Способ получения гибридного активатора плазминогена, содержащего область, ответственную за средство с фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного полипептида

Патент 1732814

Авторы

Классы МПК

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения нарушений или заболеваний сердечно-сосудистой системы. Целью изобретения является получение гибридного активатора плазминогена, содержащего область , ответственную за сродство с фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного полипептида. Способ заключается в том, что путем трансформации клеток бактерий Escherlchia cell рекомбинантными плазмидными ДНК рНАОЗ, или рНА13, или рНА23, или pHA24L, или рНА114, или рНА14Ц или рНАОО, или рНА20, или pHA21L, или pHAOTL, культивирования трансформированных клеток в питательной среде при 25-45°С, сбора клеток и их разрушения выделяют продукт. М и

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

В (21) 4028997/13 (22) 30.01.87 (31) 61-017734 (32) 31,01.86 (33) JP (46) 07.05.92. Бюл. N. 17 (71) Сагами Кемикал Рисерч Сент, Сентрал

Гласс Компани, Лимитед, Ходогая Кемикал

Ко., ЛТД, Ниппон Сода Компани, Лимитед;

Ниссан Кемикал Индастриз, Лимитед, Тоио

Сода Мануфакчуринг Ко., ЛТД(JP) (72) Митито Тагава, Масакацу Вада и Масаюки Ямада (JP) (53) 575.224.2 .577,2(G88,8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО

АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА, СОДЕРЖАЩЕГО ОБЛАСТЬ, ОТВЕТСТВЕННУЮ ЗА

СРОДСТВО С ФИБРИНОМ АКТИВАТОРА

ПЛАЗМИНОГЕНА ТКАНИ, И ОБЛАСТЬ, ОТВЕТСТВЕННУЮ ЗА ФЕРМЕНТНУЮ АК-Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения различных видов нарушений или заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Целью изобретения является получение гибридного активатора плаэминогена, содержащего область, ответственную за сродство с фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного полипептида.

Пример 1 (сравнительный). Изоляция поли (А)+РН К.

„„!Ж„„1732814 АЗ

ТИВНОСТЬ ПРОУРОКИНАЗНОГО ПОЛИПЕПТИДА (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения нарушений или заболеваний сердечно-сосудистой системы. Целью изобретения является получение гибридного активатора плаэминогена, содержащего область, ответственную за сродство с фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного полипептида.

Способ заключается в том, что путем трансформации клеток бактерий Escherlchla cc ll рекомбинантными плазмидными ДНК рНА03, или рНА13, или рНА23, или pHA24L, или рНА114, или pHA14L или рНАОО, или рНА20, или pHA21L, или pHAOTL, культивирования трансформированных клеток в питательной среде при 25-45 С, сбора клеток и их разрушения выделяют продукт, Клетки клеточной линии рака глотки че- ) ловека Det го!т 562 культивируют в модифицированной среды Eagle с 10";ь-ной сывороткой плода теленка, 0, 1 мМ неосновных аминокислот, 1 MM пирувата натрия и +

0,1 альбумина молочной кислоты ía пластиковой чашке в присутствии диоксида углерода при концентрации 5 . Среду от- () деляют и по 2 мл денатурирующего. раствора (6М тиоцианата гуанидина, 5 мМ цитрата натрия, 0,5 саркозина и 0,1М

2-меркаптозтанола) прибавляют в пластиковую чашку диаметром 9 см для денатурации клеточного материала с целью получения экстракта. Полученный экстракт

1732814 вносят в раствор 5,7М СэС! и центрифугируют, С 60 чашек выделяют 12 мг PHK. Затем

° поли (А)+ РНК очищают с помощью хроматографии на олиго-Т-целлюлозе и получают примерно 600 мкг PHK.

Пример 2 (сравнительный). Получение библиотеки к ДНК.

2 мкг векторного праймера и 3 мкг поли (А) РНК смешивают и инкубируют 12 ед. обратной транскриптаэы. Затем встраивают олиго dC, гидролизуют рестриктазой

HInd 111, отжигают и циклизуют. Реакционная смесь, полученная таким способом, хранится как библиотека кДНК при -20 С. Из реакционной смеси получают около 100000 трансформантов, используя фаг х 1776 Е. со1! в качестве компетентных клеток.

Пример 3 (сравнительный). Скриннинг.

Для изоляции клонов, которые содержат плазмиду, несущую ген, кодирующий активатор плазминогена-подобный белок

ДНК указанных трансформантов гибридизуют. В качестве зонда используют фрагменты синтетической ДНК следующей нуклеотидной последовательности:

Зонд!

5 3

AATCGGG CACGATTTCCTG, Зонд I I

5 3

G CCCCCG CACAGGAACCG

Эти последовательности комплементарны относительно частичных последовательностей к ДНК, кодирующей активатор плаэминогена меланомы, (Зонд 1: количество нуклеотидов 154 вЂ” 173; зонд II: количество нуклеотидов 1099-1116).

Фрагменты мечены 32Р вЂ” y вЂ” АТФ у

5 -конца. Меченные зонды гибридизируют на фильтре в гибридизационном буферном растворе, состоящем из 900 мМ NaCI, 90 мМ цитрата натрия, Denhart при 45 С втечение

20 ч с трансформантами Е, со!!, которые выращены на нитроцеллюлозном фильтре, денатурированы щелочью, Нитроцеллюлозный фильтр промывают в растворе 300 мМ

NaCI и 30 мМ цитрата натрия, накрывают рентгеновской пленкой для получения ауторадиограммы, и определяют клоны, положительные к гибридизации. При использовании смеси, состоящей из зондов I и П, из 5000 клонов выделяют 10 клонов, положительных к гибридизации, Среди укаэанных клонов, положительных к гибридизации, обоими зондами гибридизированы один клон фага х 1776 Е.соИ(рО/РАЗ). Из указанного клона получают плазмиду

pDPA3, х 1776 Е, co!I (pD/РАЗ). содержащий плазмиду pDPA3 сдан на хранение a F.R.!. 8 ноября 1984 г. под депозитарным номером

FERM вЂ” P вЂ” 7391.

