Способ получения посевного материала - продуцента аминогликозидного антибиотического комплекса sтrертомuсеs сrемеus suвsр.nевrамсyini

Способ получения посевного материала - продуцента аминогликозидного антибиотического комплекса sтrертомuсеs сrемеus suвsр.nевrамсyini

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: в микробиологической и медицинской промышленности при получении аминогликозидного антибиотического комплекса, состоящего из карбамоилтобрамицина, карбамоилканамицина и апромицина. Сущность изобретения: вегетативный инокулят выращивают в жидкой питательной среде в течение 24 ч при перемешивании и аэрации с последующим отбором кондиционного материала по морфологической характеристике культуры, рН среды и дегидрогеназной активности мицелия . Увеличение содержания антибиотиков в культуральной жидкости на 30% достигается посредством использования на стадии ферментации вегетативного инокулята, обесцвечивающего раствор метиленовой сини в течение 1-2 мин при рН среды 7,2-7,5 и имеющего морфологию в виде отдельных сплетений гиф. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 P 19/50

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4731518/13 (22) 16.08.89 (46) 23.05.92. Бюл. ¹ 19 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) Г. Н. Вострокнутова, В. Н. Коваль.

Л.П.Жиганова, Г.М.Симонова, Н.А,Саитова и О.А.Белоусова (53) 615.475(088.8) (56 Лабораторный регламент на производство тобрамицина сульфата. — M,: ВНИИантибиотиков, 1983.

Nyiri L., Lengyel 2. Асса microbiol. — Acad, Sci. Hung„1959, ч. 6, р. 171-177. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСЕВНОГО

МАТЕРИАЛА — ПРОДУЦЕНТА АМИНОГЛИКОЗИДНОГО АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА STREPTOMYCES CREMEUS

SUBSP. NEBRAMYCINI

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, в частности к способу получения аминогликозидного антибиотического комплекса, состоящего из карбамоилтобрамицина (тобрамицин — медицинский препарат. представляет интерес в химиотерапии инфекций, обусловленных грамотрицательными бактериями, в том числе Ps. aeruginosa), карбамоилканамицина и апрамицина (применяется в ветеринарии при лечении желудочно-кишечных заболеваний крупного рогатого скота и свиней).

Известен способ получения посевного материала, когда вегетативный посевной материал культуры Streptomyces cremeus

subsp. nebramycini выращивается на посевной среде следующего состава, мас, : кукурузный экстракт 2,0; глицерин 2,0;

„„5Q„„1735366 А1 (57) Использование: в микробиологической и медицинской промышленности при получении аминогликозидного антибиотического комплекса, состоящего из карбамоилтобрамицина, карбамоилканамицина и апромицина. Сущность изобретения: вегетативный инокулят выращивают в жидкой питательной среде в течение 24 ч при перемешивании и аэрации с последующим отбором кондиционного материала по морфологической характеристике культуры, рН среды и дегидрогеназной активности мицелия, Увеличение содержания антибиотиков в культуральной жидкости на 30% достигается посредством использования на стадии ферментации вегетативного инокулята, обесцвечивающего раствор метиленовой сини.в течение 1-2 мин при рН среды 7,2-7,5 и имеющего морфологию в виде отдельных сплетений гиф. 1 табл. хлористый аммоний; хлористый натрий 0,3; мел 0,5; животный жир 0,75.

Посевной мицелий к моменту передачи на стадию ферментации должен удовлетворять следующим требованиям; рН 5,5-7,0; внешний вид культуры: мелкий мицелий, заполняет весь объем пробы, при стоянии мицелий не оседает. Микроскопическая характеристика мицелия; в препарате, окрашенном метиленовым синим, наблюдаются короткие слабоветвящиеся, базофильные гифы.

Недостатком известного способа является низкая антибиотическая активность культурэльной жидкости в конце ферментации.

Цель изобретения — увеличение антибиотической активности культуральной жидкости, что приведет к снижению себестоимости антибиотиков тобрамицина и апрэмицина, 1735366

Поставленная цель достигается тем, что 0,2; хлор р хло истый натрий 0,3; мел 0,5; водопроН с е ы7,4+0,1.. при выращивании в и вегетативного инокулята водная вода остальное; р р д, +О, . иал Н 6,0), не содеропределя т ю дегидрогенаэную активность Посевной материал tp, ), ми елия и тем обесцвечивания раствора жащий постороннеимикроф р, к о ло ы, имеющий метиленовой сини и при обесцвечивании в 5 внешнии вид:

" ви : мелкий мицелий, заполняет течение 1-2 мин (рН среды 7,2-7,5) и наличии весь объем пробы, при стоянии не оседает. отдельных сплетении гиф д ф отбирают конди- Микроскопическая характеристика: в препарате, окрашенном метиленовым синим, ционный материал. лабоветвя иеся, В м пособе физиологическое наблюдаются короткие сла Щ известном сп

ы ги ы в количестве 2ф> от объсостояние культуры Streptomyces rlmosus, 10 базофильные гифы в к

37 1С ма к ль альной жидкости используют по окислительно-восстановительной(дегид- при проведении ферментаций при "- в ной) активности мицелия. Дегидро- аппаратах вместимостью 30 л (коэффициент я О 5) и в колбах (Чт50 100 мл срегеназную активность продуцента измеряют заполнения О, ) и в к (25 мл с е ы) на качалке с числом по скорости обесцвечивания красителя ме- 15 ды; V>oo 25 р д ) го, Для культуры оборотов 240 об/мин на среде следующего тиленового синего, Для а . . м ка соевая 3,5; животный

