Способ получения гибридного полипептида, содержащего нв @ а @

Способ получения гибридного полипептида, содержащего нв @ а @

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: генетическая инженерия , получение бифункциональных антигенов , клонирование генов, которые кодируют эти антигены в дрожжах. Сущность изобретения: гибридные полипептиды, содержащие HBsAg, получают в результате культивирования штаммов Saccharomyces cerevislae 1044C или ДС5, трансформированных плазмидами pRIT 12573 или pRIT 12574, выделяют и очищают целевой продукт . 7 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 15/51, 15/30

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

Г1РИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Ф

М (21) 4355055/13 (22) 26.01.88 (31) 009.325 (32) 30,01,87 (33) US (46) 07.07.92. Бюл. М 25 (71) Смит Клайн-Рит (BE) (72) Тереза Кабезон (С1 ), Мишель Де Вильд (BE) и Нигель Харфорд (NZ) (53) 575.224.2 (088.8) (56) Nature, 298. 347-350, 1982.

ЕР N. 0201416, кл. А 61 К 39/29, 12.11.86.

ScIence. 1984, 225, 593-599, Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению бифун- . кциональных антигенов, клонированию генов, которые кодируют зти антигены в дрожжах.

Известен способ приготовления гибридного полипептида HBsAg-Herpes симплекс I вирус гликопротеин Д (HSV-Ig0) при экспрессии последовательности, кодирующей гибрид Н$Ч-190 Pre S2-S белок, в дрожжах.

Наиболее близким к изобретению является способ получения гибридного полипептида, содержащего Н 8sAg. заключающийся в том, что осуществляют конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей слитый полипептид; трансформацию полученными ДНК штаммов Saccharomyces, cerevlsiae, выделение и очистку целевого продукта.

Способ заключается в том. что 64 кодона ДНК последовательности, кодирующей повтсряющийся эпитоп циркумсиорозоит,!Ж„„1746887 А3 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО

ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО HBsAg (57) Использование: генетическая инженерия, получение бифункциональных антигенов, клонирование генов, которые кодируют эти антигены в дрожжах. Сущность изобретения: гибридные полипептиды, содержащие HBsAg, получают в результате культивирования штаммов Saccharomyces

cerevislae 1044С или ДС5, трансформированных плазмидами pRIT 12573 или pRIT

12574, выделяют и очищают целевой продукт. 7 табл. ного белка (С$) Plasmodium falclparum и восемь кодонов CS кодирующей последовательности Pre S2 белка встраивают в вектор, экспрессирующийся в дрожжах, причем он состоит из репликона или последовательности Pre $2- Я белка и соответствующей регуляторной области. Оба вектора экспрессии, а именно один, содержащий последовательность из 64 кодонов, и другой, содержащий

CS последовательность из 8 кодонов, каждый трансформируют в клетки дрожжей-реципиентов и анализируют экстракты таких трансформированных клеток на наличие

HBsAg эпитопов и CS эпитопов на той же молекуле.

Новые последовательности, кодирующие Pre $2 и Pre S2 — S белок HBV, получают из adNI субтипа HBV. который был выделен из плазмиды pRIT10616. Последовательности, кодирующие Pre S2-S белок, извлекают с помощью традиционных процедур рекомбинантной ДН К из плазмиды р IT10616. Pre

S2 область последовательностей характери1746887 зуется следующей аминокислотной последовательностью: -so

Мет=G In-Тгр-Asn-Ser-Thr-A a-Phe—

His — Gln-Ala-Leu-Gin-Asp-Pro-Arg gal-
Г9 Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser о

-Ser-Ser-Gly Thr-Val-Asn-Pro-Ala-ÐãÞAsn-Ие — Ala-Ser-His-Ие-Ser-Ser-Ser-Ser

- Ala -Arg Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn.

Функциональным производным Pre

S2-S согласно предлагаемому способу является производное, у которого аминокислота аланин (GCT) в положении 45 модифицирована с помощью сайт-специфического мутагенеза на треонин (АСТ).

Рекомбинантная плазмидная ДНК состоит из последовательности, кодирующей

Pre $2 и Pre S2-S белок, лигированной с регуляторной областью.

Пример 1, Конструкция плазмиды

pR IT10167.

В качестве исходного материала используют плазмиду рбу, содержащую фрагмент 2.1 кЬ Hldn III дрожжевой ДНК, кодирующий ген TD НЗ, клонированный на

pBR 322. Фрагмент Hind III дрожжевой ДНК клонируют в pBR 322, в которой сайт Есой разрушают и получают рЮТ10164.

ДНК pRIT10164 очищают путем центрифугирования в градиенте CS CI-этилбромид. 150 мкг pRIT10164 ДНК обрабатывают

75 единицами эндонуклеазы Xbal, экстрагируют фенолом и эфиром, осаждают этанолом в ДНК, ресуспендируют в 0,01 М трометамин-HCI-буфере при концентрации

1 мкг/мкл, 20 мкг ДНК, обработанной Xbal, гидролизуют Bal31 для удаления 61 п.о.

ДНК между ATG кодоном и сайтом Xbal.

Обработку Bal31 осуществляют при ЗО С в течение 1 — 3 мин в буфере, содержащем 600 ммоль хлористого натрия, 12 ммоль хлористого кальция, 12 ммоль хлористого магния, 1 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕО ТА), 20 ммоль трометамин-НС!, рН

3,1 с использованием одной единицы нуклеазы Ва!31 на 20 мкг ДНК в конечном реакционном объеме 200 мкл.

Реакцию останавливают путем добавления этилен-бис(оксиэтиленэмтрило)тетрауксусной кислоты (EGTA) с получением конечной концентрации 20 ммоль и образцы экстрагируют эквимоляриыми объемами фенола, эфира и осаждают этанолом. Каждый образец ДНК ресуспендируют в 2!1,мкл

10 мМ буфера трометамин-KCI, рН 7,5.