Последовательность кДНК состоит из

2459 пар оснований, кроме поли (А)+-после5 довательности, находящейся у 3 -конца.

Среди указанных пар оснований, 1548 пар оснований кодируют .516 аминокислот. Эта область кодирования содержит дополнительно последовательность, кодирующую

10 активатор созревшего плазминогена (число нуклеотидов 261 вЂ” 1703). Имеется 5 -некодирующая область (нуклеотидное число 1155), находящаяся перед кодирующей областью, и 3 -некодирующая область (нук15 леотидное число 1704 вЂ” 2459), находящаяся за кодирующей областью.

Пример 4 (сравнительный). Получение

МРНК, 20 r клеток почечной ткани, заморожен20 ных при -80 С, раэмельчают в атмосфере жидкого азота, суспендируют в 80 мл.5М тиоцината гуанидина, 0,5,4 N-лауроилсаркозина натрия, 25мМ тартрата натрия, 0,1 M меркаптоэтанола и 0,1)(, антивспени25 вателя (раствор А). Сусг1ензию гомогенизируют и нуклеиновую кислоту отделяют инъекционной иглой типа 20G. 24 мл раствора распределяют на 12 мл 5,7 М CsCI, и после центрифугирования выделяют нео30 чищенную PНК.

Всю РНК растворяют в 2;4-ном растворе ацетата калия, прибавляют два объема зтанола, выдерживают в течение ночи при

-20 С и центрифугируют.

35 Поли (А) PHK выделяют и очищают хроматографией на колонке с олиго (dt)-целлюлозой. 10 г тканевых клеток почки дают около 3 мг всей РНК, от 2 до 3 которой представляет собой поли (А) P HK.

40 Пример 5 (сравнивательный), Конструирование библиотеки кДН К(1).

Синтез кДНК проводят с использованием 40 мкг поли (А) РНК, полученной в сравнительном примере 4.

45 При использовании в качестве праймера 40 мкг олиго (дТ) 12-18 для синтеза первой цепи проводят реакцию с 40 ед. обратной транскриптазы в течение 2 ч при

42 С. Матричную РНК удаляют с помощью

50 щелочи и проводят синтез второй цепи со

100 ед, фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 Е.со11.

После удаления шпилечной петли с помощью 81 нуклеаэы цепь (ДП)1о-го присое55 диняют к 3 -концу двухцепочечной кДНК с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и получают около 400 мг дЦ-концевой кДН К.

Эту ДНК сшивают с 800 мг ДНК вектора

pBR322 по сайту Pstl, трансформируют в

1732814

Е,соll XI 776. Таким образом получают библиотеку кДНК(1), состоящую из примерно

2х10 тетрациклинустойчивых и ампицил5 линчувствительных трансформантов, Пример 6(сравнительный). Получение 5 синтетических олигомеров ДНК для скрининга библиотеки кДНК.

Синтезируют фосфотриэфирным методом следующие 16 различных олигомеров

ДН К, состоящих из 14 нуклеотидов, компле- 10 ментарных иРНК, которая соответствует аминокислотной последовательности человеческой урокиназы (УК)

AACCAAGGTTGATT, AACCAAGGTTGGTT, . 15

AACCAGGGTTGATT, ААССАСООТТОАТТ;

AACCACGGTTGGTT, AACCATGGATTGATT, AACCATGGTTGGTT, AACCAAGGCTGATT, AACCAAGGCTGGTT, AACCAGGGCTGATT, AACCAGGGCTGGTT, ААССАОООСТОАТТ, 25

AACCACGGCTGGTT, ААСCATGG CTGATT;

ААСCATGGCTGATT, AACCAGGCTTGGTT, Эти 16 олигомеров далее обозначают. 30 как УК зонд I.

Для использования в качестве проверочных зондов таким же образом синтезируют следующие 8 различных олигомеров

ДНК, состоящих из 14 нуклеотидов, компле- 35 ментарных к иРНК, которая соответствует

МеР, Try, Asn, Asp, Pro

5 GGATCATTATACAT 3

GGATCGTTATACAT, 66АТСОТТОТАСАТ, 40

GGATCATTGTACAT, GGGTCATTATACAT, GGGTCGTTATACAT, GGGTCGTTGTACAT, GGGTCATTGTACAT. 45

Эти 8 олигомеров обозначают как УК зон д И.

Для получения зондов, применяемых для гибридизации колоний, в УК зонды 1 и II в 5 -конец введена радиоактивная метка. 50

Пример 7(сравнительный). Скрининг библиотеки кДН К(1).

1, Скрининг.

Автоклавированный нитроцеллюлозный фильтр помещают на LB-агаровую сре- 55 ду, содержащую 15 мкг/мл тетрациклина, среду инокулируют трансформантами, приготовленными в сравнительном примере 5 так, чтобы обеспечить рост примерно 2000 колоний трансформантов, После 8 ч инкубации при 37ОС колонии реплицируют на два нитроцеллюлозных фильтра, которые инкубируют еще 3 ч при 37 С. Исходный нитроцеллюлоэный фильтр используют как эталонный, а два вторичных фильтра переносят на 1В-агаровую среду, содержащую

15 мкг/мл тетрациклина и 100 мг/мл хлорамфеникола, инкубируют в течение ночи при 37 С, затем помещают над 0,5М NaOH и 1,5 м NaCI на 3 мин, чтобы вызвать лизис колоний и денатурацию ДНК, и после нейтрализации над 0 5 M трис-НС1, рН 7,6 и 1,5

М NaCI высушивают на воздухе в течение 2 ч при 80ОС.

