Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к i @ е человека

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к i @ е человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: биотехнология, иммунология Штамм получают путем слияний лимфоцитов мышей SIL, иммунизированных IgE человека, с культивируемым клетками мышиной миеломы 653 А. Штамм обозначен Е/4Ф4 и депонирован под номером ВСКК(П) 402. Штамм культивируют на питательной среде, содержащей сыворотку крупного рогатого скота. Титр моноклональных антител в культуральной жидкости достигается 1:20000. Моноклональные антитела используются для иммунохимического определения концентрации общего IgE и фракции аллергенспецифических антител lgE-класса в сыворотке крови человека , а также для контроля загрязненности окружающей среды аллергенами. 2 ил , 10 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4834328/13 (22) 10,04.90 (46) 07.08.92., Бюл. Мг 29 (71) Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт (72) В, Б. Климович, М.П, Самойлович, В.Б.Гервазиева, И.Ю.Крутецкая, И,Г.Овсянникова, С,Ф,Пашкова и Т.Б.Полищук: (56) Биотехнология, 1988. т, 4,, N- 3, с. 357. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК жИВОтНЫХ М0$

MUSCULUS L,-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К IgE ЧЕЛОВЕКА (57) Использование; биотехнология, иммунология. Штамм получают путем слияния

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для производства моноклональных антител (МКАТ) против эпсилон-цепи иммуноглобулина Е (IgE), которые используются в иммунохимической диагностике аллергических заболеваний человека.

Содержание lgE в крови человека в 1050 тыс. раз меньше уровня иммуноглобулинов других классов (Ig A, i g G, Ig M).

Селсктивность и чувствительность современных методов выявления аллергенспецифических Ig Е-антител (аллергосорбентный тест) или определения общего содержания

lg E (двухдетерминатный иммунометрический тест) обеспечиваются реализацией принципа твердофазного иммуноанализа, согласно которому lgE, содержащийся в исследуемом образце, связывается иммобилизованным на твердой фазе аллергеном или МКАТ, направленными к одной из антигенных детерминат эпсилон-цепи, после че Ы „1752763 А1

2 лимфоцитов мышей SIL, иммунизированных дЕ человека, с культивируемым клетками мышиной миеломы 653 А. Штамм обозначен Е/4Ф4 и депонирован под номером

ВСКК(П) 402. Штамм культивируют на питательной среде. содержащей сыворотку крупного рогатого скота. Титр моноклональных антител в культуральной жидкости достигается 1:20000, Моноклональные антитела используются для иммунохимического определения концентрации общего

IgE и фракции аллергенспецифических антител lg E-класса в сыворотке крови человека, а также для контроля загрязненности окружающей среды аллергенами. 2 ил„10 табл.

ro сформированный на твердой фазе иммунный комплекс выявляется с помощью вторых

МКАТ, несущих ферментную, изотопную или флуоресцентную метку.

В связи с этим МКАТ, предназначенные для использования в аллергодиагностических методах твердофазного иммуноанализа, подвергаются отбору по критерию сохранения функциональной активности при иммобилизации на твердой фазе и при ковалентном связывании с маркерными молекулами. Кроме того, при атом отбирают

МКАТ, специфичные к антигенным участкам эпсилон-цепи, которые, во-первых, не маскируются при формировании комплекса аллерген-lgE, а во-вторых, пространственно удалены друг от друга, что исключает конкуренцию между ними за связывание 19Е при постановке двухдетерминантного иммунометрического теста. Перспективными для практического применения считаются

1752763

МКАТ, обладающие одним или несколькими иэ перечисленных свойств, Известны гибридомные штаммы, вырабатывающие МКАТ против IgE человека (табл, 1).

В числе аналогов описано семейство гибридомных клонов, при получении которых реализованы упомянутые выше принципы отбора продуцентов. Гибридомы получены на основе миеломной линии

Р3Х63. Ag8.653 и лимфоцитов мышей линии

BALH/Ñ, иммуиэированных миеломным Ig E человека. Пять штаммов этого семейства . продуцируют МКАТ, относящиеся к IgQ1, продукты двух других штаммов относятся к

IgG2a. Среди описываемх штаммов большинство продуцирует МКАТ, которые взаимодействуют как с сомогенным (миеломным), так и с поликлональным IgE человека, т,е. специфичны к константным эпитопам молекул IgE. Продукты двух штаммов сохраняют антигенсвязывающую активность при иммобилизации на твердой фазе. МКАТ, способных выявлять аллерген специфические

IgE-антитела или служить основой меченого реагента для двухдетерминантного определения концентрации lgE, среди продуктов данного семейства гибридом не описано.Недостаток известных гибридов состоит в том, что для их получения в качестве родительских клеток использованы миеломные клеточные линии с низкой автономностью роста, требующие для размножения ростовых факторов эмбриональной сыво-. ротки, Высокая зависимость от ростовых факторов ограничивает возможности эксплуатации таких гибридом в качестве производственных штаммов, особенно при использовании метода массового культивирования в ферментерах, а также может служить причиной их недостаточной стабильности.