Степень гидролиза Bal31 измеряют путем обработки 2,5 мкг образца ДНК эндонуклеаэой Hpal и путем сравнения размера фрагмента Hpal-Xbal с фрагментом 335 Ьр

Н ра!-Xbal из рЮТ10164, Двухминутный гидролиз Ва!31 удаляет 41-88 нуклеотидов из фрагмента ХЬа!-Нра! плазмиды pRIT10164..

5 мкг ДНК обрабатывают эндонуклеаэой BamHI, проводят экстракцию фенолом

5 и осаждение этанолом. Эту ДНК обрабатывают 5 единицами, Т4 полимеразы в присутствии дезоксинуклеотида трифосфатов для того, чтобы заполнить BamHI и Bal31 концы, экстрагируют фенолом и извлекают

10 осаждением этанолом. 2,3 мкг этой ДНК обрабатывают 5 ед. Т4 ДНК лигазы и половину сшитой ДНК используют для трансформации компетентных клеток Е.coll К12 штамма

ММ294. 1 мл трансформированной популя15 ции Е,соИ разбавляют в 350 мл L-бульона с

200 мкг/мл ампициллина и общую плаэмиду

ДНК очищают иэ полученной культуры.

80 мкг этой плазмиды ДНК обрабатывают 75 ед. Hind III эндонуклеазы и 96 ед.

20 BamHI эндонуклеаэы.

Целевые фрагменты Hind III-BamHI, соответствующие размерам 1100-1000 bp, на препаративном 1 -ном агароэном геле выделяют из геля в два среза, причем один

25 соответствует ДНК с размером около 1070

bp, другой — 1030 Ьр. ДН К извлекают из двух агарозных гелевых срезов с помощью циклов замораживания и оттаивания, после чего проводят центрифугирование агарозы с .

30 высокой скоростью. Верхний слой жидкости отфильтровывают с помощью фильтров и

ДН К извлекают с помощью двух циклов этанольного осаждения и ресуспендирования в

20 мкл 0,01 M трометамин-НС! буфера с рН

35 7,5, Анализ агароэного геля электрофореэом и сравнение гидролизованной Hind IIIXbal плазмиды pRIT10164 ДНК и с фрагментами из Hind !И EcoRI фага АДНК

40 показывает, что получают два различных фрагмента Hind III — BamHI, один размером

1070 Ьр, а другой размером около 1030 Ьр, в сравнении с 1120 Ьр Hind III-Xbal фрагментом плазмиды pRIT10164. Около 100 нг

45 фрагмента 1030bp Hind ill-BamН! лигируют с 200 нг плазмиды pUC9, которую обрабатывают Hind III u BamHI эндонуклеазами и щелочной фосфатазой. Полученную ДНК используют для трансформации клеток E.coll

50 штамма JM103 с селекцией на устойчивость к ампициллину, Получают около 400 устойчивых к ампициллину колоний на 1 мл и 98 колоний и испытывают в среде, содержащей Х-gal, 55 Плазмиды из трансформированных колоний получают после амиплификации плазмид путем добавления спектиномицина (150 мкгlмл) к растущим культурам.

Рекомбинантные плазмиды анализируют на 7,5;(,-ной акриламидном геле после

1746887

40 препарат обрабатывают эндонуклеаэой ми

Clal, ДНК pRIT10158 гидролизуют эндонук- об леазами С!а! и НаИИ и фрагмент 1150 Ьр Н

С!а-Hall!i. несущий область окончания ок транскрипции arg . гена. извлекают путем 55 ф препаративного электрофореза на агароз- фр ном rene и злектроэлюированием. Этот уч фрагмент лигируют с ДНК плазмиды

pRIT10158, обработанной EcoRI, Т4 ДНК (и полимеразой, Clal. и лигированную смесь ш гидролиза с AVail u BamHI зндонуклеаэами и сравнивают с 450 Ьр фрагментом AVallXbal, включающим промотор-N-концевую кодирующую область pRIT10164, и с Hpall фрагментом ДНК плазмиды pBR322. AVall- 5

BamHI фрагмент присутствует в 35 из 36 плазмид, Три нлазмиды выбирают для дальнейших исследований. Плаэмидную ДНК выделяют путем центрифугирования в градиенте плотности CSCI-этилбромид и 25 мкг 10

ДНК гидролизуют EcoRI. EcoRI концы метят у-P ATP.

Пример 2. Конструкция векторной

p R IT10172.

1050 Ьр Hind III-BamHI ТОНЗ ДНК 15 вставки иэ pRIT10167 клонируют на челночном векторе УЕр13 и получают рекомбинантную плазмиду pRIT12059, ДНК плазмиды рй!Т12159 гидролизуют

Xbal u BamHI эндонуклеазами и фрагмент 20

1650 Ьр лигируют с фрагментом XbalBamHI, содержащим стимулятор arg на плаэмиде pRIT10774. Плазмида pRIT10774 включает репликон УЕр13, из которого удалены сайты BamHI u Xhol путем манипуля- 25 ции in vitro с фрагментом 1470 ba Hind

II!-BamHl, включающим область стимулятора arg, и фрагментом 1150 Ьр BamHI-Hind

Ill, включающим arg область окончания транскрипции. Замена стимулятора arg на 30

pRIT10774 на стимулятор Т0Н3 дает плазмиду pRIT10172, которая содержит единст венный сайт BamHI, расположенный при кодоне ATG стимулятора TDH3 и предшествует сигналу окончания транскрипции на 35

1150 Ьр BamHI-Hind ill arg ДНК фрагменте.

Чужеродную ДНК можно клонировать в этом сайте.

