Способ получения производных метилендиоксифенантрена или их фармацевтически совместимых солей

Патент 1731053

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение касается производных метилендиоксифенантрена, в частности получения соединений общей ф-лы I: (k s COffl где или метоксигруппа, или их фармацевтически приемлемых солей, способных повышать защиту от инфекции и вызывать активацию фагоцитоза лейкоцитов, что может быть использовано в медицине. Цель - повышение выхода целевого продукта при расширении их ассортимента. Синтез ведут реакцией 6-бромпиперонилбромида с трифенилфосфином в среде безводного бензола , толуола или ксилола при кипячении с последующей последовательной обработкой полученного продукта: ометоксибензальдегидом в среде диметилформамида в присутствии метилата лития при нагревании образуется смесь цис/транс-изомеров в соотношении 85/

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ООН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР ((21) 4028078/04 (22) 27.08,86 (31) P 3530718.8 (32) 28.08.85 (33) DE (46) 30.04.92. Бюл. й- 16 (71) Др. Мадаус ГмбХ. Унд Ко. (DE) (72) Клаус Гердер, Гюнтер Крумбигель, Михаэль Ханак (DE) и Лакшмина Райя напур Субраманиан,-(!М) (53) 547.841.07 (088.8) (56) Hukhopadhyay S. et al. J.Nat.

Products„ 1983, v.46, с.507, Morris Kupchan S. ec al. Photochemical Synthesis of Phenanthenes.

J.0rg.Chem., 1965, 30, с. 3792. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ

ИЕТИЛЕНДИОКСИФЕНАНТРЕНА ИЛИ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ СОВМЕСТИМЫХ СОЛЕЙ (57) Изобретение касается производных метиленциоксифенантрена, в част ности получения соединений общей ф-лы I:

» SU 173 053 ДЗ (51)5 С 07 D 317/64// А 61 К 31/335

2 где R)=OH или метоксигруппа, или их фармацевтически приемлемых солей, способных повышать защиту от инфекции и вызывать активацию фагоцитоза лейкоцитов, что может быть использовано в медицине. Цель вЂ” повышение выхода целевого продукта при расширении их ассортимента. Синтез ведут реакцией 6-бромпиперонилбромида с триФенилфосфином в среде безводного бензола, толуола или ксилола при кипячении с последующей последовательной обработкой полученного продукта: ометоксибензальдегидом в среде диметилформамида в присутствии метилата лития при нагревании образуется смесь цис/транс-изомеров в соотношении 85/

/15); эфиром (транс-изомер переходит в раствор, осадок отфильтровывают);

УФ-светом в среде смеси абсолютного

1,2,3,4-тетрагидро-9-флуоренона и a6- солютного циклогексана в присутствии иода; цианидом меди при кипячении в среде диметилформамида; водным раствором щелочи (гидролиз); при необходимости пиридингидрохлоридом с последующим выделением целевого продукта в свободном виде или в виде нужной соли. Выход в этом случае повышается с

2,2 до 6,37. 4 ил,, 7 табл.

1731053

Изобретение относится к способам получения производных метилендиоксифенантрена общей формулы I

0 где R1 - метокси- или гидроксигруппа, или их фармацевтически совместимых солей, которые обладают свойством по-. вышать защиту от инфекции и вызывать активацию фагоцитоза лейкоцитов.

В качестве иммуностимулирующих средств при профилактике и терапии инфекционных заболеваний известны

Aristulochia-кислоты (аристолохиевые кислоты) формулы А

ООН О2 где К вЂ” атом водорода или метоксигруппа, которые проявляют повышающее,фагоцитоз и антивирусное действие и повышают успех лечения в: случае общих йнфекций, а также могут успешно при.меняться для лечения нагноений и язв.

При фармакологических исследова- . ниях с применением более высоких доз установлено клеточное перерождение переднего желудка у крыс, так что применять эти биологически активные вещества необходимо с осторожностью.

При этом аристолохиевую кислоту выделяют из аристолохия-индика с выходом 0,37..

Кроме того, известен способ получения 1-карбокси-3,4-метилендиокси8-метоксифенантрена, который подав-, ляет имплантацию в дозе 60 мг/кг (у мыши) и абортивно в дозе 90 мг/кг (у кроликов). Об его иммуностимули- рующем действии неизвестно., Способ его получения является мно" гостадийным с использованием 6-бромпиперонилбромида и УФ-облучения.

В трехгорлую колбу емкостью 1 лэ снабженную капельной воронкой, внутренним термометром и трубкой с осушителем, помещают 120 r пиперонилового спирта в (EGA вЂ” Chemil или Aldrich} 240 мл уксусной кислоты и охлаждают на ледяной бане. К этому раствору при перемешивании медленно прикапывают 48 мл брома, растворен» ного в 120 мл уксусной кислоты, так, чтобы сохранялась температура 15о

25 С. Реакционную смесь оставляют стоять в течение ночи и выпавшие кристаллы отсасывают, промывают водой и перекристаллизуют из метанола.

T,ïë. 92 - 93 С. Выход 174 г (75Я .

Недостатком этого способа является низкий выход целевого продукта (2,27) и получение цис- и транс-изомеров в соотношении 1:1.

Целью изобретения является повышение выхода и расширение ассортимента целевых продуктов.