Цель изобретения — получение гибридомного штамма, который не требует для размножения ростовых факторов эмбриональной сыворотки, синтезирует МКАТ, пригодные для выявления общего IgF u фракции аллергенспецифических Ig E в сыворотке крови человека.

Поставленная цель достигается использование при получении гибридом клеток миеломного штамма 653.А (BCKK/П/й7Д), размножение которого не требует ростовых факторов эмбриональной сыворотки, а также отбором среди полученных гибридом штамма Е/4Ф4, синтзирующего МКАТ, которые сохраняют антигенсвязывающую активность при иммобилизации на твердой фазе и при присоединении ферментной метки и направлены к антигенной детерми5

15

Кроме того, предлагаемый штамм отли20 чается от известного генотипом животных25 вание РИ-8-Е/4Ф4.

Получение гибридомного штамма.

Донорами иммунных лимфоцитов служили мыши-самцы линии SJL/J, которых

1:20000, Партнерами для гибридизации служили клетки миеломного штамма 653.А, 40 выращенные на питательной среде, содер45

55 нанте. экспрессированной как на свободном lg E, так и на IgE, связанном в иммунном комплексе с аллергеном.

Описываемый штамм Е/4Ф4 подобно известному синтезирует МКАТ, специфичные к константной области эпсилон-цепи

IgE человека и способные при адсорбции на твердой фазе извлекать IgE из раствора.

Штамм Е/4Ф4 получен на основе миеломной клеточной линии 653. А и не требует для размйожения ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Синтеэируемые штаммом Е/4Ф4 МКАТ в составе конъюгата с ферментом позволяют выявлять аллергенспецифические lgE-антитела, а также определять общее содержание !цЕ с помощью двухдетерминантного иммунометрического теста. доноров иммунных лимфоцитов (мыши линии SJL/J}, Штамм депонирован в ВСКК(П) под номером 402Д. Штамму присвоено наименоиммунизировали дважды с интервалом 1 нед. подкожно препаратом миеломного

Ig Е/L(40 мкг) в полном адъюванте Фрейнда, на 11-й и 12-й дни после этого давали бустер-иммунизации внутрибрюшинно по 10 кг

lg E в физиологическом растворе. Спленоциты для слияния получали через 24 ч после последней бустер-иммунизации от мышей, у которых титр анти-IgE-антител превышал жащей модифицированную Дюльбекко среду Игла (90 j) и сыворотку крупного рогатого скота(10 ). Для слияния использовали 100 млн клеток селезенки и 50 млн клеток миеломы, Смесь клеток обрабатывали раствором полиэтиленгликоля (50 ) с мол. м. 1000, Для выращивания гибридов использовали питающий слой из перитонеальных макрофагов мышей и питательную среду указанного состава, содержащую, мкг на 100 мл: аминоптерин 10; гипоксантин

500; тимидин 500, Отбор и тестирование культуральных надосадков проводили трижды с 11-го по

28-й дни после слияния. Выявление МКАТ, специфичных к константной области эпсилон-цепи, вели с помощью твердофаэного иммуноферментного анализа аналогично известному способу используя s качестве антигенов миеломные IgE, препараты IgG.

1752763

20

30

40

lg M, а также легкие цепи иммуноглобулинов человека каппа- и лямбда-типов (табл. 2).

Из 480 первичных культур 12 синтезировали антитела, связывающиеся с IgE/Iиммуногеном. Среди них одна культура, продуцировала антитела, направленные к легкой цепи каппа-типа, Продукты синтеза пяти культур связывались с 1цЕ/1=иммуногеном, но не реагировали с миеломным

1оЕ/Ю. Наконец, шесть культур синтезировали антитела, взаимодействующие как с оF/L, так и с !оE/Þ, Эти шесть культур, обозначенные как семейство гибридомРИ8. были подвергнуты дальнейшему изучению.

Гибридомы клонировали 2-4 раза методом лимитирующих разведений на питающем слое из перитонеальных макрофагов мышей, Клоны, которые при двух последовательных клонированиях с плотностью посева 1 клетка на 1 или 2 ячейки давали более

95% субклонов, синтезирующих анти-IgEантитела, переводили в массовую культуру.

Выращенные в культуре клетки прививали внутрибрюшинно гистосовместимым мышам (по 5 млн клеток на мышь), которым за

7-18 дней до этого также внутрибрюшинно был введен пристан (по 0,5 мл), От мышей с растущими опухолями на

14-21-й дни получали асцитические жидкости, МКАТ из асцитов адсорбировали на твердой фазе и исследовали их способность связывать IgE из раствора. Заменяя растворы IgE на образцы сыворотки крови здоровых людей и больных аллергией, выявляли МКАТ, которые связывают поликлональный сывороточный lgE, т.е, специфичны к константным эпитопам эпсилон-цепи. Таким образом было отобрано пять клонов, продуцирующих МКАТ, удовлетворяющих критериям селекции.