Пример 3. Фрагмент 1050 bp. Н!пб

И!-EcoRI из pRIT10167 и Hind И!-BamHI

TDH3 фрагмент, содержащий стимулятор, вместе с частью BamHI Smal-EcoRI полилинкера pUC9 клонируют между сайтами

Hind III u EcoRI плазмиды pBR322. в которой предварительно удаляют сайт BamHI путем заполнения полимеразой Т4 ДНК и лигируют.

Плаэмидную ДН К pRIT 10158 обрабатывают эндонуклеазой EcoRI и полимеразой

Т4 ДНК для заполнения EcoRI-концов, Этот 50 используют для трансформации клеток

Е.coll штамма ММ294. Иэ трансформированных колоний выделяют плазмиду, в которой фрагмент Clal-Haelll окончания транскрипции arg вставлен между сайтами

ClaI, сайт Есой! заполнен и восстановлен.

Плазмидную ДНК pRIT10162 обрабатывают

EcoRI и Pst! эндонуклеазами. смесь лигируют и используют для трансформации клеток

Е.coll К12 штамма ММ294. Извлекают плазмиду pRIT12208, в которой большой фрагмент 4630 Ьр EcoRI-Pst I иэ pRIT12176 лигируют с фрагментом 1930 bp EcoRI-Pst из рЮТ10162, в котором arg область окончания сшивается со стимулятором Т0Н3.

Фрагмент 2200 bp Hind И! из pRIT12208 клонируют в сайт Hind ill производной плазмиды pBR322, в которой сайты EcoRI u

ВатН! удаляют путем заполнения полимеразой Т4 ДНК.и лигированием. В обеих плазмидах pRIT12208 и pRIT12290 фрагменты стимулятора TDH3 и arg окончания транскрипции разделены сайтами BamHI, Smal и EcoRI, и области стимулятора и окончания транскрипции могут быть вырезаны .вместе на фрагменте 2200 Ьр Н!пб, III.

Сайт BamHI полезен для клонирования, так как он расположен при ATG кодоне гена

TDH3 и может быть применен для слияния других генов со стимулятором Т0Н3.

Пример 4, Конструкция плазмид

pRIT10677, pRIT10909 и pRIT10158. а) pRIT10677.

BamHI фрагмент 1372 Ьр клонированной HBsAg ДНК вырезают из pRIT10616 и лигируют с вектором PBR327, обработанKblM эндонуклеазой BamHI. Этот фрагмент

BamHl содержит часть области предшественника HBsAg. Получают плазмиду

pRIT10677, которая имеет BamHI фрагмент

HBV, вставленный в сайте BamHI вектора в такой ориентации, что сайт Xbal в HBV ДНК расположен близко к сайту Sall вектора

pBR327.. в) рй!Т10909.

HInd И! фрагмент 3300 bp из плаэмиды рМС200 клонируют в производную плаэмиды pBR322, в которой EcoRI сайт удаляют путем заполнения полимеразой Т4 ДНК, и повторным лигированием отбирают плаэду pRIT10158, в которой Hind !И имеет 3 ласть arg гена. Фрагмент 1150 bp Clafael l l извлекают из pRIT10158, он содержит ончания транскрипции гена arg . Этот рагмент 1150 bp лигируют с Clal-Hpal агментом ДН К плазмиды р ЮТ10677. Iloa ают плаэмиду pRIT10909.

Il р и м е р 5. Сайт BamHI рй!Т10167 ример 1), расположенный в области предественника HBs Ag гена, иэ HBV вируса

1746887

adW серотипа, клонированного на

pRIT10616, находится в одинаковой трансляционной рамке считывания. Источником

НВЧ ДНК фрагмента является плазмида

pRIT10909. Фрагмент 2085 Ьр EcoRI-BamHI выделяют из pRIT10909 и встраивают в сайт

EcoRI u BamHI плазмиды pRIT10909 и получают плаэмиду pRIT10911, Фрагмент 3134

bp Hind П1 из pRIT10911, содержащий сигналы транскрипции дрожжевой ДНК и ДНК

HBsAg, встраивают в челночный вектор

УЕр13 с получением плазмиды pRIT10912.

Пример 6. Сконструированы плазмиды, у которых удалены избыточные нуклеотиды из 5 конца фрагмента ДНК, кодирующего N-терминальную часть при родной HBsAg.

1225 bp FnUD II фрагмент HBV ДНК из

pRIT10616 и кодирующий HBsAg ген вырезают из этой плазмиды и лигируют с EcoRI, фрагмент клонируют в EcoRI сайт вектора рАСУС184 с получением pRIT10679. Получают 125 Ьр EcoRI-Xbal фрагмент, который содержит терминальную область HBsAg предшественника. HBsAg ATG кодон и 90 Ьр

-HBsAg кодирующую последовательность.

Этот 125 Ьр EcoRI-Xbal фрагмент встраивают в сайты EcoRI u Xbal pRIT 10158. Полученная плазмида pRIT 10903 содержит единственный

i сайт EcoRI, расположенный при стыке между, arg ДНК и НВЧ ДНК и единственный сайт Xhol„ расположенный в области стимулятора.

150 мкг pRIT10903 плазмидной ДНК, которую получают с помощью центрифугирования в градиенте плотности CsCI этиленбромида, обрабатывают 80 ед. зндонуклеаэы EcoRI, после чего экстрагируют фенолом, осаждают зтанолом и вновь суспендируют при концентрации 1 мкг на 1 мкл в 10 мМ буфере трометамин-HCI (рН 7,5).

ДНК разделяют на три образца по 50 мкг и инкубируют в течение 50, 75 и 90 с с нуклеазой Ва!31 при 30 С. К50мкг EcoRI обработанной pRIT10903 ДНК, добавляют 2,5 ед. нуклеазы Bal31 в конечном объеме из 500 мкл. Реакцию останавливают путем добавления EGTA к 20 мМ конечной концентрации, охлаждают на льду, экстрагируют эквивалентным объемом фенола и осаждают этанолом, Образцы ДНК, обработанные

Ва131, берут в 50 мкл 10 мМ буфера трометамин-HCI и 2,5 мкг дополнительно обрабатывают зндонуклеазой Bst Ell. выделяют

285 bp фрагмент нуклеазой в течение 75 с при 30 С, уменьшает размер фрагмента,Есо

Rl-Bst Ell на 10-60 основных пар. Удаление на 29 основных пар из Fnud П сайта удаляют весь HBsAg предшественник ДНК и HBsAg

ATG кодон.

