Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей фермент деацетоксицефалоспорин с синтетазу/деацетилцефалоспорин с синтетазу

Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей фермент деацетоксицефалоспорин с синтетазу/деацетилцефалоспорин с синтетазу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение касается получения плазмид, кодирующих фермент с активностью деаДектосицефалоспорин С синтетазы и деацетилцефалоспориа.С синтетазы. Сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК , рТТ507, pLT511, pPS58, pPS359, pPSbO, pPS61, pPS62, pIL502, обеспечивающие экспрессию DAOCS/DACS в клетках Escherichia co- li, Penicillium chrysogenum и Cepha- losporum acremonium.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 М 15/52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4355306/13 (22) 03.03.88 (31) 021836 (32) 04.03.87 (33) US .(46) 07.06.92. Бюл. ¹ 21 (71) Эли Лилли Энд Компани (US) (72), Томас Доминик Инголиа, Стефен

Виатт Квййер, Сьюллен Мэри Сэмсон и

Пол Латер Скэтрад (US) (53) 575.224.2; 577 ° 2(048) (088.8) Изобретение относится к генетической инженерии, касается получения . ппазмидных ДНК, кодирующих фермент с активностью деацетоксицефалоспорин С синтетазы (DAOSC) и деацетилцефалоспорин С синтетазы (DACS).

DAOCS катализирует реакцию, в которой из пенициллина N образуется (DAOS) и является экспандазой; DACS . катализирует образование деацетилцефалоспорина (DAS) и DACS по реакции гидроксилирования. Эти реакции являются основными этапами биосинтеза важных антибиотиков, таких как цефалоспорины из Cephalosporium acremo.nium и 7 g-метоксицефалоспорины из . Streptomyces c1avu1igerus.

Фрагмент ДНК, кодирующий активность DACS/DAÎCS, выделяют из геномной ДНК Cephalosporium acremonium и»

„„ЯЦ„„1739856 АЗ

2 (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК,КОДИРУЮЩЕЙ

ФЕРМЕНТ пЕАЦЕТОКСИЦЕФАЛОСНОРИН С СИН

ТЕТАЗУ/ДЕАЦЕТИЛЦЕФАЛОСПОРИН С СИНТЕТАЗУ (57) Изобретение касается получения плазмид, кодирующих фермент с активностью деацектосицефалоспорин С синтетазы и деацетилцефалоспорин;С синтетазы. Сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК., рТТ507 pI T511, рР$58, pPS359, рРЗЬО, pPS61, рР$62, рП 502, обеспечивающие экспрессию

ВАОС$/DACS в клетках Escherichia coli, Penicillium chrJJsogenum H Cephalosporum acremonium. используют для построения векторов экспрессии, .которыми трансформируют штаммы ЕзсЬегхсЬха со11..

Сырые клеточные экстракты из трансформированных E.coli проявляют активность DAOCS/DACS без .какой-либо предварительной активации. Сконструированные в кторы и трансформанты обеспечивают эффективное получение больших количеств активного фермента DAÎCS/DACS. фермент DAOCS/DÀÑS можно применять для продуцирования рАОСИ и DACS и дли гидроиоилирораииа фр цефалоспоринов для образования новых (ф антибиотиков.

Рекомбинантные плазмидиые ДНК могут быть использованы для создания штаммов Penicillium, "Cephalosporium> продуцирующих пенициллиновые и цефалоспориновые антибиотики.

39856 4 способах построения векторов экспрессии при трансформации широкой разноя видности организмов, продуцирующих пенициллиновые и цефалоспориновые антибиотики.

ДНК, кодирующие DACS/DAOCS, вьщеляют с регуляторными последовательностями, которые контролируют транскрипцию. Описаны новые регуляторные последовательности, которые могут использоваться в новых способах для обеспечения трансляции и транскрипции любого генного продукта в Cephalosporium. Эти регуляторные последовательности особенно эффективны в С.acremo- .

nium.

Описаны регуляторные сигналы гена

DACS/DAOCS, расположенные у 3 -конца 0 кодирующего гена DACS/DAOCS Cephalosporium acremonium. Эти 3 -регуляторные

t последовательности кодируют термийацию транскрипции и полиапенилирование

-PHK, а также сигналы обработки гена

DACS/DAOCS. Помещение этих сигналов в 3 -конце гена усиливает экспрессию

I гена в Cephalosporium.

10 20 . 30: 40,, 5 -А АСС TTG TAC GGA GAA TTA AGG СТТ GCA CGA ТТС САТ GGC GGT СТС

50 60 70 80 . 90

GAC.GAT CAG GGA ССА TGC АСС АТА CAT АТТ СТС CTG CGA ACC AAG ААС

100 .. 110 . 120 . 130 140

° GAG AAG AGA АСТ CGA TGG CTT СТТ ATG АТТ CGT TGA САА ААС ТТС ACA

150 . 160 170 180 . 190 .

AGA САС TCG TGG GTT ТАС AAT GCT АСА TTG ACG TGT GCG GCC AAG GCT

GAG GGG

200 210

AAG CAG GGC GTC ACT ТАС GGC ТАА GTA GCA GTT GTC Т

220 230

240 : 250 260 270

60А GTT ССТ СС6

С G CGT AAG СТА CGA GGT GGG GTT TGA GAT ATA ТАТ АТА

270 280

290 300 310

CCG CTT TGA САА С

340 350 360

С Т ТТС GTT СТС ACT. GGG ATC TTG TGA АТС CTT

ТТС CTC TTG CAG AAC ТТТ ССТ ССА CGC ТАС ТСС ТСТ САА GTC АТС GCT

3 17

В предлагаемом описан усовершенствованный способ трансформации Penicillium рекомбинантными ДНК. Эта нова система трансформации использует amds ген Aspergillus nidulans. Используя ацетамид (CH>CONHz как единственный источник углерода или азота на пластинах трансформации, можно отобрать клетки хозяина Реп сд11 шп, трансформированные вектором, содержащим ген

amds, от нетрансформированных, которые не в состоянии расти на данных ппастинах ввиду того, что клетки хозяина Penicillium дикого типа не выражают .активность ацетамидазы.