Streptomyces cremeus subsp. nebramyclni состава, мас. . мука соевая еги огеназная активность, измеренная жир 1,1; глюкоз,; р а 1 5; хло истый аммоний по известной методике, может быть охарак- 0,6; сернокислый м г и магний 1,1; мел 0,7; водотеризована временем обесцвечивания 20 проводная вода остальное; рН среды 6,2+

0,01)(,-ного раствора метиленовой сини. Ус- М,1. тановлено, что кондиционный посевной ма- Продолжительность ферментации 72 ч. териал имеет дегидрогеназную активность Антибиотическую активность культу1-2 мин. Однако данный параметр не может ральной жидкости определяют методом быть единственнои х р а актеристикойконди- 25 диффузии в агар с использованием тестоЬОИз штамм 6633 и выционности вегетативного инокулята, так как культуры Bacillus subtilis штамм и выте же значения дегидрогеназной активно- ражают в единицах на 1 мл. Суммарная сти возможны пр ожны при наличии в посевном ма- антибиотическая активность культуральной териале большого количества жидкости 2800 мкг/мл для штамма 98 и

71 и лизи ованной биомассы. Для точного отбо- 30 1400 мкг/мл для штамма 2242. ра кондиционного посевного материала лизированнои иом нужно в ж о ввести дополнительно еще 2 пара- тивного инокулята проводят на посевной фология культуры при микроско- среде прототипа в течение р пировании — отдельные сгглетения гиф и рН в колбах на качалке с число р м обо отов среды — 7,2-7,5, Только 3 параметра s сово- 35 240 об/мин и в посевном аппарате вместикупности позволяют получить кондицион- мостью 7 л (коэффициент заполнения 0„) с ный посевной материал, использование числом оборотов 150 об/мин. которого в дальне шем йшем на стадии фермен- Кондиционность вегетативного инокутации дает максимальную антибиотическую лята определяют 3 параметрами в активность культуральной жидкости. Значе- 40 совокупности: морфология при микросконие дегидрогеназной активности более 2 пировании — отдельные сплетения гиф, рН мин свидетельствует о недостаточной зре- культуральной жидкости 7,2; время обесцлости мицелия продуцента, т.е, он будет ма- вечивания 0,01ф>-ного раствора метиленолопродуктивен на стадии ферментации. вой сини (1 мл раствора + мл

Значение дегидрогеназной активности 45 культуральной жидкости) 1 мин. меньше 1 единицы свидетельствует о силь- Кондиционный посевной материал исном автолизе культуры, пользуют при проведении ферментаций в аппаратах вместимостью 30 л (коэффициП р и ме р 1(по известному способу). B ент заполнения 0,5), в колбах (Verso 100 мл качестве объекта исследования используют 50 среды) на качалке с числом оборотов 240 т Streptomyces cremeus subsp, об/мин, добавляя его в количестве 5 от

nebramycini (штаммы 2242, 9871). Вегетатив- объема культуральной жидкости. р и. Фе менный инокулят выращивают при 37"С в тече- тации проводят при 37= -1 С на ферментациние 24 ч в колбах на качалке с числом оннои среде прототипа, оборотов 240 об/мин и в посевном аппара- 55 Продолжительность ферментации 72 ч. Анте вместимостью 7 л (коэффициент запол- тибиотическую активность культуральной нения 0,7) с числом оборотов мешалки жидкости определяют методом диффузии в

150 об/мин на среде следующего состава агар с использованием тест-культуры мас.,: глицерин 2,0; кукурузный экстракт Bacillus subtilis штамм 6633 и выражают в

2,0; животный жир О 75: хлористый аммоний

1735366 актибиотической активности культуральной жидкости на 30%.

Суммарная антибиотическая активность к.ж., мкг/мл

Дегидрогеназная ак- . тивность, мин рН

Пример

Морфология при микроскопировании

Штамм

П АО

СС-тс

Штамм л ею

85 I I

1(известный) 2

1400

2800

6,0

Короткие слабоветвящиеся базофильные гифы

Отдельные сплетения базофильных гиф

То же

1820

3640

7,2

1000

2000

2

1,5

7,5

7,0

7,2

Густая сетка базофильных гиф .

Отдельные сплетения базофильных гиф

Автолизированная сетка базо ильных ги

600

1200

6.9

500

1000

20 с

5.8

3О

Составитель Г. Вострокнутова

Редактор Н, Гунько Техред М.Моргентал Корректор Т. Малец

Заказ 1793 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 единицах на 1 мл, Суммарная антибиотическая активность культуральной жидкости

3640 мкг/мл для штамма 9871 и 1820 мкгl мл для штамма 2242.

Применение вегетативного инокулята, кондиционность которого определяют по одному параметру (по морфологии при микроскопировании как в случае с прототипом), приводит к потере активности на стадии ферментации в силу использования еще молодого или переросшего посевного материала.

Полученные данные по влиянию отдельных характеристик вегетативного инокулята на содержание аминогликозидного комплекса в культуральной жидкости представлены в таблице.

Приведенные примеры показывают, что только определение кондиционности посевного материала по 3 параметрам в совокупности приводит к увеличению

Формула изобретения

5 Способ получения посевного материала — продуцента аминогликозидного антибиотического комплекса Streptomyces

cremeus subap. nebramycini, включающий выращивание культуры в жидкой питатель10 ной среде с последующим отбором кондиционного материала по морфологической характеристике культуры и рН среды, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения антибиотической активности культу15 ральной жидкости, при отборе определяют дегидрогеназную активность мицелия путем обесцвечивания раствора метиленовой сини и при обесцвечивании в течение 1-2 мин, рН среды 7,2-7,5 и наличии отдельных

20 сплетений гиф отбирают кондиционный материал.