И. в. курчатова и институт элементоорганических соединений ан ссср

И. в. курчатова и институт элементоорганических соединений ан ссср

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАk ИЕ l74940

ИЗОБ РЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 05.VI.1964 (¹ 905422/28-13) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 07.IX.1965. Бюллетень № 18

Дата опубликования описания 12.XI.1965

Кл. 53g, 4pq

12q, 6„, Государственный комитет ло делам изобретений и открытий СССР

МПК А 23k

С 071

УДК 663.132:576.8.097.

35 (088.8) Авторы изобретения

С. И. Алиханяи, В. M. Беликов, С. В. Гордиенко, 3. М. Зайцев

С. П. Легчилина, С. 3. Миндлин, К. С. Михайлов, В. И. Пенкин и А. И. Тищенко

Институт атомной энергии им. И. В. КУРЧАТОВА и Институт элементоорганических соединений АН СССР

Заявители

СП ОСОБ П РОИ 3ВОДСТВА 1-Л ИЗ И НА

Подписная группа № 22б

Предлагаемый способ обеспечивает получение l-лизина в больших количествах для широкого применения его в различных отраслях народного хозяйства.

В сельском хозяйстве ощущается недостаток

l-лизина, являющегося незаменимой аминокислотой. Добавление его в корм значительно увеличивает суточные привесы, уменьшает расход кормов. Лизин применяют и в пищевой промышленности, а также в медицине.

Известны способы производства l-лизина путем глубинного выращивания его продуцентов на питательной среде, содержащей сахар, азотные, фосфорные соли, кукурузный экстракт, последующего отделения клеток от культу ральной жидкости одним из известных приемов, например центрифугированием, очистки фильтрата ионообменными солями, элюции лизина аммиаком с упариванием элюата для удаления последнего, подкисления элюата для перевода лизина в монохлоргидрат, кристаллизации монохлоргидрата из раствора при добавлении спирта с последующей сушкой монохлоргидрата.

Предлагаемый способ обеспечивает более качественную очистку l-лизина. Для чего выделяют 1-лизин на катионообменной смоле в два этапа: первоначально на смоле в Иа+ форме, а затем в Н+ форме.

Для увеличения выхода l-лизина маточный раствор, получаемый после отделения монохлоргидрата, следует добавлять к исходной культуральной жидкости, подлежащей очистке.

В качестве продуцентов 1-лизина целесообразно использовать двойной биохимический мутант М-glutamicus, полученный из исходного штамма одним из известных приемов, на1о пример ультрафиолетовым или рентгеновским облученем, с последующм отбором.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

В качестве продуцента 1-лизина используют двойной биохимический мутант М-glutamicus с нарушенным биосинтезом некоторых аминокислот, для чего суспензию клеток М-glutamicus АТСС 13032, образующую лишь следы

l-лизина, обрабатывают либо быстрыми ней20 тронами, либо рентгеновскими лучами, либо ультрафиолетовыми лучами, после чего с помощью селективной методики из 10> — 10 выживших клеток отбирают единичные клетки первичного биохимического мутанта, нуждаю25 щегося в гомосерине или метионине с треонином. Затем клетки этого биохимического мутанта вновь обрабатывают быстрыми нейтронами или рентгеновыми лучами и на селективных средах проводят отбор двойных биохими30 ческих мутантов, нуждающихся помимо гомо174940 серина в одной из нижеследующих аминокислот: лейцине, изолейцине, цистеине, цистине, треони е. Хранят полученные штаммы в виде лиофильпо высушенных культур в стеклянных ампулах.

Размножают культуру в несколько этапов.

Для этого лиофильный материал из ампул высевают на косой агар Хоттингера и инкубируют при температуре 30 — 33 С в течение 24 час.

Культуру с косяка переносят либо на жидкую посевную среду, содержащую 2% кукурузного экстракта, 2% мелассы и 0,4% NaCI, либо на мясо-пептонный бульон с 2% глюкозы и инкубируют в колбах, на качалке при температуре 28 — 30 C в течение 16 — 24 час. Вырос- 15 ший посевной материал размножается в инокуляторах па питательной среде с 2% кукурузного экстракта, 2% мелассы и 0,4% NaCI в течение 18 — 24 час при температуре 28—

ЗО С. Инокулят должен содержать не менее 20

2 — 5X109 клеток в 1 мл. Посевной материал из инокулятора передают в фермептер в количестве 0,5 — 5% (по объему) .

При этом для процесса биосннтеза используют л:обую из четырех следующих сред: среду № 1 с 15% мелассы, 2% кукурузного экстракта, 2% NHgNOg, 2% технического мела; среду № 2 с 15% мелассы, 3% рыбного экстракта, 2% NH„CI, 1% технического мела; среду № 3 с 15% мелассы, 2% ХНаИОз, 20% гидролизата арахисового шрота (2% арахиса) и 1 % технического мгла; среду № 4 с 6% кукурузного экстракта, 2%

ХН О и 3% СаСО, приготовленную на гидролизате кукурузной кочерыжки с 10% редуцируюших веществ, который предварительно нейтрализуют и освооождают от сульфатов.

Первые три среды приготовляют на водопроводной воде.

Перед началом ферментации значение рН должно быть близким к нейтральному (перед стерилизацией рН среды доводят раствором

NaOH до 7,1 — 7,3). Оптимальная аэрация для указанных сред составляет 6 — 10 л1г О./л в 45 мин. Оптимальная температура процесса биосинтеза 28 — 31 С.