Цель достигается тем, что 6-бромпиперонилбромид подвергают взаимодействию в среде безводного б нзола, толуола .или ксилола при кипячении и полученную соль фосфония подвергают взаимодействию с о-метоксибензальдегидом в среде диметилформамида и мео тилата лития при нагревании (90 С), полученный соответствующий стильбен в виде смеси цис/транс-изомеров в соотношении 85/ 15 обрабатывают эфиром, причем транс-изомер переходит в раст вор, а оставшийся осадок цис-изомера, где R ) вЂ” метоксигруппа, отфильтровы» вают и при помощи УФ-облучения в среде смеси абсолютного 1,2,3,4-тетрагидро-9-флуфенона.и абсолютного цикйогексана в присутствии йода переводят в соответствующее производное фенантрена с последующей обработкой его циаиндом меди при кипячении в среде ди3О метилформамида, полученный соответствующий нитрил переводят щелочным гид ролизом в кислоту формулы I где R â€” метоксигруппа, и в случае необходимости разложением, эфира пиридингидрохлоридом переводят в соединение формулы I, где К -. гидроксигруппа.

Пример 1. Получение 1-карбокси-3,4-метилендиокси-2 -метоксистильбена. а) Получение 6-бромпипероцитфт мида.

1731053

5 б) Получение соли трифенилфосфония.

В обычную колбу емкостью 3 л, снабженную обратным холодильником и мешалкой KRG, помещают 294 r 6-бромпиперонилбромида и 262 г трифенилфосфина и при помешивании растворяют в абсолютном толуоле. Реакционную смесь нагреэают при перемешивании в течение 2 ч и при .комнатной температуре перемешивают в течение 24 ч. Образовавшуюся соль трифенилфосфония фильтруют на нуче, промывают небольшим количеством толуола и сушат в эксикаторе.

Выход 500 г (95 ). в) Получение производного стильбена, Методика проведения реакции.

Разрезанный на маленькие кусочки литий (0,98 r, 0,14 r-атома) добавляют в предварительно помещенный в атмосферу азота абсолютный метанол (30 мл). По окончании реакции в течение 2,5 ч этот раствор прикапывают к перемешиваемому при 90 С раствору соли трифенилфосфония (76,96 г, 0,14 моль) с о-анисовым альдегидом (17,68 г, 0,13 моль), растворенным в абсолютном диметилформамиде (200 мл). Реакционнй раствор перемео шивают при 90 С следующий час. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь выливают в воду (700 мл) и осадок отфильтровывают и высушивают.

Высушенный продукт экстрагируют в аппарате Сокслета с помощью петролейного эфира (30 - 50 C) до тех пор, пока более не будет содержаться стильбен в осадке в средней части аппарата Сокслета (в гильзе ТСХ; силикагель; СН С1 ). Петролейный эФир удаляют под вакуумом и остаток (64,82 r смеси) перекристаллизуют из этанола (таким образом отделяется большая часть примесей, непрореагировавшего продукта). Выпавший осадок (31 ° 13 r) суспендируют в эфире (300 мл) и кипятят 2 ч (разделение цис- и трас-смеси) . После охлаждения твердое вещество отфильтровывают и высушивают.

Выход 23,87 r (52 ) чистого цис. соединения .- испытано по ТСХ, ЯМР.

Т.пл. 112 С.

Повторная экстракция эфиром делает возможным количественное вьделение

6 образованного цис-изомера, т.е. 85 в расчете на соединение стильбена. г) Получение 1-циано-3,4-метилен/ диокси-2 -метокси-стильбена, Смесь из предварительно высушенного стильбенбромида (Зг), цианида меди (II) и диметилформамида в течение

8 вЂ” 12 ч кипятят с обратным холодильником, пока более не будет обнаруживаться по тонкослойной хроматографии никакой бромид (дихлорметан вЂ” петролейный эфир 1:2, TCX). После охлаждения реакционную смесь вносят в раствор хлорида железа Ш .(4 г), НС1 (1 мл) и воды (100 мл) и реакционную смесь вьдерживают при 70 С в течение

20 мин (отвод:вьделение HCN!). Затем охлажденную реакционную смесь экстрагируют хлороформом (5г 40 мл), промы.вают водой (2420 мл) и сушат.над хлоридом кальция. После удаления растворителя остаток перекристаллизуют из этанола. Выход 2,0 г (707). д) Гидролиз нитрила до целевого продукта.

Нитрил стильбеновой кислоты (I г) растворяют при нагревании по возможности в небольшом количестве этанола (30 вЂ” 50 мл) и смешивают с раствором гидроксида натрия (10 r в 15 мл Н О).

Реакционную смесь интенсивно кипятят с обратным холодильником до тех пор, пока по ТСХ (эфир) не будет обнаруживаться более никакого цианида (1835 20 ч). Этанол удаляют в вакууме и к остатку добавляют воду (50 - 100 мл). . Водную фазу экстрагируют эфиром (2х30 мл) и нейтрализуют 6 н НС1.. Вы40 павший хлопьевидный осадок остается чаще всего в виде коллоида в растворе. Раствор кратковременно нагревают и оставляют стоять в течение 24 ч.

Скоагулировавшийся осадок отсасывают на нуче и перекристаллизуют из этанола.

Выход, 0,53 г (50 ), Пример 2. Получение 1-карбокси-3,4-метилендиокси-2 -метоксистильбена путем. превращения стильбенбромида в стильбеновую кислоту.

