Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей зимоген с человека

Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей зимоген с человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотех нологии и может быть использовано для получения зимогенных форм чело веческого белка С. Способ конструиро - вания рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей зимоген С человека, зак лючается в выделении фрагмента ДНК, кодирующего тяжелую цепь белка С человека с последующим осуществлением сайт специфического мутагенеза исубклонированием фрагмента ДНК с мутацией в соответствующую плазмиду. При этом получают плазмиды, кодирующие поли пептид, включающий легкую цепь белка С человека, сигнальньй пептид и про пептид J1 карбоксшшрованного секре -1 тируемого белка, дипептид лизин арггинин, аргиниж-лизин или аргинин - аргинин и фрагмент ДНК, содержащий мутацию о 2 табл ,

(19) (11) СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ . РЕСПУБЛИК (51) 5 С 12 N. 15/12

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

2 веческого белка С. Способ конструиро вания рекомбинантной плазмидной ДНК,, е кодирующей зимоген С человека, заключается в выделении фрагмента ДНК, кодирующего тяжелуюцепь белкаС человека с последующимосуществлением сайтспецифического мутагенеза исубклонированием фрагмента ДНК с мутацией в соответствукицую плазмиду. При этом получают плазмиды, кодирующие пойи пептид, включающий легкую цепь белка

С человека, сигнальный пептид и про пептид 31 =карбоксилированного секре= тируемого белка, дипептид лизин аргинин, аргинин "лизин или аргинин аргинин и фрагмент ДНК, содержащий мутацию. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения зимогенных форм человечес-. кого белка С.

Белок С вЂ” витамин К - зависимый плазменный белок играет важную. роль при регулировании свертывания крови.

Концентрация белка С является низкой при тромботических состояниях, таких как диссемилирующий внутрисосудисчый тромбоз, и при заболеваниях, располагающих к тромбозу, таких как большая

10 20 .5 -ATG TGG CAG СТС ACA AGC CTC CTG

НгМ-ИЕТ TRP GLN LEU THR SER LEU LEU

30 40

CTG TTC GTG GCC ACC TGG GGA АТТ

LEU РНЕ VAL ALA THR TRP GLY ILE

10 15

50 60 70 80 90 тСС GGC ACA ССА GCT ССТ CTT GAC TCA GTG TTC TCC AGC AGC GAG CGi

SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL РНЕ SER SER SER GLU ARG

20 25 . 30 (21) 4613143/13 (22) 22.12.88 (31) 138009 (32) 28. 12.87 (33) US (46) 07.06,92. Бюл. N - 21 (71) Эли Лилли ЭНД Компани (72) Нильс Ульрик Бэнп (US), Хармут

Джозеф Эрлих (DE), Брайан Вилльям

Гриннелл и Сау-чи Бетти ЯН (US) (53) 575.224.2; 577.2(048) (088.8) (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОА ПЛАЗИИДНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ

ЗИИОГЕН С ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотех нологии и может быть использовано для получения зимогенных форм чело травма, крупное хирургическое вмешательство и рак.

Для облегчения понимания изобретения и активации белка С ниже представлена кодирующая последовательность и соответствующая аминокислот- . с ная последовательность человеческого (Д белка С. Эта аминокислотная последо- 10 вательность и ее соответствующие час- QQ ти характеризуют также "нативный че- (Л ловеческий белок С" для целей предлагаемого способа.

1739854

100 110 120 130 140

ОСС САС CAG GTG CTG CGG АТС CGC ААА CGT GCC ААС ТСС ТТС CTG GAG

ALA HIS GLN VAL ЬEU ARG ILE АБО LYS ARG ALA ASN SER РНЕ LEU GLU 35 40 45

150 160 170 180 190

GAG СТС CGT САС AGC AGC CTG GAG CGG GAG TGC АТА GAG GAG ATC TGT

GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

50 55 60

200 210 220 230 240

GAC ТТС GAG GAG GCC AAG GAA АТТ ТТС CAA ААТ GTG GAT GAC АСА СТО

ASP РНЕ GLU GLU ALA LYS GLU LE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU

65 70 . 75 80

250 260 270 280

GCC ТТС TGG TCC AAG САС GTC.GAC GGT GAC CAG TGC TTG GTC TTG ССС

ALA РНЕ TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

85 90 95

290 300 310 320 330

TTG GAG САС CCG TGC. GCC AGC CTG ТОС ТОС GGG САС GGC ACG ТОС АТС

LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GIY HIS GLY THR CYS ILE

100 105 110

340 350 360 370 380

GAC GGC АТС GGC AGC ТТС АОС TGC GAC TGC CGC AGC ООС TGG GAG GGC

ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY

115 120 125 390 400 410 420 430

CGC TTC ТОС САО CGC GAG GTG AGC TTC СТС AAT TGC TCG CTG ОАС ААС

ARG РНЕ CYS GLN ARG GLU VAL SER РНЕ LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN

130 135 140

440 450 . 460 ., 470 480

GGC GGC TGC ACG САТ TAC TGC СТА GAG GAG GTG GGC TGG CGG СОС TGT

GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

145 150 155 160

490 500 510 . 520

AGC TGT GCG ССТ GGC ТАС AAG CTG GGG GAC GAC СТС CTG CAG ТОТ САС

SER CYS ALA .PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS

165 170 175

530 540 550 560 570

ССС ОСА GTG ААО ТТС ССТ TGT GGG AGG ССС TGG ААО CGG ATG GAG AAG

PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY АВО PRO TRP LYS ARG НЕТ GLU LYS