5 мкг pRIT10903 ДНК обрабатывают в течение 75 с Bai31, гидролизуют 8 ед. Xhol нуклеазы, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Эту ДНК затем инкубируют с .

5 ед, Т4 ДНК полимераэы в присутствии диоксинуклеотидтрифосфата дпя заполнения сайтов Xbal и Bal31. обрабатывают фенолом и осаждают зтанолом. Затем ДН К инкубируют с 5 ед. Т4 ДНК лигазы в течение

16 ч при 16 С и смесь используют для трансформации компетентных клеток Е.coll К12

l0 штамма ММ294. Около 2000 колоний, устойчивых к ампициллину, на 1 мл извлекают после посева, выделяют плазмиды из 47 индивидуальных колоний.

Одну плазмиду, содержащую фрагмент

Xhol-Xbal размером 95-100 основных пар.

15 выбирают для исследований. ДНК этой плазмиды очищают с помощью центрифугирования с градиентом плотности CSCI-этиленбромид и 25 мкг такой ДНК гидролизуют

140 ед. эндонуклеазы Xbal.

Концы Xbal метят y- P ATP и меченую

ДНК обрабатывают 15 ед, эндонуклеазы

Hind Пl. Фрагмент 765 Ьр Hind III — Xbal изолируют акриламидным гелевым электрофорезом и электроэлюированием, после че25 го осаждают этанолом. Нуклеотидную последовательность вокруг сайта Xhol определяют последовательным анализом этого фрагмента от меченого конца Xbal. Данные о последовательности показывают, что сайт

Ппазмиду pRIT12209 очищают центрифугированием с градиентом плотности смеси CS CI-этилбромид и 50 мкг pRIT12209

ДНК гидролизуют с 90 ед. эндонуклеазы

BamHI и 60 ед. Xhol зндонуклеаэы дпя удаления 990 bp периферической ДНК между стимулятором TDH3 и HBsAg кодирующей областью и затем экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. 16 мкг этой ДНК инку55

Xhol расположен на первой основе второго кодона HBsAg кодирующей последовательности;

Xhol, 35 CTCGAGAAC, HBsAg нуклеотидов, Пример 7. Плазмиду pRIT10911 используют в качестве носителя для дальнейших манипуляций. Плазмиду гидролизуют

40 эндонуклеазами BamHI и Xbal, и этот фрагмент замещают на фрагмент 2275BamHIXbal из плазмиды рЯIТ10158, Получают плазмиду рЯ1Т12211.

Плаэмиду pRIT12211 обрабатывают эн45 донуклеазами Xhol и Xbal, и удаляют фрагмент 1600 bp, Этот 94 Ьр фрагмент очищают акриламидным гелевым электрофорезом, эпект роэлюируют соответствующий гелевый срез и извлекают ДНК этанопом дпя

50 осаждения, 1746887

1 бируют в течение 30 мин при 30 С с 20 ед.

Мунг Бин нуклеазы в объеме 125 мкл.

Буфер, используемый для инкубирования, представляет собой 30 ммоль ацетата натрия (рН 4,6), 250 ммоль хлористого на- 5 трия,.1 ммоль хлористого цинка и 57, глицерина. Реакцию останавливают добавлением додецилсульфата натрия с получением

0,2 -ной конечной концентрации, проводят экстрагирование эквивалентным объе- 10 мом фенола, после чего осаждают этанолом.

Аликвоту 0,5 мкг этого образца инкубируют

2 ед. Т4 ДНК лигазы в течение 16 ч. при 16 С и затем проводят обработку 2 ед. эндонуклеазы BamHI для разрушения каких-либо 15 векторных молекул. Зту смесь используют для трансформации клеток Е.coll К12 штамма ММ294. извлекают около 2000 устойчивых к ампициллину колоний.

Четыре плазмиды берут для дальнейше- 20 го исследования. ДНК каждой плазмиды переваривают Xbal эндонуклеазой и метят

P-ATP, после чего гидролизуют эндонукзг леазами Hind III и выделяют меченый 1190

bp фрагмент Hind.ll! — Xbal с помощью алек- 25 троэлюирования и этанольного.осаждения с последующим акриламидным гелевым электрофорезом. Последовательность каждого . фра мгнта определяют методами химической модификации-Максама и Гильберта. 30

Две плазмиды имеют точную последовательность ATGGAGAAC для полного слияния области стимулятора TDH3 с HBsAg геном.

Одную из этих плазмид (pRIT12230).используют в дальнейших манипуляциях. ДН К этой 35 плазмиды (pRIT12230) гидролизуют зндонуклеазами Hind III и 300 bp фрагмент, содержащий HBsAg кодирующую последовательность, слитую-с TDH3 стимулятором, лигируют с челночным вектором УЕр13. 40.

Полученной плазмидой pRIT12265 транс.формируют дрожжевой штамм DC5 (МАТа, leu 2-3; leu 2-112, his 3, can 1 — 11).