После промывания фил ьтров в 4xSSC в течение 30 мин при 60 С проводят прегибридизацию в 4xSSC, 10 х Denhardt u

50 мкгlмл денатурированной ДНК Е,со11, в течение 1 ч при 60 С, После добавления 0,1 мМ АТФ и УК зонда I с радиоактивной меткой проводят гибридизацию в течение 16 ч при 37 С, промывают 6 вЂ” 8 раз в 4xSSC при

39 С фильтры, сушат на воздухе и подвергают скринингу на трансформанты, гибридизирующиеся с УК зондом 1, получают 21 клон-кандидат иэ 8х10 колоний. Плазмиды

Д этих клонов далее обозначают как плазмиды рКУ01 вЂ” PKYU21.

Полученные 21 клон-кандидат обрабатывают аналс11.ично описанному и получают клоны, гибридизирующиеся с УК зондом Il.

Плазмиды в этих клонах далее обозначаются как плазмиды pKYU и 21.

2. Характеристики ДНК плазмиды рКУО 21, После расщепления ДНК плазмиды

pKYU21 различными эндонуклеазами рестрикации и субклонирования их в M13mp8 проводят определение нуклеотидной последовательности. При сопоставлении этой последовательности с хорошо известной аминокислотной последовательностью УК подтверждают, что, хотя кДНК содержит полную область кодирования низкомолекулярной УК, но отсутствует около 100 п.о.

ДНК в 5 -конце области кодирования высокомолекулярной УК.

Il р и м е р 8 (сравнительный). Конструирование библиотеки кДНК.

На основе нуклеотидной последовательности, определенной в п.2 примера 7, синтезируют фосфотриэфирным методом следующий олигомер ДНК:

5 СТСААСАССАТСАСА 3, состоящий из 15 нуклеотидов, комплементарных последовательности иРНК, которая соответствует Sar, Asp, Ala, Leu, Glu

1732814

Используя 100 мкг поли(А) PHK в качестве матрицы, синтезируют первую цепь . кДНК с помощью 100 ед, обратной транскриптазы вместе с 1 мкг 5 - р-меченым

32 праймером с последующим синтезом второй цепи с помощью фрагмента Кленова

ДНК-полимеразы с 1 Е.coll. Однонитевую

ДНК расщепляют $1 нуклеазой и дЦ-цепь добавляют к 3 -концу, используя терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу. После совместной ренатурации этой дЦ-хвостовой вставки и дГ-хвостового вектора рВ й-322 трансформируют E.coll х 1776, получая библиотеку кДHK(ll), состоящую

° примерно из 5х10 трансформантов.

Пример 9 (сравнительный), Скрининг библиотеки кДНК(И).

Трансформанты, полученные в примере . 8, подвергают гибридизации по методике, описанной в п.1 примера 7, В данном случае в качестве зонда используют фрагмент расщепления 150 п.о. Pst I-Bgl ll 5, из pKYU 21 с радиоактивной меткой, введенной методом трансляции, Гибридизацию проводят при 60 С.

Фильтр. сушат на воздухе после промывания два или три раза 2xSSC при 60 С и клоны, гибридизирующиеся с указанным зондом, обнаруживают с помощью авторадиографии, Получают восемь положительных клонов. Плазмиды в этих клонах далее обозначают как плазмиды pPEt вЂ” рРЕ8. При расщеплении ДНК этих плазмид рестриктазой Pstl подтверждают, что плазмида рРЕЗ содержит вставку кДНК длиной приблизительно в 420 п.о.

Фрагменты, полученные расщеплением

ДНК плазмиды рРЕ3 эндонуклеазной рестрикции Pstl, субклонируют в М13 pm8 и проводят определение последовательности оснований. Результаты подтверждают, что кДН К содержит не только кодирующую область достаточной длины на 5 -концевой стороне гена проуроклиназы, но также 5 -нетранслируемую область длиной

66 п.о, вверх от кодона инициации трансляции ATG.

Пример 10 (сравнительный). Конструирование гена проурокиназы, 5 мкг ДНК плазмиды pKYU 21, содержащей полную область кодирования урокиназы, расщепляют эндонуклеазами рестрикции Bgl II u Hind ill (по 10 ед.) и выделяют фрагменты ДНК около 5,7 т.п.о.

При расщеплении ДНК указанной плазмиды pKYU 21 рестриктазами Bgl И и.Nco! (10 ед) получают фрагмент ДНК в 66 п.о. 5 мкг ДНК плазмиды рРЕРЗ, полученной в примере 6, расщепляют 10 ед. рестриктаэ

Nco и Hind III, получая фрагмент ДНК около 1,1 т.п.о. Эти три различные фрагмента ДНК повторно экстрагируют смесью фенол/хлороформ, осаждают 2 об, этанола для очистки и извлечения ДНК, Эти фрагменты

5 ДНК сливают вместе с помощью Т4 ДНКлигазы и трансформируют в Е.coll х 1776.

Образующиеся трансформанты подвергают скринингу методом быстрой изоляции, используя процедуру щелочного лизиса, и

10 получают клон, несущий плазмиду pKYU 22, которая содержит полный ген проурокиназы.

Пример 11 (сравнительный). Определение нуклеотидной последовательности

15 сайта вставки плазмиды pKYU 22.

Нуклеотидную последовательность сайта вставки плазмиды pKYU 22 определяют методом Максама-Гилберта и методом обрыва дидезокси-цепи перед субклонирова20 нием в M13mp8, Вставка состоит из 5 -некодирующего области 66 п,о., главной последовательности ATG(Met) вЂ” 66С (Ciy), области кодирования проурокиназы AGC (Ser) вЂ” СТС (Leu), 25 кодона окончания трансляции ТСА (XXX) и

3 -нетранслируемого кодона за стоп-кодоном, Пример 12 (сравнительный). Синтез гена проурокиназы, модулированного в

30 5 -концевой области.