Реагенты: стильбенбромид согласно формуле, 17,44 r (0,05 моль); нбутиллитий (1,55 М) 40 мл (0,061 моль); эфир 180 мп.

17,44 r (0,05 моль) стильбенбромида растворяют в абсолютном эфире и охлаждают в атмосфере азота до вЂ” 72 С.

В этот момент реакционный раствор ос1731053 торожно вводят 1,55 M 40 мм (0,061 моль) H-Buli и после добавки в течение часа нагревают до комнатной ,температуры. В раствор затем тотчас вносят твердый СО и оставляют реагировать .в течение ночи. После добавки оды и разделения фаз водную фазу кстрагируют эфиром (2х 100 мл). Объеиненные водные фазы охлаждают на ледяной бане и подкисляют концентрированной НС1. Выпавший осадок отсасывают на нуче и промывают водой до нейтральной реакции.

После кипячения 2 вЂ” 3 раза с водой (для удаления масляной кислоты, которая образовалась из н-бутиллития) сырой продукт перекристаллизуют из смеси этанола с водой.

Выход: 9,16 r (58,7 ). Т.пл.

199,5 С.

Соответствующий стильбенбромид можно получить согласно примеру 1, стадии а вЂ” в.

П р .и м е р 3. Получение 1-карбокси-3,4-метилендиокси-8-метокси-фенантрена. а) Фотохимическое превращение производного стильбена в соответствующее производное фенантрена.

Цис-стильбенбромид (3,3 r,, 0,01 моль) растворяют в абсолютном

1,2,3,4-тетрагидро-9-флуореноне (100 мл). Этот раствор разбавляют абсолютным циклогексаном (1 200 мл) и смешивают с иодом (1,7 r). Раствор при подводе азота освещают в течение

12 вЂ” 14 дней с помощью лабораторной погружной лампы с охладительной трубкой типа TQ 150 (Hanau). Реакция контролируется с помощью ТСХ СН С1 /петролейный эфир с пределами кипения

30 вЂ” 50 С, 1:2), Органическую фазу встряхивают с водным раствором тиосульфата (3x300 мл), чтобы удалить избыточный йод. После высушивания над

М@804 органическую фазу помещают в ротационный испаритель для удаления растворителя. Сырой продукт перекристаллизуют из петролейного эфира при

60 вЂ” 90 С.

Выход 1,55 r (47 от теории). б) Получение 1-циано-3,4-метилендиокси-8-метокси-фенантрена из фенантренбромида.

Смесь из предварительно высушенно. го фенантренбромида (3 r), цианида меди (ХХ) (4 r) и диметилформамида (30 мл) кипятят с обратным холодильником в течение 8-12 ч до тех пор, пока с помощью ТСХ (дихлорметанпетролейный эфир, 1:2) не будет более обнаруживаться никакого бромида. IIdcле охлаждения реакционную смесь выйивают в раствор хлорида железа (III). (4 r), HCl (1 мл) и воды (10 мл) и реакционную смесь выдерживают при

1О 70 С в течение 20 мин (отвод:выделение HCN). После этого охлажденную реакционную смесь экстрагируют хлороформом (5х40 мл), промывают водой (2 20 мл) и сушат над хлоридом кальция. После удаления растворителя остаток перекристаллизуют из этанола.

Выход 2,0 r (70 ). Т.пл. 215 С. в) Гидролиз. нитрила фенантреновой кислоты до фенантреновой кислоты.

2О Нитрил фенантреновой кислоты (1 r) растворяют при нагревании в небольшом количестве этанола (30 - 50 мл) и смешивают с раствором гидроксида натрия (10 г в 15 мл H О). Реакционную смесь сильно кипятят с обратным холодильником до тех пор, пока с помощью

ТСХ (эфир) не будет более обнаруживаться никакого цианида (18 - 20 ч).

Этанол удаляют в вакууме и к остатку

3р добавляют воду (50 вЂ” 100 мл). Водную фазу экстрагируют эфиром (2x30 мл) и нейтрализуют 6н HCl Выпавший хлопъевидный осадок чаще всего остается в виде коллоида в растворе. Раствор кратковременно нагревают и оставляют стоять в течение 24 ч. Скоагулировавший осадок отсасывают на нуче и перекристаллизуют из этанола.

Выход: 0,53 r (50 ).

Пример 4. Получение 1;карбокси-3,4-метилендиокси-8-окси-фенантрена. о

На масляной бане при 170 С расплавляют 1,0 г 1-карбокси-3,4-метилендиок45 си-8-метоксифенантрена вместе с

2,0 r пиридингидрохлорида и выдерживают при этой температуре в течение

1 ч в атмосфере азота, После охлажДе-. ния застывшую массу растворяют в 10 л

5 -ной НС1 и экстрагируют 3х10 л хлороформом. Экстракты объединяют,. промывают водой до нейтральной реакции и фильтруют для высушивания через силанизированную фильтровальную бумагу (ВАТМАН 1 PS). После испарения

5 о растворителя при 30 С на ротационном испарителе смесь из исходного материала и гидролизата этерифицируют до сложного эфира для разделения тем, I