П р и.м е р 8. 25 мкг ДНК pRIT12230 гидролизуютс эндонуклеазами Асс! и Есой!, 45

pRlT12230 содержит единичный сайт Accl, расположенный в S-ген кодирующей после- довательности за 7 нуклеотидами перед

ТАА стоп-кодона. Проводят электрофорез гидролизацией ДНК на 1 -ном агарозном 50 геле и извлекают векторный фрагмент 4200

Ьр из геля с помощью электроэлюирования и этанольного осаждения. Молекулы, связывающие искусственную ДН К, составленные из 12-член ного (12-mer) витка и 14-член ного (14-вег) линкера со следующими последовательностями синтезируют для вставки между Accl и Есо1;!!.центрами pRIT12330;

5 ATACATTAAGG 3, 12 mer.

3 TGTAAATTGCTTAA 5, 14 mer.

100 пмоль синтетического 12 mer и 100 пмоль синтетического 14 mer линкера смешивают вместе в конечном объеме 10-20 мкл. нагревают при 70 С в течение 15 мин. медленно возвращают к комнатной температуре в течение 3 ч и обеспечивают обжиг двух витков вместе с их комплементарными последовательностями. К этой отожженной смеси добавляют 0 15 пмоль (400 нг) 4200 Ьр

Accl-EccRI фрагмента pRIT12230 10-кратно концентрированного буфера для лигирования и.2 ед. Т4 ДНК лигазы.

Зту смесь инкубируют в течение 4 ч при

16 С перед добавлением дополнительных 2. ед. Т4 ДНК лигазы и затем инкубируют в течение ночи на льду. Смесь после лигирования используют для трансформации компетентных клеток штамма ММ294.

Выделяют плазмиды из 12 или более индивидуальных колоний, Плазмиду со вставкой Accl-EcoRI гидролизуют,эндонуклеазами EcoRI и обрабаты- вают щелочной фосфатазой. Фрагмент 2650

bp Hind III pRlT10162,клонируют в сайте

Hind III pBR327 векторной плазмиды, получают плазмиду pRIT12288.

Из pRIT12288 получают фрагмент 1180

bp EcoRI, который несет arg. транскрипционную терминационную область. Зтот фрагмент клонируют в сайт EcoR1 производной

pRIT12230, которую обрабатывают щелочной фосфатазой.

Выделяют 2900 bp. Hind III-фрагмент из

pRIT12322.

Пример 9. Плазмида pRIT12322 содержит 2900 Ьр Hind И! фрагмент;со всеми необходимыми сигналами для экспрессии

HBsAg из TDH3 стимулятора. Этот фрагмент лигируют с челночным вектором для введения в клетки дрожжей.

ДНК челночного вектора УЕр13 обрабатывают эндонуклеазой Hind И! и щелочной фосфатазой и используют в качестве реципиента для введения Hind И! фрагмента из

pRIT12322. Получают плазмиду pRIT12329„ которая состоит из репликона УЕр13 вместе с 2900 bp Hind !!! модульным фрагментом. . Пример 10. Плаэмиду WP201 получают в результате введения Есой! фрагмента из ilmPfl в вектор pUC8. Фрагмент плазмиды WR201, содержащий CS белковую кодирующую последовательность минус первый

52 Ьр. очищают электроэлюировэнием из

7,5®-ного полиакриламидного электрофоретического геля. Зтот фрагмент обрабатывают Sau ЗА. BamHI плазмиды pRIT10911, расположенный при ATG кодоне инициации, находится в фазе с sau 3A сайтами CS

1746887

Plasmodium falc!parum, ДНК плаэмиды

pRIT10911 обрабатывают с BamHI эндонуклеазами, щелочной фосфатаэой. экстагируют фенолом и извлекают осаждением этанолом. 0,2 мкг этой ДНК смешивают с 0,2 мкг Sau 3A обработанного Stu I-RSal CS гена, обрабатывают Т4.ДН К лигазой, и лигированную смесь используют для трансформации компетентных клеток Е.coll К12 штамма ММ294. Получают 32 плазмиды иэ индивидуальных трансформантных колоний после амплификации плаэмиды путем .добавления спектиномицина (300 мкг на 1 мл) для выращивания культуры. Рекомбинантные плазмиды анализируют на 7,5%ном акриламидном электрофоретическом геле, после гидролиза с эндонуклеазами

BamHI и Xbal, HInd 111 фрагменты pRIT12572 и

pRIT12571, содержащие стимулятор TD НЗ, С$-HBsAg гибридную кодирующую последовательность и atg область терминации, з вновь клонируют в УЕр13 и получают плазмиду pRIT12574 и pRIT12573, Плазмиды pRIT10912; pRIT 12574 и

pRIT12573 вводят в S.cerevisiae дрожжевой штамм ДС-5(а, Ieu 2 — 3, leu 2-112. his 3, Can

1- i) и в S.cerevlslae дрожжевой штамм 10

$44С (рер 4-3. Ieu 2-3, leu 2-112) трансформацией клеток. обработанных ацетатом лития.

Плаэмидную ДНК pRIT12572 или

pRIT12571 гидролизуют BamHI эндонуклеазой и обрабатывают щелочной фосфатазой.

1215 Ьр Stul — RSal фрагмент плазмиды

WR201 обрабатывают Sau ЗА эндонуклеазой и выделяют 192 Ьр и 24 bp фрагмент. Эти фрагменты смешивают с pRIT12572 или

pRIT12571 векторами, которые предвари. тельно обработаны BamHI, щелочной фосфатазой и ТН ДНК лигазой, трансформируют клетки E.coll К12. Проводят скриннинг плазмид из трансформантных колоний. Наличие BamHI сайта на таких плазмидах подтверждает введение 192 Ьр или 24 Ьр Sau ЗА фрагмента в точной ориентации для слияния при ATG кодоне.

Плаэмида pRITI2309 состоит из Ьр 2 микронной ДНК последовательности из дрожжей, клонированных в EcoRI сайте плазмидного вектора pBR327, 6318 Ьр 2 микронную ДНК последовательность получают иэ плазмиды рС V19.