Кодоны 5 -терминальной области нативной кДНК, кодирующей проурокиназу, замещают так, чтобы обеспечить эффективную экспрессию гена проурокиназы в Е,coli

35 за SD последовательностью гена С230, полученного из Pceudomonas putide, кодон начала трансляции ATG(Met) встраивают перед кодоном первой аминокислоты (Ser) так, 4lо проурокиназа может прямо экс40 прессироваться; и сайт Aat II распознавания энзима рестрикции соединяется с кодирующей областью рядом с SD последовательностью вектора экспрессии. Для этого двунитевой олигомер ДНК синтезируют

45 фосфотриэфирным методом. Эта двухнитевая синтетическая ДНК имеет на одном конце сайт Aat II для| введения его в вектор и на другом конце сайт Tag I для присоединения его к гену проурокиназы.

50 Фосфотриэфирным методом синтезируют следующие однонитевые олигомеры

ДНК, содержащие соответственно 29,15 и

20 нуклеотидов:

5 CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCGT 3

55 3 TGCAGTACTCGTTGC 5, 3 TCGAGGTCCTCCAAGGCAGC 5

1 мкг каждого из синтетических олигомеров ДНК нагревают в течение 2 мин при

95ОС, фосфорилируют íà 5 -конце с помощью Т4 полинуклеотидкиназы и очища1732814

Aatli SstI Bstl Tagl

F Е R M-P-8040

55 ют. После сушки очищенный материал растворяют в 50 мкл 20 мМ трис-НС!, рН 7,6 и

10 мМ MgClp, ренатурируют путем нагревания в течение 2 мин при 95 С, охлаждают медленно до комнатной температуры и выдерживают раствор в течение ночи при

12 С, получая следующую двунитевую ДНК

5 CATGAGCAACGACCTCCACCAGGTTCCGT 3, 3 TGCAGTACTCGTTGCTCGAGGTGGTCCAAGGCAGC, 5 мкг ДНК плазмиды pKYU22 расщепляют эндонуклеазами рестрикции Bg ill и Aatl I, фрагмент ДНК размером 5,7 т.п.о. Другие 5 мкгДНКтой же плазмиды pKYU22 расщепляют эндонуклеазами рестрикции Pst I u

Bgl II и получают фрагмент ДНК около

400 п.о. Этот фрагмент снова расщепляют эндонуклеазой рестрикции Tag и извлекают фрагмент ДНК размером 260 п.о, Фрагменты ДНК извлекают, очищают экстракцией смесью фенол/хлороформ и осаждают 2 об.этанола.

Эти два фрагмента ДНК и указанный двунитевый синтетический олигомер ДНК сшивают вместе с помощью Т4 ДН К-лигазы и продукт сшивания используют для трансформации Е,coll х 1776. Трансформанты подвергают скринингу методом быстрой изоляции по процедуре щелочного лизирования и получают клон Е,coll х 1776/pKMUI, несущий плазмиду pKMUI, которая содержит модицифицированный ген проурокиназы. Клон Е,coll х 1776-pKMUI депонирован в ЕЯ.!.11 января.1985 г., как

Пример 13 (сравнительный). Конструирование плазмиды pMuT4L, Плазмиду экспрессии pMuT4L, содержащую ген проурокиназы человека без точечной мутации, конструируют из указанной плазмиды pKMUI и вектора экспрессии

pTCMI. E,coll IM103/pTCMl, депонирован с

ЕЯ.1,17 августа 1984 г„как ЕЕЯМ P вЂ” 7779.

5 мкг плазмиды pKMVI из примера 12 расщепляют 10 ед эндонуклеазы рестрикции Aatll и дайджест выделяют после обработки фосфатазой кишечника теленка (ФКТ). Другие 5 мкг плазмиды pTCMI расщепляют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции

Ааб! и выделяют электроэлюированием фрагмент ДНК размером 500 п.о. Эти два фрагмента ДНК очищают повторной экстра«цией смесью фенол/хлороформ и осаждением этанолом.

Оба фрагмента ДНК связывают Т4

ДНК-лигаэой и трансформируют в Е.coll

М103, Трансформанты подвергают скринингу и получают клон, несущий плазмиду рМиТ11, в которой tac промотор.(оператор) и последовательность С230 SD, имеют правильную ориентацию по отношению к гену проурокиназы.

Далее 5 мкг плаэмиды рКК223-3 расщепляют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции

Hind !!! и дайджест обрабатывают фосфатазой кишечника теленка.

1 мкг плазмиды рМи Т1, расщепляют 4 ед. эндонуклеазы рестрикции Dral. Фрагмент расщепления и 1 мкг 5 -фосфорилированного Hlndlll линкера (дСААОСТТ6) сшивают с помощью Т4 ДНК-лигаэы. Раствор экстрагируют равным объемом смеси фенол/хлороформ и ДНК осаждают добавлением 2 об. этанола. Осадок собирают при

16000 об/мин и 4 С и сушат, Образующийся фрагмент расщепления рМ и ТИ и фрагмент расщепления Hindlll указанной рКК233-3 сшивают, используя

Т4 ДНК-лигазу и трансформируют в E.col!

М103. Трансформанты подвергают скринингу и получают клон Ело!! М103/рМ Т21. содержащий плазмиду рНиТ21.

5 мкг плазмиды рМиТ21 расщепляют

10 ед. эндонуклеаз рестрикции Sphl u Tth

III и после экстракции смесью фенол/хлороформ ДН К осаждают эта нолом.

