,1М MgS04.

Для синхронизации бактериальной культуры ее помещают на 5 мин в холод, Ультрафиолетовое облучение культуры проводят в чашках Петри в присутствии неметаболизируемого аналога (этионина) при равномер2 ном перемешивании дозой 13,5 кДж/м в течение 15 мин. Культуру бактерий, прошедшую мутагенез, высевают на градиент неметаболизируемого аналога целевой аминокислоты.

Градиент аналога приготавливают следующим образом.

0,4 / -ную агаризованную минимальную питательную среду М9 разделяют на две части, В одну из частей добавляют аналог метионина-DL ýòèîíèí в концентраЦии 15 мг/мл и выливают в пластмассовый стерильный пенал, установленный в наклонном положении, в результате чего агар застывает в виде клина. После того, как среда застывает, пеналы устанавливают горизонтально и выливают в расплавленном состоянии оставшуюся агаризованную среду, Таким образом, в агаризованной среде возникает градиент, На поверхность застывшей среды, содержащей меньшую. концентрацию аналога, высевают культуру бактерий. После инкубирования при 30 С в течение 7 дней отбирают биомассу клеток, наиболее далеко переместившихся на градиенте этионина, и клонируют на богатой питательной среде. Полученные таким образом отдельные клоны, устойчивые к этионину, испытывают на способность к избыточному синтезу метионина с помощью ауксонографического теста и ферментации. Лучшим из отобранных клонов был Р. putida ВКПМ В-4167.

Штамм хранят следующим образом.

1 способ — хранение под маслом.

Выращенную на скошенном мясо-пептонном аггре культуру заливают вазелиновым маслом так, чтобы .его слой не превышал скошенный край среды. Хранение культуры под маслом осуществляют в холодильнике при (+ 4) — (+ 6) С. Периодичность пересевов — раз s год.

2 способ — хранение клеток в лиофилизированном состоянии.

Культуру клеток выращивают в оптимальных условиях до начала стационарной фазы роста. Затем суспендируют в защитной среде, разливают по ампулам по 0,5 — 1,0 мл, замораживают при температуре от -20 до -70 С, высушивают и упаривают под вакуумом. Ампулы с лиофильно высушенными клетками хранят в темноте при 4 — 6ЯС. Срок хранения — несколько лет.

Штамм имеет. следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

5 Прямые палочки размером 0,5-2,0 мкм, подвижные (многотрихи), располагаются одиночно, грамотрицательные, неспорообразующие. Мясо-пептонный агар (МПА): через 24 ч роста при 28 С колонии с ровными

10 краями, круглые. блестящие, гладкие, выпуклые; консистенция однородная, диаметр колоний 1-3 мм.

Агаризованная минимальная среда

Адамса: через 40-42 ч при 28ОС колонии

15 диаметром 0,5-1 мм, Рост в мясо-пептонном бульоне: после

24 ч культивирования при непрерывной аэрации и перемешивании сильное равномерное помутнение, запах характерный, 20 Физико-биохимические признаки, Отношение к источникам углерода (см. таблицу):

Отношение к источникам азота: усваивает азот в форме аммония и солей

25 азотной кислоты.

Желатин не разжижает.

Протеолиз казеина отсутствует.

Крахмал и полиф-оксибутират не гидролизует.

30 . Липолитической активностью не обладает, Оксидазная реакция положительная.

Обладает аргинингидролазной активностью.

35 Образование левана из сахарозы не происходит.

Сероводород не образует.

Образует каталазу.

Не образует пиацианин и другие фена40 зиновые пигменты.

Синтезирует желто-зеленые флюоресцирующие пигменты.

Аэро б.

Температурный диапазон роста — (+10)45 (+30) С; оптимум роста — 25-30 С.

Растет в средах с рН 6,8-7,5; оптимальное значение рН 7,0.

Предлагаемый штамм характеризуется

50 устойчивостью к ингибирующему действию

DL-этионина (10 мг/мл). способен накапливать s среду ферментации до 3,5 г/л метионина. При выращивании на посевной и ферментационной среде не нуждается в эк55 зогенных аминокислотах, Одним из важных свойств предлагаемого штамма-продуцента является его способность к избыточному синтезу только метионина (2,3 г/л), хотя в среде культивирования идентифицировали

1730152. Субстрат

Способность к утилиэа ии

Субстрат

Способность к утилиэа ии

2-Кетокл ю канат

Меэо-инозит -валин

L-аланин

ЕИ=аргинин

L-серин

О-триптофан

Фенилаланин

Бетаин

Мочевина целлобиоза

Со бит ..

Глюкоза

0-манноза

Мал ьтоза

L-рамноза

Сахароза

0-ксилоэа

Фруктоэа (:арабиноза

Гэлдктоза

О-лактоза

Маннит ль ит

Составитель Л.Минеева

Техред М.Моргентал Корректор В.Гирняк

Редактор А,Лежнина

Заказ .1489 Тираж Подписное . ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушекая наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101 не только метионин, но и его окисленную форму — метионинсульфоксид (1,2 г л ).

Получение (=метионина с использованием предлагаемого штамма-продуцента осуществля ют следующим об разом, 5

Штамм выращивают на МПА и полученной суспенэией клеток засевают жидкую посевную или ферментационную среду.

Выращивание посевного. материала ведут при 28-30 С, рН 6,8-7,2 и непрерывном 10 аэрировании и перемешивании. Приготовленный таким способом посевной материал или суспензию клеток, смытых с агара, используют для засева ферментационной среды, содержащей источники углерода и азота 15 и минеральные соли.

Ферментацию осуществляют в аэробных условиях при 25 — 28 С в течение 72 ч.

Определение содержания метионина в культуральной жидкости проводят с по- 20 мощью метода бумажной хроматографии в системе растворителей: бутанол — уксусная кислота — вода (8:3:1), а также методом хроматографии на пластинках Siiufol в той же системе растворителей. 25

Пример, Штамм выращивают в течение 24 ч при 28 С íà МПА, затем ресуспендируют и суспензию с титром 10 кл/мл используют для засева посевной среды следующего состава. г/л: глюкоза 10; MgSQ<

0,4; (NH4)zS04 0,5; ЕеОз 7HzO 0.002;

MgOz 5Н О 0.002; KWzP04 1; вода остальное.

Посевной материал выращивают в течение 28 ч в колбах емкостью 300 мл с 50 мл посевной среды на качалке .(200 — 220 об,/мин). Выращенным посевным материалом с титром 6 — 8 10 кл/мл засевают

9 ферментационную среду. Состав ферментационной среды, г/л: (ИН4)г$04 10; КН Р04 1;

KCl 2; MgSO4 7Н О 0,4; глюкоза 100; мел

25; водопроводная вода; рН 7,0.

Ферментацию проводят при аэрировании и перемешивании со скоростью 220230 об./мин и 26-30 С. После 72 ч культивирования в ферментационной среде накапливается 3,5 г/л L-метионина.

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas putida

В КП М В-4167 — и родуцент L-метионина.