2850 Ьр Clal — Sall фрагмент, содержащий TD НЗ вЂ” arg и расположенные Моку последовательности pBR322 из pRIT12290, клонируют в векторе pRIT12309 между сайтами Cia al и Sall, Полученную плазмиду

pRlT12314 гидролизуют с Sail эндонуклеазой и лигируют с 2218 bp Sall-Xhol фрагмен10

15 рина, 4% SDS, 6 М мочевины и 10% 2-меркаптоэтанола. Пос;е инкубирования в

30 течение 5 мин при 100 С образец делят по35

40 желатиной в PBS. Фильтр последовательно промывают пять раз в течение 5. мин каждый . раз PBS, содержащим 0,1% Tween-20, и одние 1 ч при комнатной температуре смесью

45 пяти моноклональных антител против CS белка в PBS 1% желатины, Другую половину пластины обрабатывают моноклональным антителом против HBsAg, Неру TAS 12. в

PBS, 1% желатина. Фильтровальные пла50 стины промывают 5 раэ в течение 5 мин каждый раэ с P BS, 0,1% Теин-20 и добавляют биотинированные антитела овцы к IG мышцы в РВ$1% желатины в течение 1 ч при комнатной температуре, Пластины снова

25 том иэ УЕр13, содержащего дрожжевой I eu

2 ген.

Плаэмиду pRIT12544 получают из колоний, в которых плазмидную ДНК содержит

2218 Ьр Sal 1-Xhol фрагмент с leu 2 геном, который введен в сайт Sall.

3328 bp Hind 111 фрагмент pRIT12574, а также ДНК УЕр13 клонируют на pBR322

hBamHI плазмиде и получают pRIT12608

2550 Ьр BamHI Sall фрагмент из рВТ12608, содержащий CS HBsAg, arg3 область терминации транскрипции pBR322 последовательность, клонируют между

BamHI u Sall сайтами pRIТ12544 и получают плазмиды pRIT12658.

Пример 11. Трансформируют дрожжевые (Saccharomyces cerevisiae) штаммы

DC5 и 10 S 44С каждой иэ плазмид

pRlT10912, pRIT12573, pRIT12574 или

pRIT12659, или плазмид pRIT12329, pRIT10172 и выращивают в жидкой среде с недостатком лейцина (VNB или VNB + 80 мкг/мл гистидина) с последующим сбором культуры в средней лог-фазе. Клетки в культуре 1 или 2 мл отбирают путем центрифугирования и суспендируют в 50 мкл 0,125 М трис-НО (рН 6,8), содержащих 20% глицеполам и обе половинки подвергают электрофореэу через 12 5% разделяющий гель, 5% слоистый гель согласно методу Лаемли.

HBsAg u CS белковую последовательности идентифицирую с помощью методики иммуноокрашивания белка

После нанесения белков на нитроцеллюлоэном фильтре фильтр предварительно инкубируют в течение 1 ч при 37ОС с 3%,ну половину пластины обрабатывают в течепромывают PBS, 0.1% Твин-20, 5 раз в течение 5 мин каждый раз и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре с . комплексом стрептакидинбиотинсодержащей пероксидаэой хрена (HRP), Пластины снова промывают 3 раза пп.5 мин;каждый

1746887

5

15

20 ге. Отобранные фракции испытывают на присутствие HBsAg u CS антигенов.

25 Анализ на иммуноокраску градиентных

35

40 трацией.

50 Окончательно очищенный от клеточного экстракта 10$44С pRI 712574 дает один основной пик на колонке HPZC TSK-300(ЛКВ), который содержит антитела HBsAg u CS.

Электрофорез на SDS полиакриламидном

55 геле с последующим окрашивэнием свребраз PBS, 0,1% Твин-20, и инкубируют с 30 мкл Н202 и HRP-содержащими 4-хлоролнафтола. 30 мг в 10 мл метанола, в 50 мл

P BS.

Молекулярный вес антигенов оценивают с помощью предварительно окрашенных белковых маркеров, овальбумина, альфахимотрипсиногена, бета-лактоглобулина, лизоцима, цито хрома C(B И ().

Оба дрожжевых штамма DC5 и 10$44

С, трансформированные с pRITI2573, синтезируют антиген, реагирующий как C анти-CS. так с анти-H8s Ag антителами, и их молекулярный вес составляет 30000 килодальтон (И). Оба дрожжевых штамма ОС5 и

10S 44С, трансформированные pRITI2574 или с pRITI2658, синтезируют антиген, способный реагировать как с анти-CS, так и с анти-HBsAg антителами и молекулярный. вес белка составляет 3?000 kd, Эти результаты показывают, что гибридный белок ожидаемого молекулярного веса. содержащий как CS, так и HBsAgпоследовательности, синтезируется в дрожжах, трансформированных плазмидой, содержащей

С$ кодирующую последовательность, слитую с кодирующей последовательностью Pre S2HBsAg.

Пример 12. Дрожжевые (Saccharomyces cerevlsiae) штаммы DC5 или . 10S 44С, содержащие.или pRIT10172, pRIT12329, pRIT12573.или pRIT12574, виращивают в селективной среде (200 мл VNB или VNB + 80 мкг/MR гистидина) до конца лог-фазы. Клетки отбирают центрифугированием и вновь суспендируют в 10 мл 50 мМ буфера из фосфата натрия (рН 7,4), содержащего 0,5% Твин-20 (полиоксиэти-. ленсорбитанмонолаурат), 1 ммоль PMS (фенилметилсульфонилфторид) и 2,5% изопропанола, Клетки разрушают путем пропускания через французский пресс при 20000 . PsI (1,38х10 Па). Суспензию центрифугируют в течение 30 мин при 30000xg.