180 185 190

580 590 600 610 620

AAG CGC AGT САС CTG ААА CGA GAC ACA GAA. GAC САА. GAA GAC CAA GTA

LYS ARG SER HIS lEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN ЧАЬ

195 200 205

630 640 650 660 670

GAT CCG CGG CTC АТТ GAT GGG ААО ATG АСС AGG CGG GGA GAC AGC ССС

ASP PRO ARG LFU ILE ASP ОЬУ LYS ИЕТ THR ARG ARG GLY ASP SER PRO

210 215 220

1739854

680 690 700 710 720

TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA

TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU АЬА CYS GLY ALA

225 230 235 240

ССС ТСС TGG GTG

PRO SER TRP VAL

780 790

AAG СТС СТТ GTC AGG

LYS LEU LEU VAL ARG

260

730

GTG СТС ATC САС

VAL LEU ILE HIS

GAG ТСС AAG

GLU SER LYS

820 830 840 850 860

TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG САС АТС AAG GAG GTC ТТС GTC CAC

TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS

275 280 285

870 880 890 . 900 910

ССС AAC ТАС AGC AAG AGC ACC АСС GAC ААТ GAC АТС GCA CTG CTG САС

PRO ASN TYR SER LYS БЕК THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

290 295 300

920 . 930 940 950 960

CTG GCC CAG ССС GCC АСС СТС ТСС CAG АСС ATA GTG ССС ATC TGC СТС

LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER .GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU

305 310 315 320

970 980 990 1000

CCG GAC AGC GGC СТТ GCA GAG CGC GAG СТС. AAT CAG GCC GGC CAG GAG

PRO ASP SER СЬУ LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN АЬА GLY GLN GLU

325 330 335

1010 1020 1030, 1040 1050

АСС СТС GTG ACG GGC ТСС GGC ТАС CAC AGC АСС CGA GAG AAG GAG GCC

THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA .

340 345 350

1060 1070 1080 1090 1100

AAG AGA ААС CGC АСС ТТС СТС CTC AAC ТТС АТС AAG АТТ ССС GTG GTC

LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL

355. 360 365

1110 1120 1130 1140 1150

CCG. САС ААТ GAG ТСС AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG ТСТ GAG ААС

PRO H1S ASN CLU CYS SER GLU VAL ИЕТ SER ASN ИЕТ VAL SER GLU ASN

370 375 380

1170 1180 1190 1200

АТС СТС GGG САС СОС CAG GAT GCC TGC GAG GGC

ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

390 . 395 400

1220 1230 1240

ATG GTC GCC ТСС ТТС САС GGC ACC TGG ТТС CTG

ИЕТ VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU

410 415

1260 1270

GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT

VAL SER TRP GLY GLU GI.Х CYS

420 425

GTG GGC CTG

ЧАЬ GLY LEU

1280 1290

GGG СТС CTT САС ААС ТАС

GLY LEU LEU HIS ASN TYR.

430

1300 1310 1320 1330 1340

GGC СТТ ТАС ACC AAA GTC AGC CGC ТАС СТС GAC TGG ATC ÑÀÒ GGG САС

GLY ЧАЬ TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS

435 440 445

1350 1360 . 1370 1380

ATC AGA GAC AAG GAA GCC ССС CAG AAG АСС TGG GCA ССТ TAG"3

ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-СООН

450 455 460

ATG CTG TGT GCG GGC

ИЕТ LEU CYS АЬА GLY

GAC AGT GGG GGG ССС

ASP SER GLY GLY PRO

405

CTG АСА GCG GCC

LEU THR ALA ALA

СТТ GGA GAG ТАТ GAC

LEU GLY GLU TYR ASP

265:ф.

CAC ТСС ATG GAT

HIS CYS ИЕТ ASP

CTG CGG CGC

LEU ARG ARG

270

9854 8 и

5 -ССА ССС ТСС CTG-CAG GGC TGG GCT

ТТТ GCA TGG .САА TGG САА TGG ATG

GGA САТ ТАА AGG GAC ATG TAA САА

GCA САС ССС ССС ССС ССС ССС ССС

CCC ССС ССА G-3

) 1 соответственно на концах 5 — и 5— нити, кодирующей последовательности для выделившегося человеческого белка С. В силу комплементарной природы . пар оснований ДНК, последовательность одной нити двунитевой молекулы ДНК остаточна для определения последовательности второй нити. Плаэмиду рНС7 выделяют из Е.coli К12 RR

7/pHC7, депонированного под номером

NRRL В-15926.

Белок С можно представить схематически следующим образом;

42 43 197 198 199 200 211 212 461

pre-pro ?Л: KR AP АНСнс

pre-pro— последовательность аминокислотных остатков 1-42, кодирующая сигнальный пептнд и пропептид белка С че" ловека, важный для направленной секреции и (-карбоксилирования белка С последовательность аминокислотных остатков 43-197 белка С составляет легкую 35 цепь (LC) как двуцепочечного зимогена (образованного иэ одноцепочечного зимогена отщеплением KRдипептида), так и активи- 40 рованных форм белка С; последовательность аминокислотных остатков 198199 белка С человека; считается, что эти остатки от- 45 щепляются возможно в две стадии, включающие в себя сначала расщепление (по остаткам 197 - 198 или 199200), а затем действие карбоксипептидазы или аминопептидазы с образованием двуцепочечного белка С; последовательность аминокислотных остатков 200211 белка С, включающая в себя пептид активации, отщепляемый от зимогенных

LC7 173

ДНК-последовательность получена иэ к-ДНК-клонов, созданных из человеческой печеночной м-РНК, кодирующей человеческий белок С. Два из этих к-ДНК-клонов используют для конструи" рования ДНК-молекулы, включающей в себя как последовательность, кодирую" щую белок С, так и части ДНК, кодирующие нетранслированную м-PHK на концах 5 - и 3 -кодирующего участка.