Предлагаемые рекомбинантные плаз» мидные ДНК могут быть использованы для получения штаммов Paecilomyces s

Streptomyces, в частности S.clavuligerus, которые экспрессируют DAOCS/

/DACS Хотя ДНК, кодирующую DACS/

/ЭАОСБ, выделяют из Cephalosporium асгешопхшв, плазмидная ДНК, содержащая этот ген, может быть использована для построения векторов экспрессии .DACS/DAOCS в широкой разновидности клеток хозяев. Большинство организмов, которые продуцируют пенициллины и цефалоспорины, используют общйй пред- " шествующий пенициллин N, субстрат для

DAOCS. Фрагменты ДНК, кодирующие

DACS/ПАОСЗ, могут использоваться в

Последовательность ДНК штамма Brotsu Cephalosporium acremonium, кодирующая как активность DACS так и активность DAOCS представлена в виде .

400 410 420

390

AAC CAC AGC A7C ААС ATG ACT ТСС ААО

G GTC ССС GTC ТТТ CGT СТС

ИЕТ THR SER LXS VAL PRO VAL РНЕ ARG LEU

1739856

5 10

440 450 460 470

GAC GAC СТС AAG AGC GGC AAG GTC СТС ACC GAG СТС GCC ОАО GCC GTC

ASP ASP LEU LYS SER GIY LYS VAI, LEU THR GLU LEU AIA GLU ALA VAL

15 20 25

480 490 500 . 5 10 520

АСС АСС AAG GGT АТС. ТТС ТАС TTG АСС GAG AGC GGC CTG GTC GAC GAC

THR THR ТУБ GLY ILE PHE TYR LEU THR GLU БЕф GLY LEU VAL АЗР ASP

30 35 40

530 540 550 560 . 570

GAC САС АСС TCG GCG CGT GAG ACG TGC GTT. GAC ТТТ ТТС AAG ААС GGA

ASP HIS THR SER ALA, ARG GLU THR CYS VAL ASP PHE PHE LYS ASN GLY . 45 50 55

580 590 600 610 620

AGC GAG GAG GAG AAG AGG GCC GTG ACG СТС ССС GAC CGT ААС GCC CGC

БЕК GLU GLU GLU LYS ARG ALA,VAL ТНК LEU ALA. ASP ARG ASN ALA ARG

GCC СТС GAG TGG GAG

ALA LEU GLU TRP GLU

АСС GAG JHR GLU

TCG GAC ТАС TCG ACG

SER ASP TYR SER THR

AT.Ñ GGC

ILE GLY

105

720 730 740 750 760

GGC ААС CTG ТТС CCG ААС CGG GGC ТТС GAG GAC GTC TGG CAG GAC. ТАС

GLY ASN LEU PHE PRO ASM ARG GIY PHE GLU ASP VAL TRP GLN ASP TYR

110 115 120

770 780 790 800 . 810

ТТС ОАС CGC ATG ТАС GGC GCA GCC AAG GAT GTC GCG CGC 6СС GTT СТС

PHE ASP ARG ИЕТ TYR И7 АТА АХА LYS ASP VAL ALA ARG ALA VAL LKU

125 130 135

820 830

ААС ТСТ GTG GGC GCC CCG СТС

ASN SER VAL GLY ALA PRO LEU

140 145

870 880

GAG TGC GAT ССС СТС СТС CGC

GLU CYS ASP PRO LKU LEU ARG

155 160

GCC GGG GAG

ALA GLY GLU

890

СТА CGG ТАС

LEU ARG TYR

GAC CGC GTC GCC GAA GAG

ASP ARG VAL ALA GLU GLU

960 970

СТА TCG АСС АТС ACG СТС

LEU SER TER П.Е THR LEU

190

930 940 950

GAA CCC СТС CGC ATG GGA ССС САС ТАС GAC

GLU PRO LEU ARG ЛЕТ ИХ PRO НТБ TYR АБР

180 .:185

980 990 1000

GTG САС CAG АСА GCC TGC GCC ААС GGC ТТС

VAL HIS GLN THR ALA CYS ALA ASN GLY РИЕ

195 200

CGC GGC ТТС ТСТ

ARG GLY PHE SER

ACG GGC AAG ТАС

THR GLY LYS TYR

650 . 660

AGC АСС GCC GTC GTC

SKR THR ALA VAL VAL

700 710

TGC ТАС ТСС ATG GGC

CYS TYR SER ИЕТ 6ТУ

100

850 860

GAC ATT GAT GAC ТТС 6ТС

ASP ILE ASP ASP PHE ЧАХ

900 910

ТТС CCC GAA GTG CCG GAG

РНЕ PRO GLU VAL PRO GLU

165 170

1739856

GAC GGA GAA

ASP GLY GLU

ТТС TGC GGC

PHE CYS GLY

CAG TGC GAG GTG

GLN CYS GLU VAL

GCC ATG GTC GTC

ALA ИЕТ VAL VAL

225

1130 1140 1150

AAG САС CGG GTC AAG ТСТ ССС GGG

LYS HIS ARG VAL LYS SER PRO GLY

245 250

1180 1190

CGC ACG TCG AGC GTC ТТС ТТС CTG

ARG TER SER SER VAL PHE PHE LEU

260 265

1110 1120

ACG GGC GGC AAG GTC.AAG GCG ССС

THR GLY GLY LYS VAL LYS ALA PRO

235 240

1160 . 1170

CGC GAC CAG CGC GTC GGC AGC AGC

ARG ASP GLN ARG VAL GLY SER SER

255

1200 1210 1220 1230 1240

CGG CCG ААС ССС GAC ТТС AGC ТТС AAC GTG CAG CAG TCG AGG GAG TGG

ARG PRO LYS PRO ASP PHE SER PHE ASN VAL GLN GLN SER ARG GLU TRP

270 275 280

1250 1260 1270 1280 1290

GGT ТТС AAC GTC CGC АТС CCG TCG GAG CGC ACG ACG ТТС AGG GAG TGG

QLY PHE ASN VAL ARG 1ЕЕ PRO SER GLU ARG THR THR PHE ARG GLU TRP

285 290 295

1300 1310 1320 1330 1340

СТТ. GGC GGG AAC ТАТ GTC AAC ATG CGG AGG GAT AAG CCG GCG GCA GCG

LEU GLY GLY ASN TYR VAL ASN ИЕТ ARG ARG ASP LYS PRO ALA. ALA ALA

300 .305 310

1350 . 1360 1370 1380 1390

GAG GCG GCT GTC ССС GCG GCT GCC ССТ GTC ТСТ АСС GCA GCT ССТ АТА

GLU ALA ALA VAL PRO ALA АЬА ALA PRO VAL SER THR ALA А1 А PRO ILE

315 320 325 330

1400 1410 1420 1430

GCC АСТ TAG GGA АСС CGC CGA TCG AGT ААТ ААА ТСТ ACG GGA GTT ТАА

ALA THR

1440 1450 1460 1470 1480

GAA GAA AAA TTG ССС ТАТ ААА TTG CTA ААТ ТТТ TAA AAC ACA AAG CAT