Измеряют общую концентрацию белка 4 в верхнем слое жидкости (сырой клеточный экстракт) использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Наличие HBsAg определяют с помощью радиоиммунного испытания. Наличие С$-по-. следовательностей в HBsAg частицах испытывают в ELISA тестах, Соответствующие разбавления образцов, которые испытываются (в PBS, содержащем О;2% BSA), позволяет проводить реакцию (в течение ночи при комнатной температуре) в твердой фазе анти-HBsAg. Связанные HBsAg частицы инкубируют в течение 1 ч при 370С

1/10000 разбавлением (в РВ$, содержащем

О,Щ BSA) смеси пяти моноклональных антител, причем первое антитело к CS белку, и затем инкубируют с 1/500 разбавлениями (в PBS, содержащем 0,1% 8$Я) биотин содержащего анти-мышиного Jg овцы в качестве второго антитела в течение 1 ч при

37 С. Инкубируют с 1/1000 разбавлением (s .

PBS, содержащем 0,1% BSA) комплекса стрептавидин-биотинсодержащей пероксидазы хрена и хромоген в течение 30 мин при

37 С.

Измеряют концентрацию белков и активность в сырых клеточных экстрактах.

Плазмида pRIT12574 показывает более чем в десять раз меньшую активность.

Активность AUSRIA в сырых клеточных экстрактах приведена в табл.1.

Опыт ELISA показывает, что pRIT12573 и pRIT12574 кодируют HBsAg u.CS зпитол, 1 мл сырых клеточных экстрактов смешивают с 1.5 М CsCI в 50 мМ растворе фосфата натрия (рН 7,4) и центрифугируют в течение 40 ч при 40000 g в ультрацентрифуфракций подтверждает результаты

RtA/ELISA. HBsAg и/или CS-последовательности обнаруживают только в тех фракциях, которые не реагируют в испытаниях

RIA/ELISA (табл.2).

HBsA9 и CS эпитопы, присутствующие в антигенах, связанных с иммобилизованными анти-HBsAg антителами приведены в табл.2;

Эти результаты указывают, что гибридный протеин, получаемый при экспрессии рй1Т12573 и pRIT12574, объединяется в частицы, подобные 22 нм частицам HBsAg npu синтезе в клетках дрожжей.

Пример 13. Неочищенный клеточный экстракт дрожжевого штамма 10S 44С, содержащий pRIT12574, осветляют осаждением полиэтиленгликолем (PEG) 400 и концентрируют ультрацентрифугированием.

Дальнейшую очистку гибридных частиц проводят CsO центрифугированием, гидроксиапатитной хроматографией и гель-фильром дает одну основную полосу молекулярного веса 37000 kd. Данные электронной микроскопии после окрашивания уранилацетатом дают примерно такие же значения

1746887

16 размеров и формы частиц, что и для HBsAg, полученным из дрожжей.

Серые дрожжевые экстракты получают разрушением дрожжевых клеток в присутствии равного веса 50 MM натрийфосфатного буфера для экстракции (рН 8,1), дополненного 4 мМ Titrlplex III, 1 f, Твин-20;

4 мМ PMSF и 10 )(, изопропанола, Клеточные осколки удаляют центрифугированием при

11000 g в течение 90 мин, 50 мл отцентрифугированного экстракта доводят до рН 7,2

1 н. уксусной кислотой и перемешивают в течение ночи при 4 С в присутствии 10 г коллоидной двуокиси кремния. Затем суспензию центрифугируют при 3,500 g в течение 1 ч и полученный осадок промывают. трижды 150 мл 0,15 М NaCI, дополненного 2

MM PMSF и 5 мМ ЕДТА в течение 15 мин.

Элюируют 250 мл 10 мМ фосфатного буфера (pH 9,5), содержащего 2 Твин-20 при 370С в течение 3 ч. К десорбату добавляют по каплям 1М раствор CaClz до окончательной концентрации 30 мМ СаС!2 и устанавливают

pH = 7. Полученный раствор оставляют на ночь при 4 С и центрифугируют при 6500 g в течение 15 мин, Надосадочную жидкость подвергают диализу (2x51x10 мМ трис-НС!, рН 7,1) при 4 С и затем разбавляют 4 раза диализным буфером.

После добавления 30 мМ СаС!г и 1М

NaCI разбавленный раствор антигена с рН

7,1 пропускают над колонкой 150 мл с фенил-сефарозой. уравновешенной тем же

CaCIz(NaCI, содержащим трис-буфер со скоростью потока 30 см/ч. Последовательно колонку. промывают равновесным буфером до тех пор пока 00280 нм (оптическая плотность) не снижается до О, и элюируют с той же самой скоростью потока 6М мочевины в

10 мМ трис-HCI рН 9.

В другом варианте деалиэованный и разбавленный в четыре раза раствор антигена дополняют 20;(NHг>

В радиоиммунном анализе неочищенные клеточные экстракты из pRIT12660 дают положительную реакцию, тогда как неочищенные клеточные экстракты из pRIT12363 не дают положительной реакции.

Вышеприведенные результаты показывают, что дрожжевые клетки, содержащие

pRIT12660, экспрессируют HBsAg

AUSRIA активности в неочищенных клеточных экстрактах даны в табл.4.

Пример 20. Дрожжи, трансформированные pRIT22660, выращивают в селективной среде, либо в колбах Эрленмейера, либо в ферментерах в log фазе и собирают центрифугированием.

К клеткам (0,1 г) добавляют вначале 20 мкг 40 мМ PMSF в изопропаноле, а затем

200 мкл образца буфера для электрофореза на SDS-полиакриламидном геле (0,125 M трис-HCI, рН 6.8. содержащий 20% глицерина, 4 SDS, 6 M мочевины и 10% 2-меркаптоэтанола), Образцы вращают и аликвоты

2-20 мкл разбавляют далее в образце буфера до конечного объема 40 мкл, инкубируют в течение 5 мин при 100 С и обрабатывают электрофоретически.

После электроблоттинга протеинов на нитроцеллюлозном фильтре полученные фильтры предварительно инкубируют в течение 1 ч при 37 С с 3% желатина в pBS.