Эту молекулу ДНК вводят в Рэс1-сайт плазмиды pBR322 для конструирования плазмиды рНС7. Плазмида рНС7 включает описанную выше кодирующую последовательность, а также следующие дополнительные последовательности:

5 -С TGG AGG GGG GGG GGG GGG GGG

GGG СТА TCA TGG CGG CAG GGC GAA

СТТ GCA GTA ТСТ CCA CGA CCC GCC

ССТ ACA GGT GCC AGT GCC ТСС AGA-3 форм С с образованием активировàííîrо белка С;

АНС вЂ” последовательность аминокислотных остатков 212—

461 белка. С, однократно пост-трансляционно модифицированного, составляет активированную тяжелую цепь (АНС) активного белка С;

НС вЂ” тяжелая цепь двуцепочечной формы эимогена С, однократ" но пост-трансляционно модифицированного, состоит из аминокислотных остатков

200 - 461,.AP и АНС.

Зимоген С является предшественником сариновой протеаэы, синтезируемым в печени и присутствующим в крови..

Для проявления полной биологической активности белок С требует посттрансляционных модификаций, для которых необходим витамин К. Двуцепочечный, связанный дисульфидным мостиком, зимоген С образуется из одноцепочечного эимогена протеолизом.

Считается, что этот ограниченный протеолиэ включает в себя отщепление и удаление аминокислотных остатков

198 и 199. Активация двуцепочечного зимогена включает в себя протеолитическое расщепление пептидной связи .

ARG-LEU (остатки 211 и 212). Это последнее расщепление освобождает де173985

15

Таблица1

Однобуквенное сокращение

Фенилаланин

РНЕ

LEU

Лейцин

Иэолейцин

Метионин

Валин

Серии

Пролин

Треонин

Аланин

Тирозин

Гистидин

Глутамин

Аспарагин

Лизин

ILE SER

PRO

ALА

HIS

GLN е

ASN

LYS

ASP

Аспарагннов ая кислота .

Глутаминовая кислота

GLU

CYS

Цистеин

Триптофан

Аргинин

Глицин

GLU

55 капептид (остатки 200 — 211), активационный пептид, составляющий аминоокончание большей (тяжелой) цепи дву" цепочечной молекулы знмогена. Белок

С содержит около 23Х углеводов. Белок

С содержит также больщое количество необычных аминокислот, включая -карбоксиглутаминовую кислоту и Pr-оксиаспарагиновую кислоту, t - карбоксиглутаминовая кислота (gIR) образуется

f-глутамилкарбоксилированием из остатков глутаминовой кислоты с помощью микросомальной карбоксилазы.

Аминокислотные остатки в описываемых белках и пептидах имеют сокращения, приведенные в табл.1.

Трехбук- Аминокислотный венное остаток сокращение

4 10

Описано несколько способов получения нативного эимогена человеческого белка С. Зимогенная форма человеческого белка С, полученная техно-, логиеи рекомбинантной ДНК, идентична эимогенным формам человеческого белка

С; естественно присутствующим в человеческой крови, и активируется в теле лишь естественным путем, включающим тромбин-тромбомодулиновый комплекс.В данном изобретении предлагаются зимогенные формы человеческого белка

С, которые могут активироваться

in vivo одним тромбином с клинически значительной скоростью. Кроме, того, зти эимогенные формы легче подвергаются активации тромбин/бромбомодулином, чем нативный зимоген человеческого белка С.

В изобретении предлагаются также рекомбинантные ДНК, которые кодируют пре-препептид, содержащий сигнальный пептид для направления секреции и пропептид из g-карбоксилированного белка.

Рекомбннантные ДНК по. данному изобретению включает в себя также последовательность, кодирующую легкую цепь человеческого белка С, расположенную в трансляционной структуре считывания сразу за последовательностью, кодирующей пре-пропентид.

: Легкая цепь человеческого белка С содержит аминокислотные последовательности 43-197 белка С. АминоконI цевые части витамин К-зависимых плазменных белков, такие как аминоконцевая часть легкой цепи белка С, ответственны за связывающую кальций активность этих белков.

Рекомбинантные ДНК по данному изобретению включают в себя также последовательность, кодирующую дипептид LGS-ARG (KR) расположенный в трансляционной структуре считывания сразу эа последовательностью, кодирующей легкую цепь. Дипептид LYS-ARG расположен на карбокси-концевом участке легкой цепи.

Зимогенные формы.по данному изобретению отличаются от.нативных зимогенных форм человеческого белка С.