МКАТ, прошедшие предыдущие ступени отбора, исследовали на способность сохранять. иммунологическую активность при присоединении ферментной метки. Для этого MKAT из асцитических жидкостей выделяли осаждением сульфатом аммония и методом периодатного окисления к ним присоединяли фермент — пероксидазу хрена, Иммунологическую активность полученныхх коньюгатов исследовали в твердофазном иммуноанализе, адсорбируя на твердой фазе миеломный IgE. Продукты всех пяти клонов после присоединения ферментной метки сохраняли антиген-связывающую активность.

Способность МКАТ, меченных ферментом, выявлять аллергенспецифическую фракцию IgE, оценивали с помощью аллергосорбентного теста, В качестве антигена использовали экстракт пыльцы березы, lg Eантитела выявляли в.стандартных сыворотках А, В, С и О, прилагаемых к набору

ФАДЕЗИМ (Швеция). МКАТ клона 4Ф4,. коньюгированные с пероксидазой, выявляли фракцию lgE, специфичного к аллергену.

MKATдругих клонов распознавали зпитопы, которые не экспрессируются на молекулах

IgE, входящих в комплекс с аллергеном, и в силу этого неэффективны в аллергосорбентном тесте.

Подбор антител для двухдетерминантного иммунометрического теста определения IgE проводили, испытывая поочередно сорбированныена твердую фазу MKAT в качестве подложки и меченные ферментом

MKAT в качесте выявляющих реагентов (табл. 3). Найдено несколько сочетаний иммобилиэованных и меченных МКАТ, позволяющих определять IgE в сыворотке крови.

Оптимальный результат получен при захвате Ig E адсорбированными на твердой фазе

MKAT клона Е/5Д4 и выявлении фиксированного в комплексе IgE с помощью меченных пероксидазой МКАТ клона Е/4Ф4.

Удовлетворительный результат был получен также при использовании MKAT Е/4Ф4 в качестве иммобилизованного на твердой фазе lg E-связывающего реагента.

Таким образом, в результате ступенчатого отбора был получен штамм Е/4Ф4, который обладает необходимой совокупностью свойств, т,е. способностью расти на среде, не содержащей эмбриональной сыворотки, и продуцировать МКАТ, пригодные для определения содержания IgE в двухдетерминантном иммуноанализе в качестве меченого или иммобилизованного на твердой фазе lg E-связующего реагента. а также для выделения IgE-антител в аллергосорбентном тесте.

Характеристика штамма.

Штамм Е/4Ф4 принадлежит к семейству гибридом РИ вЂ” 8.

С момента получения из родительских клеток штамм прошел 23 пассажа в культуре, включая 3 цикла клонирования методом лимитирующих разведений на питающем " слое из макрофагов мышей.

Стандартными условиями культивирования являются следующие: питательная среда состоит из среды Игла в оригинальной прописи или в модификации Дюльбекко (90о ) и сыворотки крупного рогатого скота (10%), Клетки выращивают при 37 С в герметично закрытых флаконах или в открытой системе — в планшетах, чашках Петри или флаконах в атмосфере с 7,5% углекислоты в воздухе при 100 влажности, 7

1752 7á3

30

40

50

Оптимальная посевная доза составляет

200 тыс, клеток в 1 мл среды. Для поддер>кания клеток в пролиферирующем состоянии их рассевают 2 раза в неделю с коэффициентом 1;4 — 1;5 при использовании стандартного состава ростовой среды. Клетки сохраняют способность к пролиферации при снижении содержания сыворотки до

2,5%, при этом кратность рассева составляет

1:2. Максимальная плотность культуры с сохранением жизнеспособности 1,2-1,4 млн клеток в 1 мл.

Культура описываемого штамма представляет взвесь одиночных округлых прозрачных клеток, встречаются агрегаты из четырех или более клеток, которые легко суспендируются пипетированием, Культура штамма Е/4Ф4, постоянно выращиваемая без антибиотиков, не содержит бактерий, грибов, дрожжей и микоплазмы, Клетки штамма перевивают в виде асцитических или солидных опухолей (в зависимости от способа прививки) на гистосовместимых мышах-гибридах F1 (SJL/JxBALB/ñ).

При внутрибрюшинной прививке 5 млн клеток животным в возрасте I,5 — 3 мес, предобработанным за 7 — 18 дней до этого внутрибрюшинным введением пристана, асцит развивается в течение 14 — 21 дня. От одной мыши получают при первой пункции

4 — 10 мл, суммарно в результате повторных пункций от одного животного получают 720 мл асцита.