1490 1500 1510 GAG TGT САА GAG ТТТ CAA GTT ТСА А-3 . 1010

GTG AGC CTG

VAL SER LEU

CTC ССС GGC

LEU PRO GLY

220

1040 1050

ТТС GTC GAC СТС CCG ACG

PHE VAL ASP LEU PRO THR

1090 1100

GCG GTC GGC ACC CTG GCC

ALA VAL GLY THR LEU ALA

230

39856

10 экспрессии фермента DACS/DAOCS в

E.coli.

Построение плазмиды pIT507 вклю5 чает сшивку Sst I — - Bani.HI фрагмента размером 2,2 кв, кодирующего DACS/

/DA9CS плазмиды pIT503 с 5,8 кв

Nde I — - Ban HI фрагментом плазмиды

pCZR336, и синтезированйым фрагментом "60 п.о. Sst .I — Nde

1О

Плазмида pCZR336 включает образованный от ЯрЬ промотор, последовательность, активирующую трансляцию, оператор гена cI857, первую функциональную единицу наследственности

l5 (Цистрон ), кодирующую небольшой у! пептид, и последовательность ДНК, кодирующую производное hGH. При низкой температуре, составляющей 30 С,.бе0 лок, копированный на плазмидах

pCZR336 и pI507, является активным и способен подавлять активность промотора А рЬ, но при повышении температуры да 42 С белок сХ857 инактивируется и промотор ускоряет транскрипцию большого количества мРНК, кодирующей hGEI (pCZR336) или DACS/DAOCS (pIT507).

Плазмида pIT507 включает тот же первый цистрон, cI857 ген, промотор

30 « .»pL и последовательность, активирующую трансляцию, что и плазмида

;pCZR336, но включает кодирующую последовательность гена РАСЯ/DOACS от плазмиды рХТ503 вместо кодирующей

35 последовательности hGH. Ограничительный фрагмент 2,2 п.о. Sst I — - Ваш 1П плазмиды pIT503 включает большую часть кодирующей последовательности

DACS/DAOCS, остальная часть этой ко1п дирующей последовательности содержится в синтезированном фрагменте 60 п.о. Nde I — Sst I с небольшой модификацией по сравнению с последовательностью ДНК дикого типа, что об 51легчает последующую работу.

Последовательность

5 -CATATG-3, l(libel

3 -GTATAC-5

50 включает

5-ATG-3

11(3-ТАС-5, 9 - 17

Фрагменты ДНК, кодирующие фермент с активностью DACS/DÀÎCS, выделяют из штамма Cephalosporium acremonium; известного как штамм Brotzu который

Ф

Э .содержится в коллекции культур аМе- риканского типа, Роквилл, Иэрилэнд (хранится под номером ATCC 11550).

Геномную библиотеку ДНК штамма Brotzu строят. в бифункциональном космидном векторе рКС462А (существующим в E.coli К12 под номером NRRLB-15973) и исследуют .на наличие последсвательностей, гомологичных ряду 32 различных деоксирибоолигонуклеотидов. Этот ряд деоксирибоолигонуклеотидов был построен на основании информации о частичной аминокислотной последовательности фермента С. acremonium DACS/

/DAOCS и знании генетического кода.

Были отобраны клоны, гомологичные одному или нескольким из 32 различных деоксирибоолигонуклеотидов.

Идентифицируют плазмидные ДНК, кодирующие фермент DACS/DAOCS, из которых выделяют фрагмент 7 кВ Ваш HI,. включающий ген DACS/DAOCS, и встраивают его в коммерчески доступную плазмиду рпС8. Получают лазмиду

pIT503, которой трансформируют Е.coli

К12 JA 221 ° Трансформанты E.coli К12

JA 221/pIT508 депонируют в коллекции культуры Северной региональной науч" но-исследовательской лаборатории .(NRRu) Пеория,,П. 61604, под номером

NRR LB-.18170.

Плазмида pIT503 служит в качестве исходного материала для построения других векторов экспрессии. Эти векторы.пригодны для получения фермента

DACS/DAOCS в рекомбинантной клетке хозяина. Для этого осуществляют трансформацию клеток хозяина рекомбинантной плазмидной ДНК, которая включает: промотор и последовательность, активирующую процесс трансляции; последовательность ДНК, которая кодирует DACS/

/DAOCS и операбельно связана с ука занным промотором; культивирование трансформированной клетки-реципиента, трансформированной в условиях, обеспечивающих синтез фермента.

Плазмиду pIT503 выделяют из Е.coli К12 JA 221, используют для построения векторов экспрессии Е.coli

DACS/DA0CS. Плазмида pIT503 используется в качестве исходного материала для построения плазмиды pIT507, которая обеспечивает высокую степень которая кодирует аиинотерминальную метионильную группу SACS/DAOCS.

Плазмида pIT507 построена так, что промотор рЬ и последовательности, активирующие трансляцию, расположены, 11; 173 обеспечивая экспрессию ДНК, кодирую щей ПАСЯ/DAOCS.