Извлеченную таким образом ДН К снабжают тупым концом при использовании Т4.полимеразы в присутствии 0.1 мМ дГТФ, дЦТФ и ТТФ и рециклиэируют Т4 ДНК-лигазой.

ДНК трансформируют в Е.coil 1 М103 и образуют. колонии на LB-агаровой среде, содержащей 50 мкгlмл ампициллина.

Трансформанты подвергают скринингу и получают клон Е. coil IM103/ðÌUÒ4.

Пример14 (сравнительный), Введение специфических мутаций замещения основания в кодон для аминокислоты 157 при использовании фага М13.

1. Получение однонитевой. матричной

ДНК.

1 мк каждой из пламиды рКУи 22 и двунитевой ДНК фага м13вр8 расщепляют в

20 мкл раствора, содержащего 10 MM трисHCi, pH 7,5 7мМ Mg CIz, 7мМ )3-меркаптоэтанола и 50 мМ NaCI, в течение 1 ч при 37 С при использовании 5 ед. Pstl, Соответствующие фрагменты ДНК извлекают после об.работки фенолом и осаждения этанолом.

Фрагменты ДНК сшивают в 20 мкл раствора, содержащего 66 мМ трис-HCI, рН 7,5, 5

MM MgCI2, 5 мМ ДТТ и 1 мМ АТФ в течение

16 ч при 12 С при использовании Т4 ДНКлигазы и трансформируют в Е.coll !М103, Трансформанты помещают на чашки с мягким агаром, содержащим 0,02% Х вЂ” gal u

1 мМ.IPTG, инкубируют в течение ночи при

37 С; Однонитевую ДНК получают иэ белых пятен,. образованных рекомбинантом.

При использовании некоторых из образующих однонитевых ДНК в качестве матрицы определяк2т последовательность осНоВВНММ. Получены цепь кодирования и цепь антикодирования. 5

2. Введение специфической мутации заМВЩВНИЯ ОСНОвдНИЯ .

flPM McrIof!b3QBBHMM Q6PB3 !oÙ8ÉcB Р8KoMGMH8HTHoA Однонитевай ДНК фага М1 10 (цепь антикодирования гена УК в качестве матрицы проводят введение сайт-направленной мутации с помощью олигонуклеотидного мутагена, 15

5 аасссоссаАТААсАТТА 3 .

Хотя этот олигонуклеотид из 18 оснований комплементарен к гену УК в одинонитевой матричной ДНК, два основания изменень1, 20 при этом кодон ТТТ, который определя1от фенилаланин, заменен нэ кодон САТ, определяющий аспарагиновую кислоту.

При использовании указанного олиго- 25 нуклеотида в качестве праймера синтезируют in vitro двухнитевую ДНК. При этом 2 ммоль 5 -фосфорилированного праймера добавляют к 0,5 ммоль матричной однонитевой ДНК и смесь инкубируют в 10 мкл 30 раствора, содержащего 7 мм трис-НD (рН 7,5) 0,1 мМ ЭДТА, 20 мМ NBCI и 7 мМ

MgCI в течение 20 мин при 60 С с последующим инкубированием в течение 20 мин при 23 С. К реакционной смеси добавля1от 35 по 0,5 мМ дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ до обьема 20 мкл и 2 ед. фрагмента Кленова

ДНК-полимеразы. Смесь инкубируют в течение 20 мин при 23"С и после добавления

2 мкл 10 мМ АТФ и 1 ед. Т4 ДНК-лигазы В 40 течение ночи при 1?"Ñ. Смесь непосредственно трансформируют в F.coli M103, Получают около 10000 фаговых пятен на микролитр указанной реакционной смеси, После переноса образующихся пятен из 45 мягкой агаровой среды нэ нитроцеллюлозный фильтр фильтр сушат в вакууме в течение 2 при 80 С, гибридизируют с олигонуклеотидным праймером в качестве зонда, меченным Р. Фильтр промывают В 6xSSC 50 при 52 C и пятна мута iTHoro фага, дающие положительные сигналы, выделяют с помощью авторадиографии, Из мутантного фага получают ДНК мутантного фага двунитевого типа (р1т13). При использовании ДНК 55 мутантного фага в качестве матрицы определяют нуклеотидную последовательность мутантной ДНК и подтверждают появление мутации замещения одиночного основания.

Кроме то 0 Возможно 34148c, il 1„KOi!OH ределяющий фенила IBHMII li "э / il!2" ло)кении, На 6!и вЂ” ОГ)ределяюв1ий кадь н САА

IIpM MCnoiIb3oBBHMM следуIOIIIBro <2лиг<2нуклеотида:

5 GGCCI" GGCGAAAA(А ПА 3 в качестве мутагена, П р и M е р 15(сравн11тельный), ко11сгруирование плазмиды рМО Т4 р1п3, После полного расщепления !0 мкг двухнитевой ДНК мутанта М13(Iprn3) c помощью Pstl выделяат фрагмент Длиной около 1,2 r.п.о. 10 мкг плазмиды рМВ (41.. частично расщепляют Psti и Выделг1ют фрагМ8НТ длиной QKoilo 4,6 T,n.o., из

УДаля1от фрагмент Д>1MHOII ОкОлО 1,2 т и <3, КажДый иЗ Двух указанных < эрэгментов

Выделяют обработкой фенолом и оса>кдением этанолом, осадки смешивают. Смесь лигируют в течение ночи при i 2 С Т4 ДНКлигазой и трансформируют в Е,co!i НВ101.

Трансформангы скриниру1от и голучают

KiIoH, содержащий нлазмиду рМ0 Г4 plTI3

Е.coii х 1776/pMU Т41 prn3, несущий г1лазмиду рМО Т41 pm3, депонирован 1 июля

1985 г„с, F,R.I, как FERM-P-0341 и помещен на международное дипонирование 22 января 1986 г„как FERM HP-971 В соответствии с пало>кениями Будапештского договога.