Маркерные признаки штамма: штамм синтезируют МКАТ против !дЕ человека, антитела выявляются в культуральной жидкости при поддержании клеток

in vitro и в сыворотке или в асцитической жидкости при прививке животным; штамм обладает онкогенностью, которая выражается в росте солидных или асцитических опухолей у гистосовместимых мышей-гибридов Г1(5.1L/JxBALB/ñ) при прививке им клеток гибридомы.

Характеристика МКАТ, продуцируемых штаммов гибридомы Е/4Ф4, Клетки гибридомы продуцируют МКАТ субкласса IgG2a. Антитела специфичны к константной области эпсилон. цепи IgE человека. Специфичность МКЛТ может быть проверена в твердофазном иммуноферментном анализе с помощью IgE, адсорбированного-на твердой фазе. MKAT связываются с белком ф стафилококка, что может быть использовано при их очистке. При адсорбции на твердой фазе МКАТ способны связывать сывороточный !цЕ и могут использоваться в качестве захватывающих антител в сист"еме двухдетерминантного иммуноанализа (в паре с мечеными Ig Е специфичными антителами) или при эфинном извлечении IgE из сывороточных препаратов. МКАТ Е/4Ф4, сохраняя антигенраспознающие свойства после присоединения ферментной метки, могут также служить выявлющим реагентом в двухдетерминантном иммуноанэлизе для определения концентрации IgE, а также для выявления фракции аллергенспецифического IgE с помощью аллергосорбентного теста.

Продуцируемый штаммом иммуноглобулин выявляется в культуральной среде при культивировании клеток. Обратный титр МКАТ в переросших культурах при выращивании клеток в стандартных условия составляет 3000-2400. Такой же титр может быть получен при снижении содержания сыворотки в ростовой среде с 10 до 1,2%, При росте гибридомных клеток в мышах обратный титр МКАТ в асцитической жидкости составляет 0,1 — 6 млн, Среднее содержание иммуноглобулина в асците составляет 10 мг/мл.

Стабильность продукции МКАТ оцени- вали при пассировэнии клеток на мышах в течение 8 пассажей. 3а этот период клетки сохраняли исходную продуктивность. В культуре сохранение уровня МКАТ прослежено в течение 18 пасса>кей, Условия криоконсервации.

Криосреда состоит из 45% среды Игла, 45% сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида. Ампулы, содержащие 1 — 10 млн клеток в криосреде, помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,5 см и выдерживают в нем при -70 С в течение суток, затем хранят при той же температуре или переносят в жидкий азот. Для размораживания клеток ампулы извлекают из низкотемпературного хранилища и на 3 мин погружают в воду с температурой 40 С. Затем центрифугируют

3 мин при 1000 об/мин, убирают надосадок, а клетки суспендируют в ростовой среде и рассевают в платы при концентрации 500 тыс. клеток в 1 мл. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 7080% по данным пробы с 0,5% ным трипановым синим. Через 1 сут клетки повторно рассевают с концентрацией 200 тыс, клеток в 1 мл ростовой среды, В табл. 1 приведены гибридомные штаммы-продуценты МКАТпротив IgЕ человека, в табл, 2 — результат тестирования специфичности антител, продуцируемых первичными культурами гибридом, в табл.

3 — выявление IgE с помощью двухдетерминантного твердофазного иммуноферментного анализа, в табл, 4 — титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма 8Е/4Ф4

1752763

10

20

30

40

50 при выращивании в среде с низким содержанием сыворотки, в табл. 5- титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма Е/4Ф4, в культуральной среде и в асцитической жидкости, в табл. 6 — содерджание Ig E в образцах сыворотки крови человека, определенное в двухдетерминантном иммунометрическом тесте с помощью меченых MKAT Е/4Ф4, в табл. 7 — содержание IgE в образцах сыворотки крови человека, определенное в двухдетерминантном иммунометрическом тесте с помощью MI:AT Е/4Ф4, иммобилизованных на твердой фазе, в табл. 8 — выявление

IgE-антител против амброзии в аллергосорбентном тесте с помощью меченых MKAT

Е/4Ф4. в табл. 9 — результаты выявления

Ig E с помощью двухдетерминантного иммунометрического теста, в табл. 10- выявления аллергенспецифического IgE с помощью аллерго-сорбентного теста.

На фиг. 1 дана калибровочная кривая для определения содержания Ig Е в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммунометрическом тесте с помощью меченых МКАТ Е/4Ф4; на фиг. 2 — калибровочная кривая для определения содержания IgE в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммунометрическом тесте с помощью МКАТ Е/4Ф4, иммобилизованных на твердой фазе.