В нативном человеческом белке С, имеется следующий активационный пеп-. тид:

200 201 202 203 204 205 2)6 2 7 2Р8 209 210 211

ASP-THR-GLU-ASP-GEN-GLU-ASP-GLN-Чй-A)P-PRO-AkG, 1739854

10

LEU THR SER LEU LEU LEU PKE UAL ALA THR TRP CLY ILE

НУ-Икт TRP CLN

SER CLY THR

PRO АЬА PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER -SER GLU ARC

ALA 1ПБ GLN ЧА1 LEU ARG ILE ARC LYS ARC ALA ASN SER PHE LEU GLU

GLU.LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN ЧАЬ ASP ASP THR LEU

ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

PRO CYS ALA SKR IEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE

LEU GLU HIS

ASP GLY ILE

ARG PHE CYS

GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP CLU GLY

GLN ARG GLU УАЬ SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN

THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

GLY GLY CYS

SER CYS ALA

PRO АЬА VAL

LYS ARC SER

PRO GLY TYR LYS LEU GLY ÀSÐ ASP LEU LEU GLN CYS HIS

LYS РНЕ PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG ИЕТ GLU LYS

HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL

Rg Rg ARG LEU ILE йз GLY LYS ИЕТ THR ARG ARG GLY ASP SER PRO

TRP GLN VKL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA С73 GLY ALA

VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP UAL LEU THR ALA ALA HIS CYS NET ASP

GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG

TRP GLU LXS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE UAL HIS где числа соответствуют положению аминокислотных остатков в белке С. В данном изобретении описывается замена остатка ASP в положении 209 на один из следующих остатков: РНЕ, СЬУ, TYR или TRP что приводит к соответствующей зимогенной форме, имеющей большую чувствительность к расщеплению одним тромбином, кроме повышенной чувствительности к расщеплению тром--. бин-тромбомодулиновым комплексом.

Другие замены аминокислот наряду с заменами в положении 209 могут также повышать чувствительность результирующего зимогена к действию тромбина. Выражение результирующий зимоген" означает, что хотя замены описаны с указанием положения аминокислотных остатков в выделившемся человеческом белке С» однако выделившийся человеческий белок С должен быть сначала секретирован (что приводит к отщеплению аминокислотных остатков 1 — 42) с образованием зимогенной формы. Замена пролинового остатка в положении 2 10 в выделившемся человеческом белке С на валин, кроме одной из четырех описанных выше замен в положении 209, приводит к новому зимогену. Замена остатка аспарагиновой кислоты в положении

214 белка С, наряду с одной из описанных выше замен в положении 209 и с заменой, описанной для положения

210, нли без такой замены, на остаток аспарагина также приводит к получению нового зимогена.

Tàêèì образом, предпочтительные новые зимогенные формы человеческого белка С образуются в результате секреции и обработки молекул вЫцелившегося человеческого белка С со сле-, дующей аминокислотной последовательностью:

13 1 739854 14

PRO ASN TYR SER .IYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

LEU.АЬА GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR П.Е VAL PRO ILE CYS LEU

PRO ASP SiR GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU

THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA

LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE П.Е LYS ILE PRO VAL VAL

PRO.HIS ASN GLU CYS SER GLU ЧА1 ИЕТ SER ASN ИЕТ VAL SER GLU ASN

ИЕТ LEU CYS ALA .GLY — П."Е LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

ASP SER GLY GLY PRO .ИЕТ ЧАЬ ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU

VAL GLY IKU VAL. SER TRP Я,У GLU GLY CYS GLY ЕЕП LEU HIS ASN TYR

GLY VAL TYR THR LYS ЧАi. SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS

ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH, Продолжение табл. 2

Плазмида pLPC-167G является иллюс-. тративным вектором экспрессии, в котором кодаи аспарагиновой кислоты в положении 209 белка С заменен на ко.дон для глнцина. Конструирование плазмиды pLPC-1670 описано в примере

3. Существенно, что конструирование

®О включает в себя сайт-сиецифичный мутагенез последовательности, кодирующей белок С. Часть последовательности, кодирующей белок С, вставляют в в фаг М13шр18 и изменяют сайт-специфичным мутагенезом. Подвергнутую мутагенезу кодирующую последовательность клонируют затем в эукариотном клонирующем векторе для получения плазмиды pLPC-167G, идентичной плаз

Таблица 2

Соедине ние

Положе н не

214

209

210

PHE

PHE

РНЕ

PRO

PRO

VAL

ASP

ASN

ASP где Rg является PHE, GLY, TYR или

ТКР3 R представляет собой PRO или

VAL; R3 представляет собой ASP нли

ASN., Кодирующие последовательности мо гут быть легко сконструированы, исходя из последовательности, кодирующей белок . С, из которой сайт-специфическим мутагенезом должен быть удален участок, кодирующий AP. Схематически эту кодирующую последовательность можно представить в виде следующей структуры:

Эту кодирующую последовательность вставляют в вектор для получения плазмиды pL APC.

Аминокислотные последовательности, кодируемые в положениях 209, 210 и

214 в предпочтительных кодирующих. последовательностях, представлены в табл.2.

5

7

35 11

12

13.

14

40 16

PHE

GLY

GLY

GLY

GLY

TYR

TYR

TYR

TYR

TRP

TRP

TRP

TRP

VAL

PRO

PRO

VAL

VAL

PRO

PRO

VAL

VAL

PRO

PRO

VAL VAL

ASN

ASP

ASN

ASP

ASN

ASP

ASN

ASP

ASN

ASP

ASN

ASP

АЯЧ

15 17З миде pLAPC, за исключением того, что имеется вставка последовательности, кодирующей активационный пептид, в . котором кодон для глицина заменен на кодон для аспарагиновой кислоты в положении 209.

В случае соединений по предлагаемому способу, где остаток аспарагиновой кислоты в положении 214 заме-. нен на остаток аспарагина, производное белка С, получаемое при активации зимогенной формы, также является соединением по данному изобретению.

ДНК по данному изобретению могут быть также синтезированы химически или соединением рестрикционных фрагментов, либо сочетанием способов, известных в данной области.