Пример 16(сравнительный). I,онструирование плазмиды рМи 141 р1гп1.

Получают мута11тный двунитевый фэг

М 13RFpmi, содержащий фра1ме.r ÖÍК. В готором кодон ААА для 35-го лизина мутировэн к кодону САА Для 1гнотамина, 120 тс2й же методике, что описана В примере 4, за исКЛIОЧBНИЕМ ТОГО, ЧТО ИСПОЛ Ьo>/!<22 C!! 02! 0!I! I Ié синтетический олигонуклеотид:

5 GATGGACAAAAGI" GC, 3

Затем из фага М13 RF 1ргл! и плазмидьi рМВ Т41 конструиру1от РМО I4!. I2mi по гой

>К8 методике, HTÎ Описана в прМ iop8 15, Пример 17 (сравнительный). Конструирование плазмиды рМВ T4L prn4, Мутантный двунитевой фаг, содержащий фрагмент ДНК, в котором кодон ААА для 135-ro лизина заменен на кодон глютамина., Г10лучаlат !10 меетоди1<8, oil! ñBíí0é в примере 14, 38 искл 1оч ен ием того, что используют синтетический Олигонуклеотид

5 GATGGAC AAAGCCC 3

N3 полученного таким образом мутантного фага полу IBIOT адHOHитевый фаг по методике, описанной в примере 14. При

ИСПОЛЬЗОВВНИИ ОДНОНИТЕВОГО фЭГа В КЭЧЕСТВЕ МатрИцЫ Кадон Тт Г для 57-ГП < эг НИЛаЛанина, зэт<".м мутиру10т к колону САТ для аспарэгMHQBOM KN< flo ы Col л ICHQ OrIM BH

Най МЕТ<ЭДИКЕ за ИСКЛ,,О:18НИЕМ Т01-0 Ч ГО ио

1732814

5 мкг таким образом полученной плаэмиды РМи Т84 расщепляют 50 ед. Н1пб1!1.

После экстракции фенолом и осаждения 40 этанолом осадок обрабатывают 1 ед. фрагмента Кленова в 20 мкл буфера, содержащего 50 мМ трис-HCI, рН 7,2, 10 мМ М9С!2, 0,1 MM ДТТ и 80 мкМ dN TPS при 22 С в течение 30 мин, После экстракции фенолом 45 и осаждения этанолом осадок обрабатывают 5 ед.Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл буфера, содержащего 1 мкг. линкера pSs Т1 и 66 мМ трис-HCI, рН 7,6, 6,6 мМ MgCIz, 10 MM

ДТТ и 1 мМ АТФ при 12 С в течение. 2 ч, 50 экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Осадок расщепляют 50 ед, Pstl в т

100 мкл раствора, содержащего 20 мМ трис-НСI, рН7,5, 10мМ MgClz и 100 мМ ИаС! при 37 С втечение 2ч. Реакционную смесь 55 с подвергают электрофорезу в 0,7 -ном агароэном геле в извлекают фрагмент ДНК размером 4300 п.о.

5 мкг плаэмиды рМи Т4! pml расщепляют 50 ед. Pstl, Реакционную смесь затем д пользуют следующий синтетической олигонуклеотид:

5 GGCCCCGCGATAAGATTA 3 для получения мутантного двунитевого фага

М13 RFpm4, содержащего фрагмент ДНК, в котором кодон ААА для 135-того лизина заменен на кодон САА для глютамина и кодон для 157-ro фенилаланина мутирован на кодон для аспарагиновой кислоты. .Затем из полученного таким образом мутантного фага M13RFpm4 и плаэмиды рМи T41L конструируют плазмиду рМи T41L

pm4 согласно методике, описанной в примере 15.

Пример 18 (сравнительный). Конструирование плаэмиды рМи Т91 pm1.

5 мкг плазмиды рМи Т41 расщепляют

50 ед. Аса I и 100 ед, Aatll в 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-kCI, рН 7,5, 7 мМ

М9С12, 125 мМ NaCI, 7мМ р-меркаптоэтанола при 37 С в течение 6 ч. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 0,7 ном агарозном геле и извлекают фрагмент

ДНК около 5500 п.о. Другие 10 мкг той же плазмиды рМи Т41 расщепляют 50 ед. Aatll и 50 ед. Smal. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 2,0 -ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДН К 55 п.о. Полученные таким образом два фрагмента ДНК сшивают 5 ед, Т4 ДН К-лигазы. Реакционную смесь используют для трансформации

Е,coll. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащие плазмиду рМи T8L, и из отобранных колоний выделяют плазмиду рМи T8L.

35 подвергают электрофорезу в 0,7 -ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 1200 п.о.

Фрагменты ДНК смешивают и сшивают, используя 5 ед. Т4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь трансформируют в E,coll !

М103. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, скринируют на колонии, содержащие плазмиду рМи Т91 pml, и плазмиду рМи

Т9 pm1 выделяют.

Пример 19. Конструирование плазмиды pD PAT2.

50 мкг плазмиды pD PA3 расщепляют

75 ед. Bgl II в 200 мкл буфера, содержащего

10 мМ трис-НСI, рН 7,5, 7 ММ MgClz, 100 мМ

NaCI и 7мм Р-меркаптоэтанола при 37 С в течение 4 ч.