При.температуре 42 "С Е. coli К12 ,Зй 109/pIT507, экспрессируется DACS/

/DA0CS (" 15 от общего клеточного белка). Сырые клеточные экстракты от этих E.coli К12 JM 109/pI507 (трансформант) способны катализировать конверсию пенициллина N в DAOS и РАЯ, в то время как клеточные экстракты от нетрансформированных клеток

Е.со1х К12 JM 109 не могут катализировать эту конверсию.

Многие штаммы V-.coli К1,2;обладают активностью эндогенной цефалоспориназы, кодированной локусом ampG, При этом осуществляют частичную очистку полипептида DAOGS/DACS так, что достигается оптимальная активность

DAOGS/ПАСЯ. Для этой цели достаточна очистка фермента посредством ДЕАЕтривакрила для отделения эндогенной

Е.coli цефалоспориназы от фермента

DA0CS/ПАСЯ. Для исключения вредных влияний цефалоспориназы используют штамм, дефектный по данному ферменту.

Один акой штамм Е.coli К12 А85 892 находится на хранении в Северном региональном научно-исследовательском центре под номером NRRLB-18096.

Плазмиды pIT507 и pIT511 эффективно продуцируют большие количества

DACS/DA0CS в Е. coli. Е. coli pIT507 продуцирует DACS/DAOCS в количестве, приближающемся к 15 от общего клеточного белка. Ввиду moro< что культивирование K.coli менее сложно,,трансформанты Е.coli pIT507 могут быть использованы в способе продуцирования

DACS/DAOCS более эффективно и более экономично, чем естественные продуценты ПАСЯ/DAOCS.

DAOCS может быть использована для продуцирования DAOCS из пенициллина

N в свободной от клеток системе. DAOS является не только полезным антибиотиком, но также может быть использован в качестве исходного материала для продуцирования .таких важных антибиотиков как цефалексин и другие цефалоспорины. DACS/DÀOÑß используют для трансформации пенициллинов иных, чем пенициллин N в новые цефалоспориновые производные.

Свободные от клеток экстракты пенициллина и образующих цефалоспорин организмов могут использоваться для синтеза не имеющих природного происхождения Р-лактамов. Предлагаемые

9856 12

vitro" мутантных генов, создаваемых таким образом, позволяет продуцировать белки с комбинациями мутаций.

Такой мутант ПАСЯ/ПАОСЯ получен с помощью pIT513.

40. Изменение количества генетической информации (вызывающее таким образом вставку или делецию аминокислот в полученном белке) в кодирующей последовательности DACS/DAOCS ДНК изменяет

55 соответственно кодированную аминокислотную последовательность.

Существует целый ряд плазмид, который увеличивает внутриклеточную концентрацию фермента DACS/DAOCS трансформированной клетки., содержащих:

ДНК, кодирующую фермент DACS/DAOCS; промотор и последовательность, активирующую трансляцию, оперативно связанную с геном DAOC/ПАОЯ ° Стойкие трансформанты могут быть получены лишь, если .данный вектор воспроизводится либо как внехромосомный элемент, либо как интегрированный в геномную

ДНК в клетке хозяина. Описанные плазвекторы экспрессии E coli могут быть использованы в способе получения

DACS/DAOCS для трансформации пенициллинов, которые в естественном виде в природе не встречаются, для образования новых антибиотиков или структур с антибиотическим ядром.

Плазмида pIT507 пригодна для получения ПАСЯ/DAOCS в Е.coli не только из-за высоких уровней экспрессии фермента в этих клетках и из-за наличия маркера, присутствующего на данной плазмиде. Многие векторы кодируют Рлактамаэу и клетки, содержащие этот

I5 вектор, и могут расти в присутствии некоторых Р-лактамовых антибиотиков, таких как ампициллин. Однако, если желательно использовать свободный от клеток экстракт, содержащий ПАСЯ/

/DAOCS для целей построения Р-лакта-. мов, то нежелателен экстракт, который содержат активность /3-лактамазы. Так, плазмида pIT507 не кодирует 8-лактамазу, а использует стойкий к тетрациклину ген, который кодирует белок, не реагирующий с 8-лактамами. Осуществляют замену цистеиновой группы в положении 100 на серии в кодирующей зоне DACS/DAOGS плазмиды pIT513 данного вектора экспрессии. Этот обычный способ может использоваться для замены любой группы на любую из других 19 естественно кодированных аминокислот. Сращивание в условиях "in

173 миды включают также ген, придающий стойкость к антибиотику, либо какойлибо другой элемент, который обеспечивает средство отбора клеток хозяев, которые содержат данный вектор, но такие отбираемые элементы могут отсутствовать, когда вектор интегрируется в хромосомную ДНК клетки хозяина.

Векторы экспрессии в Penicillium u

Cephalosporium описаны следующим образом.

Плазмида pPS56 представляет собой вектор экспрессии Cephalosporium.

Плазмида рРБ55 представляет собой промежуточный продукт в построении плазмиды рРБ56. Плазмида рРЯ55 построена ns Hind III фрагмента плазмиды

pMLC12 и 2,3 т.п.о. Hind III фрагмента плазмиды рРБ34, который включает промотор С.acremonium IPR, слитый с кодирующей последовательностью гидромицин В фосфотрансферазы. Фрагмент

8am HI 7 кв, содержащий ген DACS/

/DAOCS плазмиды pIT503, слит с частично обработанной Bam HI плазмидои

pP$ 55, образуя плазмиду рРБ 56.

Промотор Cephalosporium acremonium и последовательность, активирующая трансляцию на плазмиде pIT503, расположены так, чо вызывают экспрессию

ДНК, кодирующей фермент с активностью синтетазы DACS/DAOCS, ввиду того, что при построении плазмиды pIT503 никаких делеций или вставок, действующих на промотор и последовательность, активирующую трансляцию не вводится в

ДНК, гранйчащую с 5 -концом.