9 1731053 10 что кипятят с обратным холодильником В качестве аналога по структуре и вместе со смесью из 2,5 л метанола действию известна Aristoluchia кисло,1 л концентрированной Н ЯО4 в 1е- та. Однако оказалось, что она проду чение 3 ч. Затем выливают в 10 л во- цирует папилломы при топическом приды и водно-метанольную фазу встряхи5 менении с кротоновым маслом. вают 3 раза по 10 л с диизопропило- В противоположность этому соединевым эфиром. Органический растворитель после того, как он многократно был Соединения I исследовали гистологипромыт водой, экстрагируют 10 л ЯаОЦ 10 чески в отношении активации макрофапричем сложный метиловый эфир.8-ме- гов. В качестве параметра рассматритокси-соединения остается в органи- вали стимуляцию моноцитов и макрофаческом слое, а 8-окси-соединение при»» бРюшной >o «T@ мь шеи. одновременном гидролизе сложного эфи- Для представления повышенного хера переходит в водную фазу. После мотактического внедрения моноцитов в ! промывки свежим диизопропиловым эфи- брюшную полость и дифференцирования ром щелочную фазу подкисляют и встря- моноцитов до макрофагов с повышенной хивают многократно с хлороформом, с .у- способностью к фагоцитозу .целесообшат через бумагу для разделения фаз разно интраперитонеально вводить тестBATNAH 1 PS и растворитель удаляют на ротационном испарителе. 1-Карбокси- Стимуляция вЂ” это процесс, который

3,4-метилендиокси-8-оксифенантрен ос- требует определенного времени. Испытается в виде однородного по тонко- тание фагоцитозной активности поэтому слойной хроматографии соединения в осуществлялось как обычная фармаколотвердой форме. гическая модель после предварительной д флуоресценция ° СН ОН ° ij нм/ обработки в течение трех дней мышей с

/: возбуждение: 261, 302,318 "329,358, помощью предлагаемых соеРННеННА

377 эмиссия: 386,402. нескольких тест-группах непосредстВыход: 0,714 r (757.) . венно после дачи вещества извлекали

Пример 5. Получение натриевой интраперитонеальную популяцию клеток, соли соединения примера 2. чтобы показать, что наблюдаемая сти10 ммоль соединения примера 2 раст- муляция наступает лишь спустя некотоворяют в малом количестве этанола и рое время инкубации. добавляют эквивалентное количество Вещества и материалы. гидроксида натрия, растворенного в Испытуемые вещества растворяли в этаноле. При этом осаждается нужная 35 воде 0,5 мг/мл и по потребности разнатриевая соль. Для того тобы допол- бавляли нить осаждение, добавляют еще немно- NH C1-Трис-буфер: %4С1 8,3 г/л; го эфира. Осадившуюся соль отсасывают трис(TPHc-(оксиметил)аминометан) и промывают небольшим количеством сме- 4 119 r/200 мл РН 7 65 смесь 1 час40

Ф си этанола с эфиром. При этом продукт Трис + 9 частей МН С1 РН устанавлиф Э . выделяется в чистой форме. вается Равным 7,2 с помощью 2н НС1, Выход 787.. Т.пл. 260 С. PBS/BSA вЂ” сыворотка фосфатного буСоединения формулы I служат для фера (альбумин сыворотки крупного розащиты от инфекции. Так, они способст- raтого скота): 40,0 r NaC1 1 О г КС1

I5 вуют значительному активированию фа- 7 2 r Na

Ф А-9647) на 100 мл PBS. средства также применимы тогда, когДМЕМ вЂ” Dulbecco s.модифицированная. да имеется депрессия фагоцитоза, на 0 Еа 1

Eagle c L вЂ” глутамином без фенолового пример после применения кортикостероов йли тостатических средств. Бйа- 57. FCS соответственно + 57. РСБ + 0 22 гепарина. годаря применению предлагаемых средств снова нормализуется депрессия фагоциFCS вЂ” зародышевая теля д телячья сыворот

55 xa (Gibco, Каталог, Ф 011-6290).

May"- Criinwald-раствор вЂ” модифиКроме того, найдено антивирусное цирован (Nerck, Арт.1424 ф р о ) o действие этих соединений.

Баранья кровь N - 5, 30, 08, 84, MPI, Фрайбург.

1731053

Антисыворотка к бараньим эритроцитам кроликов -308, IKA 468/6 - 11 дней; 18.07.78, MPI, Фрайбург.

Подопытные животные.

Исследования проводили с самками гибридных мышей в возрасте 18 недель (BaIb) схС57В16/Fi. До начала эксперимента в течение 5 дней животных приспосабливали к лабораторным условиям. Они получали таблетированный стандартный корм для крыс и мышей (А16romin, ¹ 1324) и водопроводную воду ad libitum. Их испытывали с помощью тиогликолятного стандарта на три стимулируемости макрофагов, при этом они показали хорошие положительные реакции.

Доза и введение.

Вещества вводили в водном растворе (0,5 мг/мл) в следующих дозах интраперитонеально: 20; 500; 5 мг/кг.

Разбавление маточного раствора, мкг/мл, перед введением различных доз составляло в случае:

20 мкг/кг 1 мкг/мл

-500 мкг/кг 25 мкг/мл

5 мг/кг 250 мкг/мл

Из этого, смотря по обстоятельствам, 0,4 мл.

Схема введения. Первая группа (5 мышей).

Предварительная обработка; 3 вйедения в 3 последовательных дня; на

4-й день получение макрофагов; одно введение непосредственно до получения макрофагов.