Пример 1. Выращивание культуры гибридомы для последующей прививки мышам, Посевным материалом служат гибридомные клетки, хранящиеся в жидком азоте, Для размораживания пробирку, содержащую 5 млн клеток, извлекают из сосуда с жидким азотом, погружают на 3 мин в воду с температурой 40 С, после полного оттаивания пробирку центрифугируют 3 мин при

1000 об/мин, удаляют надосадок, клетки ресуспендируют в 10 мл ростовой среды (модифицированная Дюльбекко среда Игла

90%, сыворотка крупного рогатого скота

10%) и помещают в культуральный флакон (объем 25 мл). Флакон помещают в инкубатор с температурой 37 С, 100% влажности и 7,5% углекислоты в воздухе. Через 1 сут проводят визуальный контроль состояния клеток с помощью инвертированного микроскопа и к содержимому флакона прибавляют 15 мл ростовой среды. На 4-е сутки после размораживания клетки пересевают в разведении 1:5 и переносят во флакон объемом 250 мл, Через 2 сут берут пробу для подсчета клеток — в 1 мл суспензии содержится 800 тыс. гибридомных клеток. Суммарное содержание клеток в культуре

120 мин, что составляет 24 прививочные дозы, Клетки осаждают центрифугировани. ем (1000 об/мин, 20 мин), суспендируют в среде Хенкса и вводят по 5 млн в объеме 2 мл внутрибрюшинно мышам — межлинейным гибридам Г1(Ы1 /JxBAI B/ñ), получившим за 11 дней до прививки внутрибрюшинную инъекцию пристана.

Пример 2. Получение гибридомных асцитических жидкостей и выделение иэ них глобулиновой фракции, содержащей МКАТ, Накопление асцита в брюшной полости мышей начинается на 11-й день после прививки клеток, На 14-й день проводится первая пункция. При этом от каждых 10 мышей получают 45 — 50 мл асцита. На 17-й день повторно пунктируют оставшихся в живых мышей и получают от них еще 40 — 45 мл асцита. К 20-му дню остается в живых 50% привитых мышей, В результате третьей пункции от них получают 10 — 15 мл асцита, Общее количество асцита, получаемое от IO мышей, составляет.105 — 110 мл, После образования фибринового сгустка и отделения его и клеточной массы с помощью центрифугирования иэ 110 мл асцита получают 100 мл надосадочной жидкости, иэ которой выделяют глобулиновую фракцию. Для этого к жидкости приливают по каплям в условиях непрерывного перемешивания равный объем насыщенного раствора сульфата аммония с рН 7.0. Осадок отделяют центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин), надосадок отбрасывают, а осадок растворяют в дистиллированной воде, доводя объем раствора до исходного. Процедуру высаливания повторяют, полученный осадок суспендируют в половинном объеме полунасыщенного сульфата аммония и в таком виде хранят при 4 С.

Пример 3, Получение содержащих

МКАТ культуральных жидкостей при выращивании клеток гибридом на среде с низким содержанием сыворотки.

Источники клеток служит гибридомный штамм, хранящийся в жидком азоте. Клетки раэмораживают и высевают, как описано в примере 1. Через 1 сут контролируют состояние клеток с помощью инвертированного микроскопа и определяют их содержание в культуре с помощью камеры Горяева. Суспензия содержит 400 тыс. клеток в 1 мл. При первом пересеве к 10 мл культуры добавляют 10 мл ростовой среды, содержащей

10% сыворотки, Через 1 сут культуру разделяют на две части: первую оставляют без пересевов до перероста для определения титра МКАТ, к второй прибавляют 10 мл бессывороточной среды, в результате концентрация сывор6тки снижается до 5%, Через 2 сут взвесь клеток, выросших на среде с 5% сыворотки, разделяют на три части, 1752763

10

11

Первую оставляют без рассева до перероста для определения титра МКАТ. Вторую .часть четырехкратно пересевают на среде с 57(, сыворотки (каждые 3 дня с коэффициентом 1:4) и затем оставляют до перероста для определения титра MKAT. Третью часть пересевают с одновременным снижением концентрации сыворотки до 2,5$. На 3-и сутки культуру разделяют на две части. первую оставляют до перероста, во второй содержание сыворотки снижают до 1,25/, и спустя 6 дней из нее берут пробу для определения титра МКАТ.

Данные определения титров МКАТ на всех стадиях процесса приведены в табл. 4.

Пример 4. Определение титра мышиных антител против tgE человека.

Источником мышиных антител против

tgE служат: сыворотка крови мышей, иммунизированных tg E человека; культуральная жидкость от растущих гибридомных клеток; асцитическая жидкость мышей с растущими гибридомными опухолями; глобулиновая фракция содержащих МКАТ асцитических жидкостей, Титр антител против igE человека определяют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, Реакцию проводят в четыре этапа, На всех этапах для промывания и разбавления реагентов используют раствор, содержащий 0,857, хлористого натрия, 0,01 M фосфатного буфера с рН 7,4 и

0,05% твина-20.