Ген Penicillium IPS может быть встроен в высоко продуцирующие штаммы Penicillium с целью увеличения титра пенициллинов, продуцируемых при ферментации.

Плазмиды рЗБК2, pPS51, pPS52, pPS54 и pPS61 содержат ген amds u клетки Penicillium, заключающие эти плазмиды, и могут быть отобраны с использованием ацетамида. Плазмиды

pPS57 и pPS62 содержат гибридный ген, придающий стойкость к гидромицину, который использует плазмиды рР$59, в результате чего получают плазмиду рРБ61. Плазмида pPS61 предназначена для экспрессии фермента DACS/DAOCS

РепхсП1 шп, особенно P.chrysogenum.

Плазмиду pPS51 используют в качестве источника ацетамидного гена в других плазмидных построениях. Плаэмида pPS52 содержит ген DACS/DAOCS

9856 14 на фрагменте 7 т.п.о. Bam HI (от плазмиды pPS51) и синтезированную связывающую молекулу. Плазмида рРБ52 г обеспечивает экспрессию фермента

5 DACS/DAOCS. Плазмиду pPS52 используют для экспрессии фермента Cephalosporium либо в Penicillium.

Отбираемый маркер amds может быть введен в любой вектор экспрессии.

Вектор pPS54 включает ген amds от плазмиды рРЯ51 и ген Penicillium IPS.

Штаммы Penicillium обладают некоторой стойкостью к гидромицину. Оптимальные условия трансформации для использования НшК как отбираемого маркера требуют добавления чувствительных к гидромицину агентов. Способ отбора трансформантов Penicillium предлагает трансформацию рекомбинантной ДНК, включающей ацетамидный ген, клетки хозяина Penicj.ilium, а также культивирование трансформированной клетки в среде роста., которая содержит.ацетамид как единственный источник углерода или азота.

Источником ацетамидазного гена (amdS) от Aspergillus nidulans может быть плазмида рЗЯЕ (НИИ В-18182).

Создан промежуточный вектор, обозначенный как плазмида pPS51 который состоит из гена amds от плазмиды p3S2, слитой с плазмидой рЖС12. Плазмиду

pPS5i гидролизуют рестриктазой Hind

III„ обрабатывают фрагментом Кленова

35 и сшивают с фрагментом 2, 13 т.п.о., предварительно с затупленными концами, содержащим гибридный ген DACS/

/DAOCS, в результате чего получают плазмиду рРЯ60. Плазмида pPS60 содер40 жит промотор Penicillium IPS, расположенный рядом, для экспрессии коди- рующей последовательности DACS/DAOCS.

Осуществляют делацию двух небольших ограничительных фрагментов ХЬа1 из ф5 плазмиды рРБ60 создающей плазмиду рРБ58. Синтезированный связывающий фрагмент встраивают в ХЬа1; что обеспе- чивает операбельное связывание промото-, ра Penici 11ium I ХРЯ и кодирующей после"

50 довательности DACS/DÀOÑS, в. результате получая плазмиду pPS59. Плазмиду

pPS59 используют для выражения активности DACSfDAOCS в клетках в Penicillium и других клетках, в которых функционирует промотор Репхсд11 пш

IPS.

Плазмида pPS59 является промежуточным продуктом для построения векторов экспрессии: PenicØium. DACS/DAOCS

1739856

pPS 62 и pFS61. В обоих случаях фрагмент 2,1 т.п.о. Bam HI — Nru I плазмиды рРБ59 с затупленными концами посредством фермента Кленова используется как источник кадирующей последовательности DACS/DAOCS, слитой с промотором Penicillium IPS. Плазмиды

pPS61 и pPS62 содержат отбираемые маркеры rya Penicillium. Осуществляют слияние фрагмента 2,13 кв ллазмиды

pPS59 с расщепленной Hind III и обработанной фрагментом Кленова плазмидой рРБ57 и получают нлазмиду pES62.

Плазмида pPS62 является вектором экспрессии.

Промотор BAGS/DAOCS Cephalosporium acremonium также может функционировать в Penicillium (обсуждение плазмида pPS52 приведено), но оптимальные векторы выражения Penicillium используют проматор от гена Penicillin@a. Промотор Penicil lium IPS от плазмиды pLC1 {NRRI В-18181) связан со скелетом плазмиды рЯ С12 с помощью синтезированной связующей молекулы, в результате чего продуцируется плазмида рРБ53. Плазмида pPS53 является промежуточным продуктом в построении некоторых других кланирующих векторов и плазмид экспрессии. Содержащий промотор фрагмент Ваш НХ 1,0 кв плазмиды рРБ53 слит с фрагментом, кодирующим последовательность HmR 4, 3 т. п. о. Bam HI плаэмиды рРБ55, в результате чего образуется плазмида pPS57.

Плазмида pPS57 является промежуточным продуктам в построении вектора экспрессии Penicillium pPS62. Плазмида pPS62 содержит отбираемйй маркер (HmR) и гибридный DACS/DAOCS ген с кодирующими последовательностями как

ЭАСБ/DAOCS, так и HmR под контролем прамотора (2 копии) гена Penicillium

IPS.

Вектор экспрессии Penicillium

DACS/DAOCS без атбираемога маркера построен путем вставки содержащего промотар фрагмента 1,0 т.п.о. Bam HI плазмиды рР$53 в точку Bgl IT вектора выражения рХТ511 E,coli ДНК, кодирующей фермент DACS/DAOCS. Плазмида

pIT503 и производные, которые содержа целый ген DACS/DAOCS, используются для повышения способности к продуцированию антибиотика Cephalospor. inn ь родственных им клеток реципиентов, в которых функционируют промотор С .асщей DACS/DÀOÑÁ в геноме Cephalosðorium acremonium. Плазмида pIT503 включает промотор и последователь-" ность, активирующую трансляцию гена

DACS/DA0CS.