Получение клеточной суспензии макрофагов и фагоцитов.

Принцип теста.

После введения иммунологически активирующих веществ в подопытных животных стимулируются макрофаги и йобуждают моноциты к дифференцированию . в макрофаги. Продифференцированные, стимулированные макрофаги также после выделения способны in vitro @aroWiaровать опсонированные с соответствующими антителами структуры антигенов, в данном случае бараньи эритроциты.

Фагоцитированные эритроциты распбзнаются микроскопически.

Проведение опыта.

После соответствующей предваритель ной обработки мышей умерщвляют путем . перелома шейного позвонка. Брюшину вскрывают и интраперитонеально вводят

4 мл ДМЕМ (57 зародышевой телячьей сывоРотки, 0,2% тепарииа). Спустя при

12 мерно 30 с массажа отбирают шприцом

3 мл клеточной суспензии и вносят в полипропиленовые трубочки, находящйе-

5 ся в охлаждающей бане (О С). Из каж- дой тест-группы берут одну мышь для определения концентрации клеток в экссудате; установлена концентрация около 4х10 клеток/мл.

Выделение приросших макрофагов.

Макрофаги и моноциты отбирают из изолированной популяции клеток благодаря тому, что их инкубируют на покровных стеклах; макрофаги и моноциты при этом прирастают, другие клетки нет. В чашки с тканевыми культурами с 24-мя лунками (чашечками) (полистирол, фирма Costar) помещают круглые покровные стекла и покрывают

2О 0,25 мл ДМЕМ (с 57. зародышевой Телячьей сыворотки). Для равномерного распределения .клеток чашки помещают на вибрационную машину и в каждую смесь при встряхивании (5 мин, при25 мерно 200 об/мин) пипеткой вносят

0,25 мл клеточной суспензии. Затем чашки с тканевыми культурами инкубируют в течение 1 ч при. 37 С и 8Х СО в инкубаторе. После инкубации отсасы. вают неприросшие клетки, после чего . промывают дважды с помощью 0,25 мл

ДМЕМ (плюс 57 зародышевой телячьей сыворотки).

Опсонирование бараньих эритроцитов. мл бараньей крови промывают дважды с помощью 4 мл PBS/BSA (цейтрифугирование 10 мин, примерно при

500 g), Промытую кровь разбавляют в соотношении 1:50 с помощью РВ$/BSA.

Антисыворотка против бараньих эритроцитов разбавляется с помощью PBS/BSA в соотношении 1:200. Разбавленную баранью кровь и разбавленную антисыворотку объединяют в соотношении 1:1 и инкубируют в течение 1,5 ч при осторожном встряхивании (примерно 80 об/

/мин).

Фагоцитоз.

В каждую лунку чашек с. тканевыми культурами с приросшими макрофагами на покровных стеклах пипеткой вносят

0,5 мл опсонированной суспенэии эрйтроцитов. Чашки инкубируют в течение

20 мин при 37 С и 8X COq. Затем йзо быточные эритроциты отсасывают и пбкровные стекла промывают дважды с помощью ДМЕМ (0,5X PCS).

173 l 053

Класс

Эритроциты/макрофаги

1 0

2 1

3 2

4 3

5 4

6 5

7 6

8 7

9 8

10 9

11 10

12 1 1-20

Для лизиса нефагоцитированные ! эритроциты обрабатывают 1 мл NH C1трис-буфера (время воздействия

3,75 мин). После отсасывания буфера покровные стекла промывают дважды с помощью PBS/BSA.

Определение фагоцитоза (способы окраски).

После фагоцитоза макрофаги после lp помещения на картон окрашивают согласно комбинированному способу МаувЂ”

Grunwald вЂ” Giemsa. Окрашивание осу ществляется в лунках чашек с тканевьгми культурами. Процесс осуществляют следующим образом: 5 мин Мау вЂ” Grunwald конц., отсасывают; 3 мин Н О бидистиллированная, с помощью 857.-ной

Н Р04 устанавливают рН 7,0, отсасьвают; 9 мин Giemsa añòâîð, разбав- 20 ляют 1:40 и перед употреблением фильтруют, отсасывают; с помощью дистиллированной воды из промывалки дополнительно промывают.

Ядра клеток после окрашивания крас- 25 новато-фиолетовые, цитоплазма светЛо.синяя. Фагоцитированные эритроциты распозйаются по бледно-розовому окраС шиванию. После высушивания на воздухе препараты для изучения под микро- 30 скопом прочно приклеивают с помощью

"Eukict" на предметные стекла (3 препарата на мышь).

Микроскопическая оценка, Из трех препаратов для микроскопа на одну мышь подсчитывают два. ИспоЛь35 зуют микроскоп фирмы "Цейсс" при 1000кратном увеличении и масляной иммерсии, Третий препарат привлекают для исследований тогда, когда результат из двух препаратов неясен. На препарат насчитывают 300 клеток и, в за-. висимости от активности фагоцитоза, подразделяют на классы с увеличиваю щимся числом эритроциты/макрофаги.

Для расчетов предполагают, что при соотношении эритроциты/макрофаги более

11 распределение в классе 12 показывает центр тяжести у соотношения эритроциты/макрофаги около 12. Макрофаги

12-ro класса относительно редки.

Обработка данных и графические представления.

Посдсчет микроскопических препаратов осуществляется на расчетном устройстве WANG LVP 220О по специальной заданной программе, которая позволяет отдельно учитывать числовые классы.

