Способ определения генотоксичности водорастворимых веществ

Способ определения генотоксичности водорастворимых веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: микробиологии, водная токсикология, биологический контроль за токсичными водорастворимыми веществами , контроль сточных и природных вод, оценка генотоксичности. Сущность изобретения; определение генотоксичности проводят . внесением исследуемых веществ в культуральную среду инфузорий Tetrahymena pyrlformis и экспозицией с меченным предшественником. После чего определяют удельную радиоактивность тотальных ДНК и РНК в клетках инфузорий, по изменению удельной радиоактивности нуклеиновых кислрт судят о генотоксичности исследуемых веществ. Дополнительно могут быть использованы водоросли Chlorella vulgaris. 2 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 601 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ% .

К-АВТ0РСИ0МУ СВИДЕтЕЛЬСтВ /

{21) 4782178/13 (22) 15.01.90 (46) 15.08.92. Бюл, 30 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт по охране вод и Харьковский государственный университет им, А.М.Горького (72) Е,В.Усенко, А.И.Божков и П.А.Калиман (56) Evalutton of à genotoxtcitt test measuring

ОНА-strand breaks in mouse lurnphoma сеИз

by atkaHne unwinding and hydroxyaparatIte

elution / Garberg Per, Akerblom Еча-Lena, Bolesfoldl George. // IVlutat. Res, Environ.

Mutatgenes апб Retat. Subj, 1988. 203, М 3, р. 155-176.

Авторское свидетельство СССР

М 1507275, кл. А,01 К 61/00, G 01 и 33/18, 1989.

Авторское свидетельство СССР

N. 1.257518, кл. 6 01 М 33/48, 1986.

Изобретение относится к микробиологии, водной токсикологии и предназначено к использованию для биологического контроля за токсичными водорастворимыми веществами, а также может быть использо. вано для контроля сточных и природных вод и при оценке генотоксичности водорастворимых веществ при исследовании генетических основ адаптации организмов к изменяющимся условия окружающей среды.

Известен способ оценки теста на генотоксичность, использующий определение разрывов нитей ДНК в клетках лимфомы мыши при щелочной денатурации с злюцией через оксиапатит.,, . Ж„, 1755194 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТОКСИЧНОСТИ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВЕЩЕСТВ (57) Использование; микробиологии, водная токсикология, биологический контроль за токсичными водорастворимыми веществами, контроль сточных и природных вод, оценка генотоксичности. Сущность изобретения; определение генотоксичности проводят . внесением исследуемых веществ в культуральную среду инфузорий

Tetrahymena pyriformis и экспозицией с меченным предшественником, После чего определяют удельную радиоактивность тотальных ДНК и РНК в клетках инфузорий. по изменению уделъйой радиоактивности нуклеиновых кислот судят о генотоксичности исследуемых веществ, Дополнительно могут быть использованы водоросли

Chtoretia vutgaris. 2 табл.

Этот известный способ затруднительно испольэоовать для контроля сточных и природных вод вследствие необходимости введения их во внутрь оргайизма и, кроме того, не каждый последующий токсикант приводит к разрывам ДНК, Известен способ биологической оценки токсичности водй, согласно которому производят экспозицию рачков-дафний в исследуемой воде и по числу погибших дафний и длительности экспозиции судят о степени токсичности исследуемой воды.

Недостатком этого способа является

его невысокая чувствительность, т.к. по гибели дафний возможно оценивать только

1755194

30

УТФ на 150 мл культуральной жидкости и 45

55 высокие дозы токсиканта, что ограничивает область использования.

Известен также способ определения токсичности водорастворимых веществ, согласно которому инфузории Tetrahymena

pyriformIs диспергируют в культуральной среде, регистрируют динамику изменения величин светопропускания культуры до и после экспозиции с исследуемым веществом и flo изменению двигательной активности при воздействии исследуемого вещества различйой концентрации оценивают его токсичность.

Недостатком этого способа является низкая чувствительность и недостаточность интерпретации полу енных результатов, т,к. двигательная активность инфузорий является интегральным показателем. Этим способом не обеспечивается оценка генотоксичности, что ограничивает область использования, Цель изобретения — повышение чувствительности и достоверности определения и расширения области использования.