Плазмиды pIT503, pPS52 и pPS56 включают. промотор Cephalosporium

4р, acremonium и последовательность, активирующую трансляцию гена DACS/

/DAOCS. Промотор С.acremonium è последовательность,. активирующая трансляцию, расположенные на плазмидах

pIT503, pPS52 и pPS56, могут быть использованы для экспрессии целого ряда последовательностей ДНК. После45 довательность промотора C..acremonium и последовательность, .активирующая

5Q трансляцию, закодирована на фрагмен" тел 440 вр Sst I — Hind ХХЕ, расположены непосредственно над и в непосредственном соседстве с кодирующей последовательностью ВАСБ/DAOCS. Фрагмент, который включает указанный ограничительный фрагмент л440 п.о.

Sst Х - Н пй ХХХ, включает промотор

С.acremonium и последовательность, активирующую трансляцию.

remonium и последовательность, акти вирующая трансляцию. Плазмида рРБ56 включает также придающий стойкость к

5 гидромицину ген который функциониt рует в C.acremonium и .позволяет осу-. ществлять отбор трансформантов С.acremonium pPS56.

После отбора трансформант:Cephalosporium acremonium pPS56 нет необходимости в поддержании давления отбора гидромицина В в среде роста. Отборочное давление не требуется, поскольку трансформанты С.acremonium l5

pPS56 очень стойки. Эта стабильность является результатом трансформации плазмидюй pPS56. С.acremonium через хромосомную интеграцию.

Трансформированные клетки Penicil-.

lium могут быть отобраны с использованием гидромицина В.

Предлагается способ конверсии пе-. нициллина С и пенициллина V в соответствующие цефалоспорины с использованием DACS/DAOCS в Penicillium, который включает трансформацию клетки хозяина.Penicillium вектором рекомбинантной ДНК, который содержит ген, кодирующий выражение активности

DAOCS.

30 Плазмида pIT503 включает геномную

ДНК, составляющую более чем 3 кв, которая расположена ниже ДНК, кодирую17. 173

Последовательность промотора Cep halosporium acremonium è последова.тельность, активирующая трансляцию, е закодированы на плазмиде pIT503. Плаз" мида рЕТ503 содержит фрагмент 440 п.о. Sst I †-. . gind III, Промотор Cephalosporium acremonium и последовательность, активирующая трансляцию, могут быть использованы для экспрессии гетерологичной последовательности ДНК, Влияние промотора ВАСЯ/DAOCS с геном, стойким к бактериальному гидромицину В, позволяет использовать отбор с использованием гидромицина В в Cephalosporium, Описана последовательность окончания транскрипции и другие регуляторные сигналы в 3 -конце гена

DACS/DAOCS. Плазмида pIT503 и ее производные, такие как плазмида

pPS56, содержат дополнительно ДНК более чем 1 т.п.о. ниже точки начала транскрипции гена DACS/DAOCS в геноие Cephalosporium acremonium.

Часть этой 3 -регуляторной ДНК последовательности известна и описана следующим образом.

3 -TAG-3; является трансляционной

I .концевой последовательностью:

5>-ТAG GGA АСС CGC CCA ТСГ AGT ААТ

ААА ТСТ ACG GGA GTT TAA GAA GAA

ААА TTG ССС ТАТ ААА TTG СТА ААТ.

ТТТ ТАА AAC АСА AAG САТ GAG TGT

CAA GAG ТТТ CAA GTT ТСА А-3

Данная последовательность и последовательности, включающие 3 -регу> ляторные последовательности гена

DACS/DAOCS, могут быть введены в векторы экспрессии рекомбинантной ДНК.

Осуществлено впервые клонирование последовательности, которая кодирует фермент DAOCS. Кроме того, как аминокислотная, так и ДНК последовательность фермента экспандазы, особенно

DAOCS синтетазы Cephalosporium асгетоФ, a>urn> могут быть использованы для отделения ДНК, кодирующей экспандазу от про" дуцирующих -лактам организмов, Данная последовательность ДНК может быть использована для приготовления меченых проб, предназначенных для обнаружения кодирующих экспандазу последовательностей ДНК в продуцирующих лактаи организмах. Содержание G и С в кодирующих DAOCS ДНК, составляющие примерно 63Х приводит к тому, что данные ДНК пригодны для выделения

ДНК Shreptomyces, кодирующей DAOCS, s основном S. clavaligerus. ДНК

9856 18.

В обработанные лизоцимом клетки

50 вводят 3 мл лизирующего раствора (приготовленного смешиванием 3 мл

1ОХ-ного тритон-Х. 100 75 мл 0,25 М

ЕДТА, рН 8 0, 15 мл 1: M трис-НС1, рН 8,0 и 7 мл воды), перемешивают и

55 ют, 5

Streptomyces имеет высокое содержание G и С и достигает 70Х. Такое высокое содержание G и С в ДНК позволяет использовать их для выделения гамологичных Я.slavaligerus или других последовательностей ДНК, кодирую-щих DAOCS.

Пример 1, Культура Е,coli

К12 JA 221/pIT508 и выделение плазмиды pIT503.

1 л питательного бульона L (10 и триптона, 10 г NaC1 и 5 r дрожжевого экстракта на 1 л), содержащего

50 мкг/мл ампициллина, инокулируют культурой Е.coli К12 JA 221/pIT503 о и инкубируют в инкубаторе при 37 С до тех пор, пока оптическая плотность при 590 нм не составит 1 ед. поглощения. В течение этого времени в культуру вводят 150 мг хлорамфеникола. Инкубацию продолжают в течение

16 ч. Введение хлорамфеникола ингибирует .синтез белка и, таким образом, ингибирует дальнейшее деление клеток, но обеспечивает дальнейшую репликацию плазмиды.