Иллюстративные векторы по данному изобретению, плазмиды pLPC-1676 и

pLPC-1670 содержат BK-усилитель, стимулирующий транскрипцию аденовирусным основным поздним промотором. Большое .число эукариотных промоторов, усилителей и векторов экспрессии известно в данной области и может быть использовано в предлагаемом способе. Эукариотный вектор экспрессии может также функционировать без усиливающего элемента. Суть данного изобретения не связана с конкретным усилителем или промотором, используемым для стимуляции экспрессии зимогена белка С, а скорее определяется новой кодирующей последовательностью и соответствующими белками, получаемыми из такой последовательност и.

Однако выбор векторных элементов таких как промоторы, усилители и селективные маркеры, может оказать сильное влияние на максимальные кон-. центрации белка, вырабатываемого клеткой"хозяином.

Выбор клеток-хозяев зависит от конкретного вектора экспрессии, используемого для экспрессии .ДНК-соединений, кодирующих белков C. Поскольку белок С и производные белка

С согласно предлагаемому способу подвергаются значительной пост-трансляционной модификации, то некоторые клетки-хозяева более предпочтительны для использования с векторами по данному изобретению. Известно, что трансформированные аденовирусом чело-. веческие эмбриональные почечные клетки предпочтительны для испольэо 1, вания при рекомбинантном получении

9854

-карбоксилированных белков, таких

3 как человеческий белок С. Одна такая трансформирования аденовирусом линия клеток человеческой эмбриональной почки представляет собой линию клеток 293, доступную s ATCC под номером АТСС CRL 1573.

Однако преимущества при получении (-карбоксилированного белка, такого как зимоген человеческого белка С в линии клеток, трансформированных аденовирусом, не ограничиваются чело- . веческими почечными эмбриональными клетками, трансформированными аденовирусом. Фактически, как правило, трансформированные аденовирусом клетки являются отличными хозяевами для получения -карбоксилированного че20 ловеческого белка С. Одной из особенно предпочтительных клеточных линий этого типа является АЧ 12-664 (далее обозначается как AV 12) клеточная линия, доступная в АТСС под

2 номером АТСС СЫ 9595, Клеточная линия AV 12.получена инъекцией человеческого аденовируса 12 в шею сирийского хомяка и выделением клеток результирующей опухоли.

Экспрессия кодирующих последовательностей человеческого белка С, содержащихся в векторах по данному изобретению, происходит в тех клетках-хозяевах, в которых промотор связан со структурными генными функ35 циями.

Векторы pSV 2-типа включают в себя сегменты генома SV 40, содержащего определенный эукариотный промоторединицу-{ер), последовательность вве40 дения (IVS) и полиаденомный (pA) сайт. При отсутствии Т-антигена SV 40 плазмидные векторы pSV 2-типа трансформируют клетки-хозяева млекопитающих и другие эукариотные клетки интегрированием в хромосомную ДНК клеток-хозяев.

Вырожденность генетического кода позволяет заменить нуклеотиды в участках, кодирующих полипептид, а

®О также в трансляционном стоп-сигнале без изменения последовательности, кодирующей полипептид. Такие последовательности могут быть выведены иэ известной аминокислотной или ДНК-.последовательности человеческого белка

С и могут быть сконструированы по обычным синтетическим или сайт-специфичным мутагенным методикам.

1 739854

Основным недостатком активированного белка С, как и любых активированных сериновых. протеаз, является его короткое время полураспада (Т1/2) по сравнению с зимогенным предшественником. Причиной более короткого биологического полураспада активированных сериновых протеаз, включая активированный белок С, являются сложные }Q процессы, вовлекающие клеточные и .гуморальные механизмы. Активированные сериновые протеазы образуют также . комплексы с ингибиторами сериновых протеаз, в норме присутствующими в 15 плазме. Активированный белок С (APC) комплексуется с АРС-ингибитором, а также с альфа-2-макроглобулином. Неактивные зимогены, включая зимогены белка С по данному изобретению, не 20 реагируют с ингибиторами сериновых протеаз.

Преимущество предлагаемых зимогенов С заключается в том, что они лучше активируются тромбином, чем зимоген нативного белка, поскольку для активации зимогенов в присутствии

Са отсутствует абсолютное требова2t ние комплексования тромбина с тромбомодулином. Это означает, что эти 0 зимогены С после введения могут активироваться в местах внутрисосудистого образования тромбина, т.е. в любых зонах развития внутрисосудистых тромбов, Таким образом эти рекомби-. нантные зимогены белка С могут быть использованы как превентивные ле-, карства и будут при этом активироваться только в местах образования тромбов. Так как зти чувствительные к тромбину зимогены могут вводиться.

46 в зимогенной форме, то они не будут образовывать комплексы с ингибиторами белка С и будут обладать биологи-. ческим временем полураспада, равным таковому времени для .зимогена нативного белка С.

Рекомбинантные зимогены белка С . по данному изобретению пригодны для предупреждения и лечения широкого спектра заболеваний, включая внутри50 сосудистое свертывание, в том числе глубокий тромбоз вен, легочньй эмболизм, периферийный артериальньй тромбоз, змболиэм, возникший в сердце и периферийных артериях, острьй инфаркт. миокарда, тромботические . удары и диссеминирующий внутрисосудистьй тромбоз

По сравнению с активированным белком С дозы зимогенов белка С по данному изобретению из-за их увеличенного Т1/2 могут быть значительно снижены при клиническом применении. При гомозиготном дефиците белка

С доза зимогена белка С по данному изобретению находится в интервале приблизительно 5 — 100 мг на одно лечение, а при гетерозиготном дефиците белка С вЂ” в интервале около

2,5 — 50 мг на лечение.

Хорошим терапевтическим показакием для активированного белка С является предотвращение глубокого тромбоза вен и легочного эмболизма.