После осаждения этанолом осадок инкубируют с 5 ед. фрагмента Кленова в 50 мкл буфера, содержащего 50 MM трис-НС1, рН

7,2, 10 мМ М9С12, 0,1 мМ ДТТ и 80 мкМ при

22 С в течение 30 мин. Реакционную смесь подвергают электрофорезу на 0,7 -ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК размером 1800 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначается как фрагмент ДНК (А), 10 мкг плазмиды рУ TU3 расщепляют 20 ед. Sall, осаждают этанолом, обрабатывают

2 ед. фрагмента Кленова. После осаждения этанолом осадок обрабатывают щелочной фосфатазой, фенолом и этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл раствора, содержащего

10 MM трис-HCI (ðÍ 7,5) и 1 мМ ЭДТА. 5 мкг этой ДНК и 5 мкг фрагмента ДНК(А) обрабатывают 10 ед. Т4 ДНК-лигаэы. После осаждения этанолом осадок расщепляют 15 ед

С1а 1. После осаждения этанолом осадок расщепляют 15 ед. BamHI. После осаждения

ДНК этанолом осадок обрабатывают 2 ед. фрагмента Кленова. Реакционную смесь подвергают. электрофорезу в 0,7 -ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК размером 2000 п.о. Этот фрагмент.ДНК обозначают как фрагмент ДНК (Б).

2 мкг плазмиды рК12 расщепляют 10 ед, Sal l. После осаждения этанолом осадок обрабатывают 20 ед. фрагмента

Кленова, осаждают этанолом, осадок обрабатывают щелочной фосфатазой. После обработки фенолом проводят осаждение этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл расвора, содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,5) и 1 мМ ЭДТА. 1 мкг этой ДНК и 1 мкг фрагмента ДНК (Б) лигируют. Реакционную месь используют для трансформации Е.coll

IM103, Трансформанты, устойчивые к ампициллину, скринируют из колоний, содержащих плаэмиду pDPAT2, и выделяют ДНК. п р и м е р 20. Конструирование плазмиы рНАОО.

1732814

5 мкг плазмиды рРЕЗ (такая же как РМО

T4L) расщепляют 10 ед. PVU I. После осаждения этанолом осадок расщепляют 10 ед.

EcaR 1. Реакционную смесь подвергают злектрофорезу в 1,2%-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 2000 п.о., который обозначают как фрагмент ДНК (А).

10 мкг плаэмиды расщепляют 15 ед.

PVUI, а затем 15 ед, BamP!. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 1,2%ном агарозном геле и извлекают фрагменты

ДН К около 2300 п.о. и около 1346 п.о. Ф рагмент ДНК около 2300 п,о, обозначают как фрагментДНК(Б). 2 мкгфрагмента ДНК1346 п.о. расщепляют 5 ед. BamHI и подвергают электрофорезу в 1,2%-ном агарозном геле, извлекают фрагмент ДНК около 75 Оп.о., и обозначают как фрагмент ДНК (В), 10 мкг плазмиды pDPAT2, сконструированной в примере 19, расщепляют 15 ед.

EcoRl, подвергают эпектрофорезу в 1,2 ном агарозном геле и извлекают фрагмент

ДНК около 472 п.о., 2 мкл фрагмента расщепляют 1 ед.-Hindlil, подвергают электрофорезу в 5% ПААГ и извлекают фрагмент

ДНК около 180 п.о. 1 мкг этого фрагмента и

1 мкг фрагмента ДНК(В) лигируют и с помощью электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле извлекают фрагмент ДНК около

931 п.о. 1 мкг этого фрагмента ДНК, 1 мкг фрагмента ДНК(А) и 1 мкг фрагмента ДХК(Б) сшивают 2 ед. Т4 ДН К-лигазы. Реакционную смесь трансформируют в E,coll IM103.

Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, со-. держащие плазмиду рНАОО, плазмиду выделяют.

Пример 21, Конструирование плазмиды рНА03, Плазмиду рНА03 конструируют по методике, описанной в примере 20, эа исключением того, что вместо плаэмиды рРЕ3 используют плазмиду рРЕ3 pm3 (такая же как рМи T4Lpm3).

Пример 22. Конструирование плазмиды рНА20.

5 мкг плазмиды рНАОО, гидролиэуют рестриктазой Pstl, осаждают этанолом. Осадок расщепляют 10 ед, Seal с помощью электрофореза в 1,2 -ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 1100 п.о.

Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент ДНК (А).

5 мкг плазмиды рНАОО расщепляют 7 ед. pstI, осаждают этанолом. Осадок расщепляют 10 ед. EcoRI, осаждают этанолом, осадок подвергают электрофорезу в 0,7% нам агарозном геле и извлекают фрагмент

ДНК около 3500 п,о, Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент ДНК(Б), 15

15 мкг плазмиды pDPAT2, сконструированной в примере 19, расщепляют 20 ед. Bgl

И. После осаждения этанолом осадок расщепляют 25 ед,Seal, подвергают электрофорезу в 1,2%-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 625 п.о. Этот фрагмент

ДНК обозначают как фрагмент ДН К(В).

10 мкг плазм иды p D PAT2 расщепля ют

15 ед Bglll, после осаждения этанолом осадок расщепляют 10 ед EcoRI. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 5 ПААГ и извлекают фрагмент ДН К около 150 п.о.

Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент ДНК (Г).

1 мкг фрагмента ДНК(А), 1 мкг фрагмента ДНК(Б), 1 мкг фрагмента ДНК(В) и 1 мкг фрагмента ДНК(Г) сшивают с помощью 4 ед.

Т4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь используют дпя трансформации Е.coll IM103, Трансформанты, устойчивые, к ампицилпину, подвергают скринингу на колонии, содержащие плаэмиду рНА20. Плазмиду в ыделя ют.

Пример 23. Конструирование плазмиды рНА23.

Плазмиду рНА23 конструируют по методике, описанной в примере 22, за исключением того, что используют плазмиду рНАОЗ, сконструированную в примере 21, вместо плазмиды рНАОО, использованной дпя конструирования плазмиды рНА20.

Пример 24. Конструирование плазмиды рНА13.