Данную культуру центрифугируют при скорости вращения 6000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. Полученный поо

/ верхностный слой удаляют и клеточную гранулу промывают в 40 мл TES буферного раствора (10 мИ трис-НС1- рН

7,5; 10 NaC1 и 1 мМ этилендиаиинтетрауксусная кислота (ЕДТА) и затем снова гранулируют. Поверхностный слой удаляют и клеточную гранулу замораживают в баке со смесью сухой лед— этанол, а затем оттаивают. Оттаянную клеточную гранулу снова суспендируют в 10 мл раствора 25Х-ной сахарозы и 50 мМ ЕДТА. В данный раствор вводят и перемешивают с ним 1 мл лизоцимного раствора концентрацией

5 мг/мл; 3 мл 0,25 И ЕДТА, рН 8,0 и 100 мкл рибонуклеазы А концентрацией 10 мг/мл. Затем эту смесь инкубируют на льду в течение 15 мин. полученный раствор инкубируют на льду в течение еще 15 иин. Лизированные клетки замораживают в бане со смесью сухой лед — этанол, а затеи оттаива19

1739856,. 20:

Клеточные осколки удаляют из раствора путем центрифугирования при вращении центрифуги со скоростью

25000 об/мин в течение 40 мин. Поверхностный слой экстрагируют буферным фенолом. В этот раствор вводят

30,44 СзС1 и 1 мл раствора этилбромида концентрацией 5 мг/мл. Затем .этот раствор доводят до объема 40 мл к декантируют в ультрацентробежную трубку. Эту трубку герметически эапаивают и раствор центрифугируют в роторной центрифуге при скорости центрифуги 42000 об/мин в течение 16 ч.

Полученную плазмиду, визуализированную ультрафиолетовым светом, выделяют, а затем помещают в трубку и роторную центрифугу, где осуществляют центрифугирование:со скоростью 50000 об/мин в течение 16 ч.. Любое необходимое регулирование объема осуществляют с использованием раствора TES содержащего 0,761 мг/мл CsC1. Затем плазмидную полосу выделяют, экстрагируют насыщенной солью изопропанолом с целью удаления этилбромида, и разбавляют (1:3) буферным раствором TES. В раствор вводят два объема этанола и затем его инкубируют при -20 С в течение ночи. Плазмидную ДНК гранулируют путем центрифугирования данного раствора в роторной центрифуге в течение 15 мин при скорости центрифуги 10000 об/мин.

ДНК плазмиды рХТ503, полученную таким путем (1 мг), суспендируют в

1 мл буферного раствора TES (10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ЕДТА) и хранят при -20 С.

Последовательности концевого кодона, кодирующеи последовательности

Г

lрр, замещают íà Bam HI путем ввода синтезированной связующей молекулы

ДНК (5 -CCGGATCCGG-3 ) . Кодирующая последовательность последних тридцати пяти аминокислот липопротеина, трансляционный концевой сигнал и последовательность; соответствующая

3 -нетранслированной зоне информационной РНК, .следует за точкой Bam HI.

Плазмида рКЕ N021 включает также некоторые независимые последователвности на 850 т.п.о., расположенные ниже гена lрр в хромосоме E.co3i.

Примерно 50 мкг плазмиды: pKENIII обрабатывают с 25 рестриктаэами HpaII в 300 мкл буферного раствора IX Нраl

50 те. Фрагмент 950 п.о. HpaII изолируют и извлекают из геля путем электроэлюирования в диализный мешок. После экстракции смесью фенол/СНС1> и осаж55 дения этанолом, ДНК ("2,5 мкг) растворяют в 25 мкл TEN (10.мМ NaC1;

10 мМ трис-НС1, рН 7,4, 1 мИ ЭДТА).

Примерно 2 мкг фрагмента 950 п.о. .HpaII обрабатывают ферментом Alu I

25 (10 мИ трис-НС1, рН 7,4, 10 мИ NgC1<, 1 мМ КС1; и 6 мИ р-меркаптоэтанола) при 3? С в течение 2 ч. Смесь экстрагируют двукратно 300 мл смеси фенола с хлороформом в соотношении 50:50 и извлеченную водную фазу повторно осаждают 2,5 об. этанола и О, 1 об 3 M

Na0Ac Гранулу ДНК растворяют в

100 мкл электрофорезного буферного раствора и фракционируют íà 57. -ном полиакриламидном геле.

Пример 2. Построение плазмиды

pIT5O7.

Построение плазмиды pKEN021 и выделение фрагмента 5 1 т. и. о. Xba I —Bam HI осуществляют следующим образом.

Плазмиду рКЕМ021 получают из плазмиды pKENIII. Плазмиду pKENIII получают из Северного регионального научно-исследовательского центра (NRRL)., служба исследований в области сельского хозяйства, Перория, Иллинойс, 61604, Е.coli CC620, порядковый номер NRRL 15011.

Плазмида рКЕНХХХ имеет фрагмент 2,8 к EcoRI, который включает ген

Е.coli lрр.

В плазмиде pKEN021 фрагментл 650

Ьр EcoRI — Sal I плазмиды pBR322 замещают генной последовательностью

Е.coli lрр..Эти генные последовательности lрр включают фрагмент 462 п.о.

Alu I, расположенный кверху от первого триплета кодирующей последовательности lрр. Этот фрагмент 462 Ьр содержит промотор 5 -нетранслированную зону и точку рибосомного связывания.

Уникальный сайт рестрикции XbaI расположен в пределах точки рибосомного связывания 16 lI,o. перед метионином, инициирующим трансляции. Сайт рест-. рикции Pvu, находящийся вьппе бис, составляет 29: 1 во всех полиакриламидных гелях, за исключением особых случаев. Этот гель окрашивают в раст".. воре, содержащем 0,5 мкг/мл этилбромида., и визуалиэируют полосу ДНК в длинноволновом ультрафиолетовом све39856 22

2!