Зимогены белка С по данному изобретению могут быть использованы при лечении змболий, происходящих от тромбов в периферийных артериях, преимущественно в каротидных артериях.

Зимогены по даннойу изобретению пригодны также для лечения острых инфарктов миокарда. В острой фазе инфаркта миокарда эти зимогены можно вводить вместе с активатором тканевого плазминогена.

II р и м е р 1. Контсруированиеплаэ миды pLAPC..

А. Выделение ДНК-.фрагмента, кодирующего пептиц белка С.

Плазмида РНС7 содержит полную кодирукщую последовательность белка С.

1 л L-бульона (10 r пептона, 10 г

NaCl 5 r дрожжевого экстракта), содержащего 15 мкг/мл тетрациклина, засевают культурой Escherichià coli

К12 RR}/рНС7, инкубируют со встряхиванием при 37 С до достижения опти0 ческой плотности (О,D.) при 590 нм приблизительно 1 и прибавляют 150 мг хлорамфеникола. Инкубирование продолжают 16 ч; добавление хлорамфеникола ингибирует синтез белка и дальнейшее деление клеток, но позволяет плазмидам по-прежнему реплицироваться.

Культуру центрифугируют, супернатант отбрасывают, клеточную массу промывают 40 мл TES-буфера (10 мМ трис-HCl,ðÍ 7,5; 10 MM NaCl и 1 мМ

ЭДТА) и затем снова осаждают центрифугированием. Супернатант отбрасывают, клеточную массу замораживают в бане сухой лед - этанол и затем . оттаивают. Оттаявшую клеточную массу ресуспендируют в 10 мл раствора

19 173 25% сахарозы 50 мИ ЭДТА, прибавляют

1 мл 5 мг/мг раствора лизоцима; 3 мл

О, 25 И ЭД ГА, рН 3,0 и 100 мкл 10 мг/

/мл РНК-азы А и проводят инкубирование во льду в течение 15 мин. 3 мл лизирующего раствора (3 мл 10% тритон-X

100; 75 мл 0,25 M ЭДТА, рН 8,0; 15 мл

1 М трис-НС1 и 7 мл воды) прибавляют к обработанным лизоцимом клеткам, перемешивают и инкубируют на льду в течение 15 мин. Клетки замораживают в бане сухой лед — этанол, оттаивают,, центрифугируют в градиенте хлористого цезия. Выделяют плазмидную полосу, наблюдаемую в УФ-свете. Ппазмид-ДНК экстрагируют.

1 мг ДНК плазмнды рНС7 суспендируют в 1 мл ТЕ-буфера (10 мИ трис-НС1, рН 7,6 о и 0,1мМ ЭДТА) и хранят при - 20 С.

7 мкг ДНК плазмиды рНС7 гидролизуют ферментом Sst 1, а затем рестриктазой Sal I. Sst I — Sal I фрагмент экстрагируют сначала фенолом, .затем хлороформом, собирают осаждением этанолом, центрифугируют и суспендируют в 15 мкл ТЕ/10-буфера (10 мИ трис-основания, рН 7,6 и

0,1 мМ ЭДТА).

Смесь подвергают электрофорезу в

0,6% агарозном геле с низкой тем" пературой гелеобразования 2 — 3 ч приблизительно при 130 В и 65 мА в трис-ацетатном буфере. Гель окрашивают в растворе этидий бромида и полосу ДНК, составляющую около 0,7 т.п.о., вырезают из геля в виде маленького сегмента. Сегмент расплавляют инкубированием при 72 С.„В объеме около 400 мкл получают приблизительно 0,5 мкг рестрикционного фрагмента Sst Х - Sal I плазмиды рНС7 длиной около 0,7 т.п.о. Дополнительную очистку ДНК проводят пропусканием раствора ДНК через колонку NaCS-ðãå рас® (ВВ1 ) в соответствии с инструкцией. Очищенный фрагмент ресуспендируют в 15 мкл деионизированной воды.

В. Конструирование рекомбинантного фага и удаление ДНК, кодирующей активационный пеп гид, сайт-специфичным мутагенезом.

Около 1 мкг репликативной формы

:(RP) ДНК фага M13 m Р18 обрабатывают рестриктазами Ззс Т и Sal I, Два

- фрагмента, получившиеся в результате . расщепления, разделяют в 0,6% геле из агазоры с низкой температурой ге9854 20 леобразования, больший фрагмент вырезают из геля и очищают.

О, 1 мкг Sst I — - Sal I фрагмента плазмиды рНС7 длиной около 0,7 т.п.о. лигируют с 5 мкл Sst I — Sal I — обработанной И13 m р18 RZ ДНК в 2 мкл

10Х-лигазного буфера, (0,5 M трис-НС1, . рН 7,8; 60,8 мИ И@С1,, 0,3 М-дитиот1р реитол /DTT/), 2 мкл 1 мг/мл BSA

1 мкл 25 мМ АТР, 1 мкл (около 400 ед. )

; T4-ДНК-лигазы (NEB) и 2 мкл воды.