На первом этапе на твердую фазу адсорбируют антиген. Для этого в ячейки планшетов для иммуноанализа вносят по

100 мкл раствора, содержащего 10 мкг

IgE/L в 1 мл карбонат-бикарбонатного буфера (0,01 М, рН 9,5). Инкубируют не менее

10 ч при 4 С. Удаляют антиген из ячеек и однократно промывают. На втором этапе в лунках планшетов готовят серийные разведения исследуемых образцов объемом по

100 мкл, инкубируют 1 ч при 37 С, лунки освобождают от проб и трижды промывают.

На третьем этапе к связанным на твердой фазе мышиным антителам присоединяют меченые пероксидазой кроличьи антитела против иммуноглобулинов мышей, В лунки вносят по 100 мкл рабочего разведения конъюгата, инкубируют 45 мин при

37 С, удаляют конъюгат и 5-кратно промывают, На последнем этапе с помощью цветной реакции выявляют активность пероксидаэы, связавшейся с твердой фазой, В лунки вносят по 100 мкл субстратной смеси (1 мг ортофенилендиамина и 2 мкл 337ь-ной перекиси водорода в 10 мл 0,05 М цитратного буфера с рН 4,7), инкубируют 30 мин при комнатной температуре в темноте и затем реакцию останавливают добавлением 50 мкл 2н серной кислоты, Оптическую плотность проб регистрируют на фотометре

"Мультискан-МС" при длине волны 492 нм.

Результаты представлены в табл. 5.

Пример 5, Использование MKAT

Е/4Ф4 в качестве меченого реагента для количественного определения содержания

tgE в сыворотке крови человека, Концентрацию IgE в сыворотке крови определяют с помощью двухдетерминантного твердофазного иммуноанализа, Для захвата IgE из раствора служат иммобили15 зованные на твердой фазе IgE-специфичные поликлональные антитела, производимые НПО "Аллерген", (r. Ставрополь) или моноклональные антитела, синтезируемые гибридомным клоном РИ-8Е/5Д4. MKAT

20 BE/4Ô4, меченые пероксидаэой, используloT для выявления !9Е, включенного в иммунный комплекс. Реакцию проводят в полистироловых планшетах фирмы NUNC, Для разбавления реагентов и отмывания

25 планшетов от несвязавшихся компонентов используют раствор того же состава, что в примере 4.

На первом этапе в лунки планшета вносят раствор MKAT 8Е/5Д4 или поликлональ30 ных антител, содержащий 5 мкг белка в 1 мл

0,01 М карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,5, Инкубируют в течение ночи при 40С, затем раствор удаляют и лунки однократного промывают.

35 На втором этапе в лунки вносят образцы исследуемых сывороток и растворы с известным содержанием Ig E, предназначенные для построения калибровочной кривой (калибраторы фирмы Pharmacia). Инкубируют

40 при 37 С 1 ч, образцы удаляют и лунки трехкратно промывают.

На третьем этапе в лунки вносят рабочее разведение конъюгата, MKAT Е/4Ф4 с пероксидазой, инкубируют 1 ч при 370С, 45 раствор удаляют, планшет промывают пятикратно, На четвертом этапе в лунки вносят субстратную смесь для выявления активности пероксидазы. Состав смеси приведен в примере 4.

Инкубируют 30 мин в темноте при комнатной температуре, реакцию останавливают серной кислотой и измеряют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по примеру 4)..

На основании полученных данных строят калибровочную кривую. По оси абсцисс откладывают концентрацию IgE в МЕ/мл, по оси ординат — оптическую плотность проб (фиг. 1). Пользуясь калибровочной кри13

1752763

14 сидазой Ig E-специфичные поликлональные антитела, выпускаемые НПО "Аллерген" или моноклональные антитела, синтезируемые гибридомным клоном РИ-8Е/5Д4. Реакцию проводят в полистироловыx планшетах фирмы NUNC, Для разбавления реагентов и отмывания планшетов от несвязавшихся компонентов используют раствор того же состава, что в примере 4.

На первом этапе в лунки планшета вносят раствор MKAT 8Е/4Ф4. содержащий 5 мкг белка в 1 мл 0;01 M карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,5, Инкубируют в течение ночи при 4 С. затем раствор удаляют и лунки однократно промывают.

На втором этапе готовят разведение исследуемых сывороток(1:10 или 1:100 в данном примере) и растворы с известным содержанием Ig Е, предназначенные для построения калибровочной кривой (использовали калибратор фирмы Pharmacia)

Вносят образцы (в дублях) в лунки планшетов и инкубируют при 37 С 1 ч, затем лунки освобождают от раствора и промывают трехкратно, На третьем этапе готовят рабочее разведение конъюгата MKAT 8Е/5Д4 с пероксидазой (1:10000) и вносят в лунки планшета.

Инкубируют 1 ч при 37 С, раствор удаляют, планшет промывают пять раз, На четвертом этапе в лунки вносят.субстратную смесь для выявления активности пероксидазы, Состав смеси приведен в примере 4. Инкубируют 30 мин в темноте при комнатной температуре, останавливают реакцию добавлением серной кислоты и измеряют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по примеру 4).