17 в 200 мкл раствора IXAlu I (50 мИ

NaC1, б мМ трис-НС1, рН 7,6, 6 мМ

NgC1< и 6 мИ Р-меркаптоэтанол) в течение 2 ч при 37 С. ДНК фракционируют в б -ном полиакриламидном геле, фрагмент 462 п.о. Alu Х.извлекают, (1 мкг).растворяют в 10 мл раствора (66 мИ трис-НС1, рН 7„6, 10 мИ ИяС1, 10 мМ дитиотреитол, 0,4 мИ АТР),.сoдержащего 150 пмоль фосфорилированного связующего звена EcoRI (5 -GGAATTCC-3 ) и 2 ед. Т4 ДНК-лига,.эы. После инкубации при 4 С в течение о

16 ч смесь прогревают при 65 С в течение 10 мин и разбавляют до состава раствора: 100 мИ трис-НС1, рН 7,2, 50 мМ NaCl, 10 MgC1 и 6 мМ / -мер-: каптоэтанол, содержащего 40 ед. фермента EcoRI. Через 2 ч выдержки при о

37 С образец экстрагируют смесь фенол/СНС1 и осаждают этанолом. Затем

ДНК растворяют в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК-лигазы, содержащего

Т4 ДНК-лигазу и О, 1 мкг обрабстанной щелочной фосфатазой и ферментом .EcoRI плазмиды pBR322. После сшйвки о при 4 С в течение 16 ч ДНК используют для трансформации Е.coli К1 2 НВ101 (КЗЗП В-15626). Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих

12 мкг/мл тетрациклина и плазмид, выделенных из стойких колоний путем быстрой щелочной экстракции. Плазми дя, содержащая фрагмент 466 п.о.

Xba I — Ваш НХ, использована в качестве исходного материала для следующего этапа.

Примерно 2 мкг этой.плазмиды, обработанной 2 ед. фермента Hind III . в 50 мкл буферного раствора IX Hind

ХХХ (6О мИ NaC1; 1О мИ трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ MgC1 и б мИ /З-меркап-. тоэтанол) в течение 1 ч при 37 С, экстрагируют смесью фенол/СНС1>, осаждают этанолом, растворяют в .200 мкл буферного .раствора нуклеазы

ХХ SI (300 мИ NaC1; 30 мИ NaOAc, рН 4,25, 3 мИ ЕпС1 ) и обрабатывают

200 ед, нуклеазы S 1 в течение ч при 15 С. Реакцию прекращают путем о экстракции смесью фенол/СНС1, ДНК .осаждают этанолом. Обрабатывают ферментом Hind III растворяют в 10 мл буферного раствора Т4 ДНК-лигазы, содержащего 20 пмоль фосфорилирован"

I ных связующих звеньев Ваш HI (51 -CCGGATCCGG-3 ) и 2 ед. Т4 ДНКлигазы. После 16 ч инкубации при о ..4 С реакционную смесь нагревают при -

65оС в течение 10 мин и затем разбавляют до 100 мл до получения буферного раствора IX Bam HI (150 мМ

NaC1 20 мИ трис-НС1, рН 8,0, 10 мИ

МяС1 и 6 мМ f5-меркаптоэтанол), содержащего 20 ед. фермента Bam HI.

После 2 ч инкубации при 37 С смесь подвергают очистке в 1 -ном агарозном геле. Этот гель окрашиваются этилбромидом, и более крупный фрагмент (4,5 т.п.о.) извлекают из геля.

Фрагмент имеет когезионно связанные концы Bam HI, Его растворяют в

20 мкл буферного раствора Т4 ДНКлигазы, содержащего лигазу Т4,.ДНК.

Через 16 ч вццержки при 4 С ДНК используют для трансформации Е.coli

20 К12 НВ!Oi (NRRLB-15626). Трансформанты отбирают на устойчивость к ампициллину при 100 мг/мл и на чувствительность к тетрациклину при 10 мкг/

/мл. Плазмиды отобранных колоний исследуют на отсутствие точки Hind ХХХ и на присутствие единственной точки

Bam HI. Последовательный гидролиз

EcoRI, SalI приводит к образованию двух фрагментов размером 466 и 305 п.о. и значительно более длинного фрагмента. Плазмиду. с такими характеристиками модифицируют для превращения точки EcoRI расположенной выше промотора lрр, в ограничительную точку Hind III.

Модификацию проводят путем частичного гидролиза 2 мкл плазмиды в

100 мкл буферного раствора IX EcoRI с ограничительным .ферментом EpoRI..

Реакцию прекращают нагреванием при

"0 65 "С. ДНК экстрагируют смесью фенол/

/СНС1 и осаждают этанолом. ДНК растворяют в 200 мл буферного раствора -. нуклеазы IX S1 содержащего 1000 ед/

/мл нуклеазы Я1, и инкубируют при

12 С в течение 1 ч. Реакцию прекращают экстракцией смесью фенол/СНС1э.

ДНК осаждают этанолом и суспендируют в 10 мкл буферного раствора Т4 ДНКлигазы, содержащего 20 цмоль фосфо50 рилированного связующего звена Hind

III (5 -CCAAGCTTGG-3 )и 2 ед. Т4 ДНКлигазы. После 16 ч инкубации при 4 С смесь нагревают в течение 10 мин при

65©С, разбавляют до 150 мкл с полу

55 чением композиции буфера IX Hind III, содержащего 1О ед. ограничительного ,фермента Жпй ХХХ, инкубируют в те чение 2 ч при ЭУ С и затем фракциони. :руют в Я-ном агарозном гела. ДНК

23; 17 ,извлекают, очищают, растворяют в

20 мкл буферного раствора Т4-лигазы, содержащего Т4-лигазу, инкубируют в течение 16 ч при 4 С и используют для о трансформации Е.coli HB101 (МНИ В-15626). Плаэмиду ДНК трансформант

ApR анализируют. Отбирают плазмиду с фрагментом 500.п.о. EcoRI — Hind ХХХ. Эту плазмиду затем используют как вектор для клонирования 3 -зоны гена lрр. 2 мкг этой плазмиды гидролизуют в 50 мкл буферного раствора

ХХ Яа1 I (150 мИ ИаС1, 6 мИ трис-НС1, рН 7,9, 6 .мИ MgClz 6 мИ Р-меркаптоэтанола) с 2 ед. фермента Sal I в тече- . ние 1 ч при 37 С. Реакционную смесь разбавляют до 150 мкл с получением композиции буферного раствора Bam HI, содержащего 2 ед. фермента Bam HI.

После инкубации ч при 37 С добаво ляют примерно 2,5 ед. щелочной фос. фатазы и инкубируют при 65 С в течение 1 ч..ДНК экстрагируют смесью фенол/CHCl, осаждают этанолом, растворяют в TEN