Определение отдельных данных осуществляется с помощью программы "MAI" графические представления вЂ” с помощью программы "NPL".

Эффект стимуляции для каждого испытуемого вещества и каждой дозы представлен двумя видами: а) распределение макрофагов по классам в процентах (эритроциты/макрофаги) в расчете на 300 клеток в качестве 100Х. При этом в графическое изображение также входит число макрофагов, которые не фагоцитированы ника-. кими эритроцитами; б) распределение фагоцитированных эритроцитов (число NPH в классе х число эритроциты/макрофаги) по классам в процентах в расчете на общее число фагоцитированных эритроцитов в качестве 1003. При этом неучтенным остается число макрофагов, которые не фагоцитированы никакими эритройитами. . Параметр.

В качестве параметра стимуляции макрофагов рассматривается увеличение фагоцитозной активности, выражаемой как число фагоцитированных эритроцитов на макрофаг (класс). Стимуляция проявляется в уменьшении макрофагов, которые не фагоцитированы никакими эритроцитами или фагоцитированы нез начительным числом эритроцитов, и в увеличении макрофагов с несколькими эритроцитами.

Результаты.

Стимуляция макрофагов благодаря

1-карбокси-3, 4-метилендиокси- 8-метокси-фенантрену (интранеритонеально).

На фиг.1 (3x20 мкг/кг интрапери онеально) вЂ” стимуляция макрофагов спустя 3 дня (x+SEM), где а) распределение 300 клеток по классам l вЂ” 12,», б) распределение фагоцитированных эритроцитов по классам 1 - 12,7..

1731053

В табл.2 представлено распределение фагоцитированных эритроцитов по классам 1 - 12.

В табл.3:. Зх500 мгк/кг интрапери- 25 тонеально, стимуляция макрофагов спустя 3 дня (см. также фиг.2).

В табл.4 представлено распределение фагоцитированных эритроцитов по классам (см.фиг.2). 30

В табл.5: Зх5 мг/кг интраперитонеально, стимуляция макрофагов спустя

3 дня (см. фиг.3).

В табл.б представлено распределение эритроцитов по классам 1 вЂ” 12 в 7 (см.фиг.3).

На фиг.4 представлена зависимость суммы эритроцитов начиная с 4-ro класса и выше от дозы после интрапериФонеального введения 20; 500 и 5 мкг/кг.

Контроль составляет 45+6% (х SEM).

Область g SEM указана около среднего значения пунктирной линией.

В табл.7 представлена зависимость

45 от дозы стимуляции макрофагов после интранеритонеального введения, где х - доза; у вЂ” сумма фагоцитированных эритроцитов SEN вЂ” стандартное откйоЭ

50 некие.

Оценка.

Вещество вызывает увеличение акФивации макрофагов от 387. при 20 мкг/кг до 647 при 500 мкг/кг.,Дальнейшее по55 вышение дозы до 5 мг/кг приводит к незначнтельному ослаблению стимуляции., Активация макрофагов протекает в выбранной области доз нелинейно.

Зависимость от дозы эффекта стимуляции.

Контрольные группы после дачи интраперитонеально или перорально физиоло5 гического раствора NaC1 показывают, что интраперитонеальное введение само уже вызывает слабую активацию макроФагов. Большая доля макрофагов фаго1 цитирует два эритроцита. t0

Повышение доли макрофагов с более чем двумя эритроцитами нужно интерпретировать как эффект вещества. Сумма в процентах эритроцитов начиная с 4-ro класса (макрофаги с тремя эритроцитами и более) поэтому связывается с дозой.

B табл. 1: Зх20 мкг/кг интрапериФо" ненально, стимуляция макрофагов спустя 3 дня 20

Тест-группа, которой непосредственно перед получением макрофагов ввоДили интраперитонеально однократно вещество, показывает, что наблюдаемые эффекты наступают только спустя некоторое время инкубации. Этот факт указывает также на то, чтэ вещество in

vitro индуцирует ответственный за йо- . вышение фагоцитоза механизм в макРофагах.

Это указывает на следующие эффекты: стимуляция скорости интернационалиэа-. ции мембран, увеличение плотности Fcрецепторов и/или повышение мобильнбсти СЗЬ-рецепторов.

Другие соединения формулы I по*азывают сравнимое фармакологическое действие. Действие может быть подтверждено другими фармакологическими моделями и клинически.

Данный способ позволяет расширить ассортимент получаемых продуктов, а также выход целевого продукта с 2,27. (по прототипу) до 6,37. за счет того, что обычно при реакции Виттига образуется цис-транс-смесь олефинового соединения в отношении 1:1, поэтому можно ожидать, что будет получаться около 507 цис-соединения формулы и, 507 соответствующего транс-соединения. Однако оказалось, что при специальной технологии получают цисстильбен формулы V до 857 и трансстильбен только до 157 (см. пример 1)

В данном случае для выхода соеДинений фенантрена существенное знайение имеет то, в каких количествах получают соединение цис-стильбена, так как только цис-соединение может превращаться в соответствующее производное фенантрена. Соединение трансстильбена не может подвергаться изомеризации фотохимическим путем, как это обычно бывает для соединений фенантрена, в соответствующее цис-cbeдинение. Фотолиз транс-соединения приводит к его разложению с образованием многочисленных побочных продуктов.