На основании полученных данных строят калибровочную кривую: по оси абсцисс (логарифмическая шкала) откладывают концентрацию IgE в МЕ/мл, а по оси ординат — оптическую плотность соответствующих проб (фиг. 2). Пользуясь калибровочной кривой и учитывая коэффициент разведения

50 вой и учитывая коэффициент разведения исследуемых сывороток, определяют содержание в них IgE (табл. 6).

Пример 6. Использование иммобилизованных на твердой фазе MKAT Е/4Ф4 для количественного определения содержания

IgE в сыворотке крови человека.

Концентрацию IgE в сыворотке крови определяют с помощью двухдетерминантного иммунометрического анализа. MKAT 10

8Е/4Ф4, иммобилизованные на твердойфаэе, служат для захвата антигена из образца.

Для выявления !9Е, включенного в иммунный комплекс, используют меченные перокисследуемых сывороток, определяют содержание в них Ig Е (табл. 7).

Пример 7. Выявление с помощью

МКАТ Е/4Ф4 фракции аллергенспецифичного IgE в сыворотке крови человека.

Аллергенспецифичные антитела определяют с помощью аллергосорбентного теста, при котором вначале содержащиеся в сыворотке антитела вступают в соединение с иммобилизованным на твердой фазе аллергеном, а затем включенные в иммунный комплекс анитела класса IgE выявляются с помощью меченых пероксидаэой МКАТ

E/4Ô4::

Раствор аллергена амброзии (НПО "Аллерген") — 40 мкг в 1 мл 0,01 M карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,5 вносят в,лунки полистироловых планшетов фирмы NUNC u инкубируют 18 ч при 4 С. Удаляют аллерген, а лунки промывают раствором того же состава, что приведен в примере 4, Готовят разведения стандартных сывороток (выпускаемых НПО "Аллерген" ). Стандартную позитивную сыворотку используют цельной, а также в разведениях: 1:5, 1:25 и

1:50. Негативную сыворотку используют в цельном виде. Исследуемые сыворотки и образцы контрольйых сывороток в обозначенных разведениях вносят по 200 мкл в лунки планшета, B которые предварительно было внесено по 200 мкл разводящего раствора (например 4). Инкубируют 1 ч при 37ОС, затем жидкость удаляют и лунки промывают 4 раза.

Рабочее разведение конъюгата пероксидаэы и MKAT вносят в объеме 200 мкл в лунки, инкубируют 1 ч при 37 С, отмывают

5-кратно, после чего в лунки вносят по 200 мкл субстратной смеси (состав приведен в примере 4), инкубируют при комнатной температуре в темноте 30 мин. Остановку реакции и регистрацию оптической плотности проводят, как в примере 4. О содержании IgE, специфичного к аллергену. судят по оптической плотности исследуемых образцов в сравнении с оптической плотностью стандартных сывороток, На основе результатов, представленных в табл. 8, содержание специфического lg E в исследованных сыворотках оценено следующим образом: очень высокое (4-й класс) — в сыворотках 2 и 4; среднее (2-й класс) — в сыворотке 1; низкое (1-й класс) — в сыворотках 3 и 6; антитела не определяются в сыворотке 5.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) ¹

402 0 — продуцент моноклональных антител к IgE человека.

1752763

Та 6 пи в

Характеристика щтаммов ИНАТ

Область применения

Библиография

Обозначение

Партнеры в слиянии

Миелома

Лимфоциты

Ва1Ь/с

Полуколичествениый односту- 2 пенчатый двухсайтовый имму» ноферментный тест выявления общего lgg

Й4. 4Е8

94. 2С10

HE2/1

НЕЗ/2

НЕ4/3

Твердофазный вллергосорбентный радноиммуноаналиэ для выявления аллергенспецифического lgR

061Ь/с

РЗх63

Ag8 653

Н1-BL1gE/I-1О

А/J

РЗх63

Ag8.653

Р3х653

Известный

Количественное Определение общего lgE в радио -или иммуноферментном анализе

Ba1b/с

1gE/11-1

Определение общего lgE с помощью psyxcagtosoro иммуноферментного анализа

Т в б л и ц а 2

Тест-антигены

Обозначения гибридом

IС! IЕIО 504 509 4FI 4F2 4Р4 4F12 4С9 IС4 5CÇ SCI

Ниеломный lgE/L

Ниеломный 1gg/10.

IgG

Каппа-цепи

Ллмбда-цепи

П р и м е ч а н и е. н+" - антитела селзываются с антигеном; "-" - отсутствие реакции между антителами и антигеном. При тестировании использованы препараты 1gG и lgH мэ донорской сыворотки. Легкие цепи каппа- и ллмбда-типов выделены из мочи пациентов с множественной миеломой, Таблице

Оптическал плотность при выявлении lgE

" (:".: .....l. .....i

0,105 0,114 0,019 0,139

0,260 0,271 0,116 0,145

0,634 0,520 0,123 0,459

HEAT на твердой фазе комъюгатами

4Ф4

504

1Е10

4Ô!