Фильтр инкубируют с моноклональными антителэми к HBsAg и наличие связывания определяют последовательным инкубированием с биотинированным овечьим антимышиным Ig (разбавление 1/250 в PBS. содержащем 1% желатина), стептавидинбиотилированным комплексом пероксидазы хрена (разбавление 1/400 в PBS, содержащем 1 желатина) и, наконец, 30 мкл Н202 и HRP-реагентом проявления цвета. содержащим 4-хлор-1-нафтол, 30 мг в 10 мл метанола промывают PBS, содержащим

0,1 Твин-20.

Иммуноблот дает 4 полосы протеина, связанные с S-протеином определенного молекулярного веса 33, 30, 28 и 25 kd. Основную часть связанного с S материала обнаруживают в полосе протеина 33 kd.

Наименьшая детектируемая полоса протеина мигрирует медленнее, чем S протеин„ синтезированный в дрожжах.

Пример 21, Измельчают дрожжевые клетки в присутствии буфера (200 мМ трис, .

3 М NaCI. 10 мМ ЕДТАа, 10 мМ этиленгликоль-бис (бета-аминоэтиловый эфир) N, N, N, N-тетрауксусной кислоты (EGTA), 4 мМ

PMSF 10% изопропанола) с последующим центрифугированием в течение 45 мин при

30000.g.

Клеточные экстракты pRIT12660 частично очищают от клеточного экстракта ультрафильтрацией, CSCI равновесным центрифугированием и гидроксиапатитной хроматоГрафией 4 полосы протеина S-связанного материала детектируют на этих стадиях очистки анализом Вестерн-блат, очищают на этих стадиях очистки. Иммуноб,потный анализ AUSRIA положительных С$О фракций после равновесного центрифугирования показывает, что четыре $-связанные полосы присутствуют в тех же относительных соотношениях в каждой фракции.

Пример 22. Сывороточный альбумин человека полимеризуют глутаральдегидной обработкой и очищают, Очищенные клеточные лизаты pRIT122660 разделяют электрофорезом на акриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Нитроцеллюлозный фильтр последовательно инкубируют с PHS А (15 мкг) мл в PBS, содержащем 1% желатина), антисывороткой кролика к альбумину человека, биотинированным анти-кроличьим lg обезьяны (1/250 разбавление в РВ$, содержащем 1% желатина), стрепавидин-биотинированного

22

1746887

21 пероксидаэой хрена (1/400 разбавление в

PBS, содержащем 1 желатина) и, наконец, Н202 и 4-хлор-1-нафтол.

Две самые крупные S-связанные протеиновые полосы (33 kd и 30 kd) подвергают взаимодействию с рН SA, а две самые меленькие (28 и 25 kd) не дают реакции.

Пример 23. Синтезируют петид со следующей формулой: NHz-Met ОЬ-TrpAsn-Ser-Thr-Ala-Phe-Нls-Glï-Ala-Leu—

Gln-Asp — Pro-Arg-На! — Arg-Gly-Leu-Tyr Le

u-Pro — Ala, Gly — Cys — COOH. Кроликов иммунизируют подкожно 100 мкг конъюгата (что соответствует 20 мкг пептида) в полном адъюванте Фрейнда, повторно иммунизируют на 8 и 15 день следующими 10 мкг конъюгата в полном адъюванте Фрейнда, а на 28, 69 и

149 день 100 мкг конъюгата в РВ$. За выработкой титра антител следят, отбирая образцы крови через определенные промежутки времени, и проверяют разбавление сыворотки инкубированием на синтетическом полипептиде, фиксированном на твердой фазе. Связанные антитела детектируют иодированным протеином А. Сыворотку используют после 100-кратного разбавления или после частичной очистки IgG, IgG частично очищают осаждением Naz$04 (120 мг на 1 мл сыворотки), повторно суспендируют в PBS и переосаждают 14% Naz$04. Повторно суспендированный Ig раствор обессоли.вают, пропуская через PD 10 колонку, Определение реакционной способности протеинов в иммуноблотах осуществляют с помощью биотинированного анти-кроличьего Ig обезьяны, стрепатавидин-биотинированной пероксидазы хрена и Н202 и

4-хлор-1-нафтолом, Протеины из частично очищенных препаратов рИТ12660 выделяют электрофорезом. на S0S полиакриламидном геле и переносят на нитроцелл юлозу. Иммуноблот показал, что две более крупные полосы протеина (33 kd и 30 kd) реагируют с антителами.

Пример 24. Частично очищенный препарат диссоциируют с помощью SDS u протеины разделяют электрофорезом на акриламидном геле. После переноса протеинов на нитроцеллюлозу полученные мембраны инкубируют с десятикратно разбавленным гамма-глобулином гепатит В, ñîдержащим 1 желатина. Связывание антител определяют последовательным инкубированием с помощью биотинированного античеловеческого Ig овцы (1/250 разбавление в PBS, содержащим 1 желатина), стрептавидин-биотинированной пероксидазы хрена,,и наконец, HzOz u

4-хлор-1-нафтолом.

Две наиболее крупные протеиновые полосы (33 и 30 kd полосы) подвергают взаимодействию с антителами человека. две наименьшие (28 и 25 kd полосы) нв дают реакции. $ протеин, полученный из частиц из дрожжевых клеток, содержащих

pRIT12363. не взаимодействует с этими человеческими антителами.

0062опм - 0,2. Туникамицин добавляют до конечной концентрации 10 р г/мл и культу, ры инкубиоуют в течение 3 мин при 30 С.

45 Затем добавляют 20 рл CI S-метионина (1000 Cl/ììoëü) на 1 мл смеси и культуры инкубируют еще в течение 15 мин. Меченую клеточную культуру в количестве 2 мл, обработанную или необработанную туникамицином, центрифугируют s микрофуге и

50 спрессованные клетки повторно суспендируют в 40р 1 SDS, после чего их разрушают путем перемешивания в смесителе В течение 2 мин в прису