Около 300 мкл культивированной в течение ночи культуры Е.coli К12

15 М101 используют для засевания 30 мл

2Х-TY-бульона (TY-бульон — это 10 г/л триптона, 10 г/л NaC1 и 5 г/л дрож-. жевого экстракта) и результирующую о культуру инкубируют при 37 С и аэрировании до достижения О.D,400 около

0,5. Культуру 10 мин охлаждают на ледяной бане, собирают центрифугированием и снова суспендируют в 15 мл холодного 10 MM NaC1. Клетки снова собирают центрифугированием и суспендируют в 15 мл холодного 30 мИ

CaC1 ; 200 мкл клеток отделяют, добавляют к 9 мкл полученной выше лигированной ДНК и инкубируют на льду

ЗО приблизительно 30 мин. Затем ДНК-клеточную смесь инкубируют при 42 С

2 мин и прибавляют. к 3 мп топ-агара (TY-бульон с 0,5% агара, поддерживаемого в виде расплава при 45 С), содержащего также 50.мкл 2% Х-Са1 (Х-Са1 это 5-бром-5-хлор-3-индолил-/3D-галактопиранозид), 50 мкл 100 мИ

„АРТА (IPTG — это изопропил-P-D-тиогалактопиранозид) и 100 мкл Е.coli

46 К12 ХИ101 в логарифмической фазе роста. Затем смесь топ-агар/клетки помещают íà TY-агаровые пластинки и инкубируют пластинки ночь при 37 С. о

Наследующее утро четыре явные

45 колонии раздельно используют для засева 2 мл 2Х TY-бульона и результирующие культуры инкубируют при 37 С и аэрировании 6 ч. Затем культуры центрифугируют и 500 мкл результирующего супернатанта (клеточную массу используют для получения фаговой ДНК для анализа с помощью рестриктаз) прибавляют к 500 мкл культуры (О.D.iso:0,5) К.coli К12 Ц1101 и .50 мп 2Х ТУ-бульона. Эти культуры ин-: кубируют ночь при 37 С. RF ДНК фага выделяют из клеточной массы по упрощенной методике по примеру 1А без антибиотика в культуральной среде и

1739854

22

10

5 -GGGCAGTCACCTGAAACCACTGATTGATGGGAACATGA-3

E стадии ультрацентрифугирования заменяют экстракциями фенолом и хлороформом. Трансформанты содержащие ДНК: фага M13 m р.18-HEI, идентифицируют рестрикционным ферментным анализом их фаговой ДНК.

После ночи культуры центрифугируют и к 5 мл супернатанта прибавляют около 1 мл раствора, содержащего 20 Х . полиэтиленгликоля .(PEG) 6000 и 2,5.мМ

NaCl, и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Смесь центрифугируют, результирующий осадок, содержащий однонитевую ДНК фага М13 m р:18- IEI снова суспендируют в 500 мкл

TES-.,буфера (20 мМ трис-НС1, рН 7,5; О, 1 ИЭДТА; 10 MM NaC1). Раствор ДНК

30 пмоль этого фрагмента индивидуаль" но обрабатывают 5 ед. Т4-полинуклеотидкиназы в 10 мкл- IX-киназного буфера (100 мМ трис-НС1, рН 8,3, 10 мИ

ЭЭТ; 100 мМ И8С1 ), содержащего 1 мкл

1 MN ATP 30 мин при 37 С и затем инкубируют 10 мин при 65 С и замораживают. Обработанные киназой ДНК используют для описываемого ниже мутагенеза.

На первой стадии мутагенеза мутагенный олигонуклеотид и универсальный праймер М13 ренатурируют в одноните- вую фаговую ДНК. Ренатурирование .проводят, прибавляя 300 нг (0,5 мкл) однонитевого фага М13mp18-HEI к 1 пмоль (1,2 мкл) универсального праймера, 1 пмоль (0,3 мкл) мутагенного олигонуклеотида, 2 мкл 10Х-ренатурационйого буфера (100 мМ трис-НС1, рН 7,5;

1 мИ ЭДТА и 500 мМ NaC1) и 16 мкл воды, инкубируют смесь при 80 С 2 мин и затем 5 мин при 50 С, затем дают о смеси остыть до комнатной температуры.

После ренатурации олигонуклеотидов фаговую ДНК делают двунитевой, расширяя праймеры ДНК-полимеразой.

Эту реакцию проводят, прибавляя

3 мкл 10Х-расширяющего буфера (500 мМ

:трис-НС1, рН 8; 1 мИ ЭДТА и 120 мИ

21@С1 ); 3 мкл 10 Х-лигазного буфера;

1,3 мкл 0,2 мИ DTT; 3 мкл.dNTP-смеси (0,5 мИ каждой dNTP) 1,2 мкл 25 мИ

АТР; 0,5 мкл фермента Кленова (5 ед/

: /мкл, ВМВ); 1 мкл Т4-ДНК-лигазы (400 ед., NEB) и 19,8 мкл воды к сме си ренатурированной ДНК. Расширение

45 экстрагируют сначала хлороформом, за. тем дважды ТЕ-насыщенным фенолом и затем снова хлороформом. Однонитевую

ДНК осаждают с помощью NaOAc и этанола, центрифугируют, промывают 70Хным этанолом.

Осадок высушивают и растворяют в 80 мкл воды. Этот образец фага используют на следующей стадии сайт- . специфичного мутагенеза для удаления

ДНК, кодирующей активационный пептид.

Фмагмент аднонитевой ДНК, используемый для мутагенеза при удалении

ДНК, кодирующей активационный пептид, получают на автоматическом

ДНК-синтезаторе в следующем виде: проводят инкубированием при комнатной температуре в течение 30 мин, о затем 4 ч при 37 С и в течение ночи при 4 С.

Реакцию останавливают экстракцией . фенол-хлороформом и ДНК осаждают этанолом с ацетатом натрия (NaOAc). ДНК собирают центрифугированием, суспендируют в 40 мкл 8Х-буфера (0,3 И

NaC1; 0,03 N NaOAc, рН 4,5 и 0,3 мИ

ЕпС1 ) и. прибавляют к раствору ДНК.