4Ф12

4Ф4

П р и и е ч а н и е, Определение 1ЕЕ проводят в пуле иэ 13 сывороток от аллергических больных.

Разведение образца 1:10. т а блица 4

Номер пассажа Обратный титр HKAT в среде данного состава

Содержание сыворотки в среде, 2

9 100 (3 200 - 25 600)

8 200 (3 200 - 12 800)

8 600 (3 200 - 25 600) 6 200 (3 200. - 12 800)

9 000 (3 200 - 25 600)

7 гоо (1 600 - 1г 8оо) П р и н е ч а н и е. Представлены средние и предельные (в скобках) значения обратных титров, полученные для 6-9 отдельных культур.

5

2,5

2,5

1,2

1

1

1,490

0,551

0,337 о,448

0,678

1752763

Таблица 5

Культура in vivo

Таб ли а

Обозначение Развед ние сыаоротки сыворотки

Оптическая плотность

Номер Обратный титр

naccatra ИКАТ

Номер Обратный пассажа титр ИКАТ

9 300

10 200 2

7 000 3

6 900 4

9 100 5

7 400 6

12 800 7

П р и м е ч а н и е. Представлены средние показатели обратных титров

ИКАТ, полученные при ана; лизе 4-6 образцов.

П р и н е ч а н и е. Определение содеряания 1ЕВ в

HE/ìë в сыворотках проведено с помощью калибровочной кривой, представленной на фигв2, Т а б л н ц а 6 чТ а б л и ц а 8. Номер образца g

Оптическая плот- Количество 1ЕЕ, ность (ИЕ/мл

Разведения образцов

Образцы сыворотки

Оценка реэультатое (no классам) Оптическая плотность

l,74 4 без разведения

1:5

1:25

f : 50

Стандартная позитивная

1,23

0,73

0,22 "

0,11

Цельная

Стандартная неГативная а

П р и и е ч а н и е. Определение содерыания

1gE в сыворотке проведено с Аомащью калибровочной кривой, приведенной на фиг.l. е

0,84 2

0,92 4

0>30 1

1,77 4

0,18 0

0,42 1 1

Цельная вв

II

It н

Табли а еа е ев ев ю ю ю ю е

Схематическое изображение

Сущность этапа анализа

Этап

ЯЯЯв

Rgg ю ю ев ю ю в ю вв ва ю»

Иммобилизация МКАТ-1 против

1gE на твердой фазе

Инкубация с исследуемыми образцами, содержащими 1gE„ формирование иммунного комплекса "МКАТ-1/1gE" на твердой фазе

Инкубация с МКАТ"11 против 1 gE, меченными ферментом., изотопом или флуорохромом а

Проявление реакции " выявление метки, фиксированной на фазе

° а «е еа вв евеввеавеа ев

° еее авеаааеевееееевЕввеееюввввюеевеевеюеееевее

П р и м е ч а н и е. После каждого из указанных этапов производится отмывание от компонентов, не связавшихся с твердой фазЮ.

2

4

6

2

4

6

0,955

0,775

1,190 0,681

1 „166

0,600

0,884

0,998

700 000

700 000

2 000 000

2000 000

1 000 000

6 000 000

300 000

1 000 000 е °

42

18 103

21

92

28

ДЛ, ЛЛ

J4c

Кор

НС

НГ

ОК

8%

ИС

ИГ

Донорские

2

4

1:100

1:10

1:100

1:100

l:100

1:10

1:10

1;10

1: 10

1:10

0 131

0,090

0,599

0,609

0i208

0,138

0,752

1,410

0,069

0,051

Количество Igg, ИЕ/мл

36

1 300

1752763

Табли ца 10

Этап

Сущность этапа анализа

Схематическое изображение

Иммобилизация аллергена на твердой фазе ! °

Инкубация с сывороткой, тестиру- . емои на присутствие 1gE"антител, формирование иммунных комплексов сь воротоцных антител с аллерге« ном

Инкубация с ИКАТ против 1gE, меценными ферментом или изотопом, формирование иммунного комплекса

Hl(AT и 1gE, связанного с аллергеном

Выявление.ферментной или изотопн ной метки, связанной на твердой фа зе

Ю ° l

П р и и е ц а н и е. После каждого из указанных этапов производится отмывание от компонентов, не связавшихся с твердой фазой.

Ю/ФУРлв

Ю /М

fu 2

Ж Ot

° (upr3

Составитель Г. Борискина

Редактор В. Петраш Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Л. Лукач

Заказ 2733 Тираж Подписное

ВЯИИПИ Государственного комитета Ilo изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101