Поэтому понятно, что для фотолиза в соединение фенантрена применяют только чистое соединение цис-стильбена.

Это возможно в результате обработки простым эфиром, причем цис-соединение остается нерастворимым и отфильтровывается. При этом общий выход соединений фенантрена значительно повышается, если, как в настоящем случае, количество соединения цис-стнльбена зна-с

1731053

00Н

О где R (вЂ” метокси или гидроксигруппа, или их фармацевтически совместимых солей с использованием 6-бромпипеРонилбромида и УФ-облучения, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью по вышения выхода и расширения ассортимента целевых продуктов, 6-бромпипефонилбромид формулы II

25 (0 - ВТ !

О СН В (Ж) сН Р(РЫ>Br

R7 где Rg вЂ” метоксигруппа, щелочным гидролизом переводят в кислоту общей формулы I где R вЂ” метоксигруппа, и, в случае необходимости, 45 разложением эфира пиридингидрохлоридом переводят в соединение общей фбрмулы I, где R) вЂ” гидроксигруппа, и выделяют в свободном виде или в виде фармацевтически совместимой соли.

50 чительно выше, чем количество транссоединения.

Ф о р м у л а .и з о б р е т е н и я

Способ .получения производных меФилендиоксифенантрена формулы I .,Ф подвергают взаимодействию в среде безводного бензола, толуола или ксилола при кипячении, полученную соль фосфония формулы ТТТ подвергают взаимодействию с о-метоксибензальдегидом в среде диметилфбрмамида в присутствии метилата лития при нагревании, полученный стильбен в виде смеси цис/транс-изомеров в соотношении SS/15 обрабатывают эфи-. ром, причем транс-изомер переходит в раствор, а оставшийся осадок цис- изомера формулы общей IV

Ф где R< - метоксигруппа, отфильтровывают и при помощи УФ-облучения в среде смеси абсолютного 1,2, 3,4-тетрагидро-9-флуоренона и абсолютного циклогексана В присутствии иОда переводят в производное фенантрена общей формулы V ..

1 где R< вЂ” метоксигруппа, с последующей обработкой его цианидом меди при кипячении в среде диметилформамида и полученный нитрил формулы VI

Т а б

17 1053 а 1 лиц

300 клеток по классам, SE ND

Распределение

1 Класс

Мышь 3 Мышь 4:х-я

Мышь 2

Мышь 1

71,750

16,250

7,250

2,917

1,167

О, 167

0,250

0,000

0,083

0,000 а 2

Таб лиц

I ение фагоцитированных эритроцитов по классам, Ж

SD ND

1 шь 2 Мышь 3 Мышь 4

SE х-я а 3

Табл и ц

300 клеток по классам, ение

Мышь 2

Мышь 4

Мышь 5

$Е

Мышь 3 х-я

1 1.00

2 2.00

3 3.00

4 4.00 5 s.nn

6 6.00

7 7.00

8 8.00

9 9,00

10 10.00

11 11,00

12 12,00

1 1.00

2 п0

3 3.00

4 4,00

5 5.00

6 6.00

7 7.00

8 8,00

9 9„00

10 10,00

11 11.00

12 12,00

1 1.00

2 2,00

3 3.00

4 4.00

5 5.00 б 6.00

7 7,00

8 8.00

9 9.00

1G iI0.0Î

11 1il ..ОО

12 12,00

75,67

12,67

6,83

2,17

0,67

1,33

0,17

0ю17 п,00

0,33

О,no

0 0

26,5

28,6

13,6

5 6

13,9

2,1

0,0

2,8

0,0

7,0

0,0

63,00

13,00

8,00

5,00

4,33

2,83

1,17

0,83

1,17

0,00

0,67

0,00

71,33

17,00

6,17

3,33

1,67

0,17

0,33

0,00

0,0

34,8

25,3

20,5

13,7

1,7

4,1

0,0

0,,0

52,83

19,67

11,83

6,00

3,83

2,83

1,33

0,50

0,67

0,17

0,33

0,00

66,50

20,00

8,67

3,50

1,17

0917

0,00

0 00 п,по п,00

0,0

37,5

32 5

19,7

8,8

1,6

0,0

52,83

20,50

13,33

5,83

3,00

1,33

0,83

0,50

0,17

0,33

0,17

72,17

15,50

7,67

2,50

1,17

0,17

0,50

0,17

0,00

0,17 0,00

0,0

31,2

3О 9

15в1

9,4

1,7

6,0

2,3

0,0

3,4

0,0

47,33

17,83

16,00

7,83

5,00

7,50

1,17

0,83

1,00

0,00

0,50

0,00

71,417 !

6,292

7,333

2,875

1,167

0,458

0,250

0,042

0,000

0,125

0 000

0,00

32,50

29,30

17,21

9,34

4,?2

3,06

0,59

0,70

0,00

2,58

0,00

51,33

15,67

12,17

8,67

5,50

2, 67.

2,17

0,50

0,67

0,00

0,50

0,17

3,777

3,056

1,080

0,644

0,408

0,583

0,215

0,083

0,000

О, 160

0,000

0,00 977

3,14

3,39

3,32

6,14

2,60

1,17

1,39

n,00 .3,33

0,00

53,667

17,333

12,267

6,667

4,333

2,433

1,333

0,633

0,733

0,100

0,433

О, 067

1,889

1,528

0,540

0,322

0,204

0,292

О, 108

0,042

0,000

0,080

0,000

0,00

2,38

1 57

1, 69.