Установлено, что SI-обработка не об.ладает существенными преимуществами и в методиках конструирования, описываемых в последующих примерах, SI-обработка полностью исключена.

Раствор ДНК разделяют в две пробирки на две равные части и в одну из пробирок прибавляют 100 ед. (ВМВ)

SI-нуклеазы. SI-реакцию проводят ин кубированием 5 мин при комнатной температуре и останавливают зкстрагированием реакционной смеси ТЕ-насыщенной смесью фенол-хлороформ (50:50).

Осадок ДНК суспендируют в 60 мкл воды и трансформируют в E.ñîЫ К12

?И101..Мутантов отбирают с помощью радиоактивно меченного . мутагенного олигонуклеотида, .5 »ТС AAACCACTCATTGA-3 и точечных гибридизаций.

Несколько положительно гибридизированных пятен отбирают и высевают в

2 мл культуры Е.coli К12 ТИ101, находящейся в логарифмической стадии роста. Культуры инкубируют .при 37 С о и аэрировании около 6 ч и затем ис23

24

1739854 пол ьз уют для получения од но ни те вой

ДНК.

Однонитевую ДНК секвентируют.

Несколько фагов идентифицируют целевой мутацией. Фаг, в котором удапена последовательность, кодирующая активационный пептид, это целевой фаг

И13 mp18-НЕ2. Мутация в фаге М13

mp18-НЕ2 вызывает уменьшение размера на 36 пар оснований по сравнению с природной кодирующей последовательностью и эту разницу можно использовать для идентификации ДНК, содержащей мутировавший.участок. RF-форму::. фага М13 mp 18-НЕ2.получают последующим конструированием.

С. Конструирование плазмиды рЬАРС из Фага М13 mp18-НЕ2 и плазмиды pLPC.

Бзс I — Sal I фрагмент (около.

0,7 т.п.о.) RF-формы фага М13 mp18-НЕ2 отрезают от фага и выделяют по методике примера 1А.

Три ДНК-фрагмента связывают вместе с получением плазмиды pLAPC: Бзс

Sal I Фрагмент фага М13 mp18-НЕ2 (около 0,7 т,п.о.) и 2 ДНК-фрагмента плазиицы pLPC. Поскольку в. плазмице

pLPC находятся сайты рестриктаз Sal Х, Ssr I и Есо RI, то целевые рестрикцнонные фрагменты Есо RI - Sal I u

Есо RI — Sst I нужно получать двумя отдельными расщеплениями.

Бзс Х вЂ” Eco RI расщепленную ДНК суспендируют в воде и помещают в

0,6Х гель из агарозы с низкой темпе ратурой гелеобразования для отделе . ния ДНК-фрагментов.

Для получения EcoR I †. Sal Iфрагмента. около 15 мкг плазмиды рЬРС сначала обрабатывают рестрикционным ферментом Apal для удаления загрязнений близкими по размерами, рестрикционными фрагментами. Затеи рестриктазы Sal I„ EcoR Х добавляют к раствору ApaI-расщепленной ДНК плазииды

pLPC и результирующую смесь инкубируют. АраХ-Sal I-EcoR Х расщепленную

ДНК плазмиды pLPC сначала экстрагируют фенолом, затем хлороформом, собирают осаждением этанолом и центрифугированием. Суспендируют в воде,, помещают в 0,67 агароэный .гель и раз-, деляют электрофорезои.

Рестрикционные фрагменты EcoR I -.

Sal I (около 3 ° 76 т.п. о.) и EcoR IБзп Х,(около 2,0 т.п.о.) вырезают из геля и выделяют.

Каждый из двух очищенных рестрикционных фрагментов прибавляют к

Sst I — Sal I-рестрикционногз фрагмента (около 0,7 т.п.о.) фага М13

mp18-.НЕ2 и лигируют, получая в ре-, зультате целевую плазмиду pLAPC.

Плазмида pLAPC отличается от плазмиды рЬРС отсутствием ДНК, кодирующей

10 активационный пептид.

Плазмиду pLAPC трансформируют в

Е.coli K12 RV308 и выращивают. Трансформанты Е.coli К12 RV308/

/pLAPC подтверждают рестрикционным ферментным анализом. Ппазмидную ДНК получают из трансформантов Е. co li

К12 RV308/PLAPC практически так же,. как в примере 1А, за исключением того, что в качестве селектийного

20 агента используют 50 мкг/мл ампициллина, а не тетрациклина.

П. р и м е р 2. Конструирование плазииды pLPC.

Плазмиду рЬРС используют как про25 иежуточный вектор при конструировании плазмиды pLAPC. Плазмида pLPC содержит сегмент ДНК, кодирующий ВК.-вирусный усилитель и поздний промотор аденовируса 2, ведущие экспрессию человеческого белка С. Конструирование плазмиды pLAPC в основном приводит к замене последовательности, кодирую" щей человеческий белок С в плазмиде

pLPC, на другую. последовательность кодирующую белок С, на которой удалена ДНК, кодирующая активационный пептид.

В примере 2В описано конструирова-. ние плазмиды рВК пео1, получаемой

40 вставкой ВК-усилителя в плазмиду pdBPV-ИИТ пео. В примере 2С описано конструирование плазмиды рЬРсас, получаемой вставкой позднего промотора аденовируса 2 в плазмиду pSV2cat.

43 примере 2F описано конструирование плазмиды pBLcat, содержащей ВК-усилитель для повышения активности позднего аденовирусного промотора. В примере 2Е описано конструирование плазмиды pL133, вектора экспрессии белка С, начиная с исходной плазмиды рНС7 через Конструирование промежуточной пл