25 мкг плазмиды рНА23 расщепляют

30 ед. Bgl II, После осаждения этанолом осадок обрабатывают 4 ед. фрагмента Кленова, обрабатывают фенолом и осаждают этанолом, Осадок расщепляют 30 ед. Ps> с помощью электрофореза в 0,7%-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДН К около 3500 п.о., обозначенный как фрагмент

ДНК(А), и фрагмент ДНК около 1700 п,о., обозначенный как фрагмент ДНК(Б)..

7 мкг фрагмента ДНК(Б) расщепляют 10 ед, RSal; Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 1,2 -ном агароэном геле и извлекают фрагмент ДНК около 1100 п.о., обозначенный как фрагмент ДНК(В), и фрагмент ДН К около 626 п.о., обозначенный как фрагмент ДНК(Г).

2 мкг фрагмента ДНК(Г) расщепляют

5 ед Ddel в 20 мкл буфера, содержащего

100 мм трис-HCI (рН 7,5), 5 мм М9С!2, 100 мМ йаО и 7 мМ р-меркаптоэтанола при 37 С в течение 8 ч. После осаждения этанолом осадок обрабатывают 1 ед,фрагмента Кленова, обрабатывают фенолом и осаждают этанолом, С помощью электрофореза в 5%ном полиакриламидном геле извлекают фрагмент ДНК размером 241 п,о. 1 мкг этого. фрагмента ДНК., 0,5 мкг фрагмента ДНК(В) сшчвэго " с помощью 3 ед. Т4 ДНК-лигазы.

Реакционную смесь используют для трансформации Г.соИ 1М103, Трансформэнты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащие плазмиду рНА13, Г!лазмиду выделяют, Пример 25. Зкспрессия и экстракция продукта гена. а. Е.соИ1М103/ pDPAT2,1М103/ РНАОО, I fvi 103/pÍA03, IM10Ç/ðÍÀ20, IM103/ðÍÀ23 и IM103/рНА13, полученные в примерах 1923, и E,coÈ IМ 103/pMU T4L, полученную в примере 15, культивируют в 100 мл LB-среды с добавкой 100 мкг/мл ампициллина при

37 С со.встряхиванием, Когда оптическая плотность при 600 нм культурэльной среды достигает 0,6 к среде добавляют изопропил Р, 0-тиогалэктопирэнозид до конечной концентрации 1 мМ и культивирование продолжают еще 5 ч, Культуральный бульон затем переносят в ледяную баню.

Охлэжде!-ейный бульон центрифугируют, чтобы собрать клетки, которые затем суспендируют в 50 мл буфера, содержащего 50 мМ трис-HCI (рН 7,5) и 100 мл NaCI. Клетки собирают центрифугировэнием, повторно суспендируют в 10 мл того же буфера, После этого клетки разрывают ультразвуком и центрифугируют при 15000 об/мин в течеи 40С б. Осадки суспендируют в 10 мл буфера, содержащего 7,5 М раствор гуанидингидрохлоридэ и 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, и отстаивают при комнатной температуре в течение 90 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин, и надосадочную жидкость разбавляют до 5 мл раствора, содержащего 1Mi гуанидингидрохлоридэ, 0,05 M трис-НС! рН 7,5, 2 мМ глютатиона восстановленного типа, 0,2 MM глютатиона окисленного типа, и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Затем раствор диэлизуют против 100 об, раствора, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,4 и 0,4 мМ NaCI, при 4 С в течение 4 ч, а потом против 100 об, раствора, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,4 и 0,1 м NaCI, в течение

2 ч с получением экстракта, Пример 26. Каждый осадок, полученный от каждого трэнсформанта в примере

25 а, в ког;ичестве соответствующем 1 мл культурэльного бульона, пополняют 20 мкл раствора, содержащего 3 M раствор мочевины, 0,08 M раствор дитиотрейтола и 1% додецилсульфат натрия, Смесь прогревэют при 95 С в течение 5 мин, центрифугируют, надосадочный слой (8 мкл} наслаивают на градиентный гель додецилсульфат натриявЂ” полиакриламид и осуществляют электрофо30

50 рез. После электрофореза гель окрашивают

1% красителем Coomasie и отмывают. Образец продукта экспрессии из IM103/pHA03, Е.со11, который продуцирует гибридный активатор плазминогена вЂ” .подобный полипептид НАОЗ 1, сравнивают с образцом продукта экспрессии из IM103/pDPAT2

E.coll, который продуцирует нативный тканевый активатор плазминогена человека (АПТ), и с образцом продукта экспрессии из !

М103(рРЕЗ/рМи T4L) Е,coll, который продуцирует нативную(УК)человека,при помощи электрофореза.

Каждый образец, полученный описанным путем, подвергают градиентному электрофорезу в полиакрилэмидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и разделенные протеины переносят на нитроцеллюлозный фильтр, который затем подвергают иммуноанализу, Для этого нитроцеллюлозный фильтр пропитывают в растворе 3%-ной желатины в TBS (20 мМ трис-НС1, рН 7,5, и 500 мМ NaCI), после чего фильтр пропитывают в течение 2 ч в растворе, содержащем антисыворотку антитканевого активатора плазминогена, полученную из кролика, иммунизированного тканевым активатором плазминогена. Фильтр промывают раствором TBS и затем пропитывают в растворе, содержащем энтикроличье антитело IgG, меченое пероксидазой хрена. После тщательной промывки фильтр пропитывают в растворе, содержащем 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, 500 мМ NaCI, 0,06%

4-хлор-1-нафтола и 0,015% H20z в течение 5 мин. Результаты показывают, что гибридный полипептид иммунореактивен как к актисыворотке против тканевого активатора плазминогена, так и к антисыворотке против урокиназы, Пример 27. Получение колонки сефарозы, родственной фибрину, 3 г фибриногена растворяют в 100 мл