Способ осуществляется следующим образом.

В суточную культуру инфузорий

Tetrahymena pyrIformls, растущую на пептонной среде (пептон 20 г, дрожжевой экстракт 1 мл, глюкоза 5 г. NaCI — 1 г, вода дистиллированная до 1 л, рН 7,1) при 27 С и содержащую 60 — 80 тыс, особей в 1 мл, или

5-суточную культуру Chlorella vulgarls, культивируемую на солевой среде Успенского (КМОз 0,025 г, MgSO< 0,025 r, Са(КОз)р 0,1 r, КН2Р04 0,025, К2СОз 0,0345, вода дистиллированная до 1 л, рН после стерилизации

7,0 — 7,3) в люминостате с освещбенностью

2000люкс и содержащую 5 10 клеток в

1 мл, вносят растворы испытуемых веществ в различных дозах (0,001; 0,01 и 1.0 мг/л).

Спустя 30 — 40 мин после внесения испытуемых веществ в культуру инфузорий вносят по 2,97 МБк Н -тимидина и 2,97 МБк Н производят инкубацию в течение 30 мин при 27 — 28 С. После окончания инкубации каждую пробу разделяют на 3 равные части, соответственно по 50 мл каждую, охлаждают и вносят хлорную кислоту до 5% конечной концентрации. Образцы охлаждают в течение 30 мин и сформировавшийся осадок собирают центрифугированием при

1000 g в течение 10 минут. Полученные осадки трижды промывают 5% хлорной кислотой, после чего из осадков извлекают тотальную PHK. Для этого к ним прибавляют

0,3 н гидрат окиси калия, суспендируют и производят инкубацию образцов при 37 С в течение 1,5 ч. После окончания инкубации

20 пробы охлаждают и вносят хлорную кислоту до 5% концентрации, через 15 мин их центрифугируют при 1000 g в течение 10 минут, затем собирают надосадочную жидкость, которая представляет нуклеотиды РНК, Полученные осадки промывают 2 мл 5%

HCI04, после чего осадки объединяют с первой надосадочной жидкостью и в общем объеме определяют содержание PHK lio известному методу Спирина.

По0,5 мл из каждого образца вносят во флаконы с диоксановым сцинтиллятором и определяют радиоактивность на сцинтилляционном счетчике, результаты выражают в импульсах в минуту на 1 мг РНК (удельная радиоактивность P HK).

Осадок, полученный после выделения

РНК, гидролизуют в 5 HCIO4 на водяной бане при 90-95 С в течение 20 мин с обратным холодильником. Надосадочную жидкость переносят в чистые пробирки и определяют содержание ДНК и удельную радиоакт ивность.

Полученные значения для трех параллельных проб усредняют и сравнивают удельные радиоактивности контрольных и опытных образцов. Уменьшение величин удельной радиоактивности свидетельствует об угнетении скорости синтеза нуклеиновых кислот, а в случае увеличения удельной радиоактивности — об увеличении скорости синтеза РНК или ДНК.

Достоверное увеличение или уменьшение удельной радиоактивности нуклеиновых кислот по сравнению с контролем указывает на проявление генотоксичности исследуемых веществ, Пример 1, В 3-х суточную культуру

Tetrahymerla,pyrIformIs, растущую нв пептонной среде при 27 С, вносили по 2,97

МБк Н -тимидина и 2,97 МБк Н -УТФ и выз з держивали в термостате при 28 С. Спустя

20, 40, 60, 80 и 100 мин извлекали пробы, охлаждали и в каждую из проб вносили хлорную кислоту до конечной концентрации

5 . Из полученных осадков щелочным или кислотным гидролизами извлекали PHK u

ДНК и определяли их удельную радиоактивность.