1,66

3,07

1,30

0,59

0,70 п,оп

1,66

0,00

5,775

3, 053

2,893

1,523

0,979

0,630

0,500

0,183

0,384

О,149

0,190

0,091

0,00

33,01

29,72

17,39

9,07

1,69

3in9

0,00

1,68

0,00

2,583

1, 365

1,294

0,681

0,438

0,282

0,224

0,082

0,172

О;067

О, 085

О, 041

52, 833

17,833

12,167

6,000

4,333

2,667

1,167

0,500

0,667 . 0,000

0 500

0,000

22 блица 4

1731053

Т а

Распределение

1 фагоцитированных эритроцитов

Класс по классам, 7.

SE NB

Мышь 1

Мышь 2 Мышь 3

Мышь 4

Мышь 5 х-я

10 10. 00

11 11,00

12 12,00 ца 5

Т а б ли

300 клеток по классам, Ж

Класс

Распределение

Мышь 1 Мышь 2 Мышь 3 Мышь 4

Мышь 5 х-я

SE ца 6

Т а бли

Класс Распределение фагоцитированных эритроцитов

Мышь 1 Мышь 2 Мышь 3 Яышь 4 Мышь 5 х-я по классам, 7.

SD SE

0,00

0,0 0,00

26,2 16,88

26,4 21,32

18,9 16,37

14 2 13,92

9,8 10,76

1,2 5,18

0,0 2,43

1,6 4,07

1,8 2,20

0,0 1,88

0,0 5,00

14, 12

3,10

18,04

15,48

14,17

9,84

4, 27

2,39

1,01

1,27

1,46

1,75

2,22

5,23

1,77

1,58

3, 17(1,11

1,11

0,49

0,77

2,"46

10.00

11.00

12. 00

3,2

1,8

14,2

1 2

5 сб

1. 00

2.00

3.00

4,00

5.00

6.00

7,00

8.00

9,00

1.00

2,00

3,00

4.00

5.00

6,00

7,00

8.00

9.00

10,00

11,00

12.00

1.00 .

2.. 00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9,00

0,0

12,5

15,3

14,4

16,„6

13,6

6,7

5,6

8,9

0,0

6,4

0,0

69,33

9,83

8,00

4,83

2,83

2,00

0,67

О 67

0,33

0,17

0,67

О,ОО

10,5

17,1

15,5

12,1

10,7

4,3

5,00

5,7

0,0

17,5

21i0

16,0

13,6

12,6

7 ф 1

3,1

4,7

1,3

3,0

0,0

50 33

16,17

12,17

7,17

6 00

2,33

2,67

1,00

1,17

0,17

0,67 .

0,17

0,0

11,4

17,2

15,2

17,0

8,2

11,3

4,9

6,6

1 в 1

4,7

2,4

0,0

20 3

26,4

17,3

11,9

6,6

4,9

3,5

1,3

3,0

1,6

3,3

52,17

18,00

11,50

5,83

5,17

4,17

1,33

0,00

0,83

0,50

П,17

0,33

0,0

14,1

18,0

13,7

16,2

16,3

6,3

0,0

5,2

3,5

1,3

5,2

О,О

13 5

24,3

17,8

15,2

9,5

5,3

4,4

6,1

0,0

3,8

0,0

49,50

23,33

14,67

6,50

2,67

1,83

0,50

0,33

0,17

0,0

22,2

27,9

18,5

10ю 1

8,7

2,9

2,2

1,3

1,4

1,6

3,2

0,0

11,9

18,5

19,8

16,7

10, 1

9,9

2,7

4,1

0,0

3,8

2,5

56, 17

22,17

11,17

5 33

3,00

1,67

0,17

0,00

0,17

0,00

П,ОО

15, 13

21,11

17,06

14,80

10,48

6,79

3,85

5,03

0,86

3,72

1ю 17

55,500

17,900

11,500

5,933

3,933

2,400

1,067

0,400

0,600

0,267

0,233

0,267 п,0п

3,60

4,41

2,02

2,07

2,75

1,95

1э17

2,79

1,31

1,73

1,62

8,149

5,381

2,389

0,925

1,539

1,018

0,990

0,435

0,149

0,253

0,00

6,94

5,35

2,25

2,83

3,26

3,90

2,49

2,47

1,10

1,73

5,49

0,00

1,61

1,97

0,90

0 93

1,23

0,87

0,52

1 25

0 59

0,77

0,72

3,644

2,406

1,068

0,414

0,688

0,455

0,443

0, 194

О, 194

0,067

0,113

0,00

13, 54

21, 04

17,30

15 19

10, 14

6,71

3,46

4;74

0,00

3,80

0,00

52, 167

18,000

11,500

5,833

3,000

2,000

0,667

0,333

0,667

0,167

Таблица 7

1731053 х мкг/кг ф 70

SEM

1 20.0000 38,2000

2 500.0000 63,7600

3 5000.0000 61,8000

2,7800

3i3200

5,4200

1731053

0 д Р 4 Е Ю /О /Г

А мтерс

100 вп

2 4 Е 8 10 Ю O Z 4 a S m д2 бйдГЧ 00

1731053

Редактор М.Циткина

Заказ 1519 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государстве