При соблюдении оптимальных условий ферментации максимальное накопление l-лизина наблюдается к 60 — 64 час. В течение после- 50 дующих 24 час содержание l-лизина остается на том же уровне, после чего содержание его падает.

Спустя 48 и 60 час с начала ферментации из аппаратов отбирают пробы для количествен- 55 ного определения l-лизина в культуральнои жидкости, которое проводят методом бумажной количественной хроматографии илн микробиологическим методом.

Полученную культуральную жидкость пред- 60 варительно освобождают от бактериальных клеток и мела, в результате чего получают прозрачную жидкость, свободную от взвешенных частиц. Если в культуральной жидкости отсутствуют нерастворимые неорганические 65 соли, то очистку не производят. В этом случае культ ральную жидкость подвсрга1от дальнейшей обработке вместе с бактериальнымп клетками.

Затем культуральную жидкость, свободную от бактериальных клеток или с ними, пропускают через слой смолы КУ-2Х8, предварительно переведенной в Na+ форму, соблюдая при этом объемное соотношение пропущенной культуральной жидкости к объему смолы, равное 1: 2 и молярное соотношение неорганических катионов к l-лизину в культуральной жидкости, равное 5:,1 — 7: 1. В случае, если последнее соотношение меньше 2, то на один объем смолы можно давать 4 объема культуральной жидкости. При этом смолой удерживается лизин и часть катионов (неорганических), отличных от Ка+. Сопутствующие нейтральные и кислые аминокислоты, а также остатки мелассы и пигментные примеси проходят сквозь смолу, не задерживаясь, и их окончательно удаляют последующей промывкой смолы деионизированной водой (3 — 4 объема деионизированной воды на 1 объем культуральной жидкости) .

После промывки водой лизин выделяют из смолы при промывке последней 10 — 15% водным раствором аммиака, причем собирают ту фракцию, которая показывает величину удельного вращения плоскости поляризованного света, отличную от О. Контролируют процесс па проточном поляриметре. По окончании сбора нужной фракции промывку смолы аммиаком прекращают и начинают промывать смолу

10 — 15%-ным раствором NaCI для регенерации Na+ формы. Смолу промывают деионизированной водой до отрицательной реакции на

СI, после чего смола готова для повторного применения.

Фракцию лизина, содержащую аммиак, обрабатывают для удаления его, например прогревают, после чего водный раствор лизина, содержащий до 8 0% лизина и некоторое количество неорганических солей Ха+, пропускают через смолу КУ-2 с любой степенью поперечной сшивки в пределах от 8 до 20 (лучше 20) в Н+ форме. Количество смолы, треоуе»ое для этой операции, составляет 0,2—

0,5% количества смолы в Na+ форме. При этом происходит удержание смолой лизина и катионов Иа+. При последующей промывке денонпзированпой водой, а затем 10 — 15%-ным водным раствором аммиака происходит элюция лизина с поверхности смолы в чистом виде, практически без катионов Ха+. При этом концентрация лизина в собираемой фракции составляет 20,0 — 40,0%. Аммиак из фракции удаляют любым способом, например прогревом.

После этого лизин переводят в монохлоргндрат путем добавления расчетных количеств хлористого аммония при нагревании (для удаления выделяющегося аммиака) или определенных количеств концентрированной HCI до значения рН раствора 4,2 — 4,4.

il74940

Предмет изобретения

Составитель М. И. Андреева

Редактор В. Чулкова Техред Т. П. Курилко

Корректор Л, М. Комарова

Заказ 2874/17 Тираж 480 формат бум. 60+90 /з Объем 0,27 пзд. л. Цена 5 коп.

ЦНИИГ!И осударственного комитета по делам изобретений и открытий СССР

Москва, Центр, пр. Серова, д. 4

Типография, пр. Сапунова, 2

Монохлоргидрат лизина выделяют из полученного раствора после добавления в раствор этилового спирта или после упаривапия раствора любым методом до концентрации 60—

80% монохлоргидрата лизина и последующего охлаждения до 5 — 20 C.

В последнем случае после отделения осадка, представляющего собой монохлоргидрат

l-лизина, маточный раствор добавляют к исходной культуральной жидкости, подлежащей очистке на смоле. Полученный монохлоргидрат 1-лизина после сушки при 80 — 120 С представляет собой порошок с содержанием 92—

94% монохлоргидрата 1-лизина при максимальном содержании золы, равном. 1%. Выход

l-лизина, выделенного этим методом, составляет 85%.

1. Способ производства l-лизина путем глубинного выращивания его продуцентов на питательной среде, содержащей сахар, азотные соли и стимуляторы роста, выделения лизина из культуральной жидкости на катионообменной смоле, элюции лизина из катионита аммиаком, упаривания элюата для удаления аммиака, подкисления элюата для перевода лизина в монохлоргидрат и кристаллизации монохлоргидрата из раствора при добавлении спирта с последующей сушкой монохлоргидрата, отличающийся тем, что, с целью более качественной очистки l-лизина, его выделяюг

10 па катионообменной смоле в два этапа: первоначально на смоле в lU2+ форме, а затем в

Н+ форме.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что,: целью увеличения выхода l-лизина, маточный

15 раствор после отделения осадка (монохлоргидрата) l-лизина добавляют к исходной культуральной жидкости, подлежащей очистке.

3. Способ по п, 1, отличающийся тем, что в качестве продуцентов 1-лизина используют

20 двойной биохимический мутант М-glutamicus, полученный из исходного штамма одним из известных приемов, например ультрафиолетовым или рентгеновским облучением, с последующим отбором.