В 5-ти суточную культуру водорослей

Chlorella vulgaris вносили по 2,97 МБк Нтимидина и 2,97 МБк Н -УТФ и спустя 10, 20, 30 и 40 мин извлекали пробы, охлаждали и вносили в каждую из них хлорную кислоту до конечной концентрации 5 . Осадки собирали центрифугированием, из них извлекали РНК и ДНК и определяли их удельную радиоактивность, В табл. 1 приведены результаты определения удельной радиоактивности ДНК и

1755194

PHK в клетках водорослей и в клетках инфузорий при различности времени экспозиции и эти приведенные данные показывают, что при экспозиции до 30 минут удельная радиоактивность ДН К и PHK в клетках водо- 5 рослей увеличивается, а при дальнейшем увеличении времени экспозиции эта величина остается неизменной, а в клетках инфузорий эта величина увеличивается при экспозиции до 60 мин, 10

Данные опытов показывают, что доза изотопов 2,97 МБк является достаточной, чтобы получить высокую удельную радиоактивность нуклеиновых кислот в клетках водорослей и инфузорий соответственно. Как 15 видно из полученных результатов, оптимальным времени экспозиции является 3060 мин, Пример 2. В 3-х суточную культуру инфузорий Tetrahymena pyriformis, расту- 20 щую на пептонной среде при 27 С, вносили 0,5 мг/л меди и спустя 10, 20, 30 и 40 минут извлекали пробы культуры. В каждую из проб вносили 2,97 МБк Н -тимидина и

2,97 МБк Н -УТФ, Затем производили инку- 25

3 бацию каждых образцов в течение 60 минут при 28 С, после чего охлаждали и вносили о холодный раствор хлористой кислоты до 5; конечной концентрации. Через 30 мин осадок собирали центрифугированием при 30 l000g в течение 10 мин, после чего для каждого образца определяли удельную радио. активность ДНК и РНК в клетках инфузорий с разной продолжительностью экспозиции.

Результаты опытов приведены в табл, 2. 35

Данные опытов показывают, что при внесении 0,5 мг/л меди в среду с инфузориями и экспозиции их до 20 — 30 мин до инесения в культуральную среду меченных предшественников нуклеиновых кислот, на- 40 блюдается достоверное снижение удельной радиоактивности нуклеиновых кислот, Это снижение коррелируют с угнетением роста культуры через 24 и 48 ч после внесения токсиканта, При сравнении влияния 0,5 мг/л меди 45 на удельную радиоактивность нуклеиновых кислот и отдельно на подвижность инфузорий, определяемую способом по прототипу, обнаружено; что если подвижность изменяется на 26 /, то удельная радиоактив- 50 ность ДНК изменяется через несколько минут после внесения токсиканта на 500/ .

Таким образом, изменение удельной радиоактивности нуклеиновых кислот в клетках инфузорий или водорослей фиксируют вне- 55 сением радиоактивных предшественников в культуральную среду через 20-30 мин после внесения токсиканта, что в несколько раз быстрее по сравнению с учетом численности клеток.

Предлагаемый способ обеспечивает большую чувствительность по сравнению с оценкой токсичности, проводимой по изменению подвижности тест-объектов, кроме того, он позволяет оценить не только общую токсичность, но и генотоксичность, т,е. токсичность, затрагивающую генетическую систему клеток, Пример 3. Культуру водорослей

СЫоге1!а vulgaris, растущую на среде Успенского в люминостате с освещенностью 2000 люкс при температуре 20 С, разделяли на отдельные пробы, в каждую из которых вносили соответственно 0,005; 0,01; 0,1 или

0,5 мг/л ртути, Спустя 30 мин после внесения токсиканта в каждую из проб вносили по 2,97 МБк Н -тимидина и через 30 мин культуру охлаждали и клетки осаждали хлорной кислотой, после чего определяли удельную радиоактивность ДНК.

Результаты опытов, представленные на фиг. 1 и 2, показывают, что ионы ртути в концентрации 0,005 и 0,01 мг/л не оказали влияния на скорость синтеза ДНК, а доза в

0,1 мг/л подавляла скорость ДНК на 967;.

Увеличение дозы токсиканта в 5 раз полностью подавляло включение радиоактивной метки в ДНК (на 99%), Влияние этих доз ртути на численность клеток водорослей через 3, 6, 9 и 12 суток после начала эксперимента не оказывалось, что указывает на существование механизма адаптации.

Генотоксичность, определяемая через

30-60 мин после внесения токсиканта по скорости синтеза ДНК. позволяет оценить прямое влияние испытуемых веществ на функцию генетического аппарата без наложения адаптивньiõ способностей тест-обьектов.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять концентрации веществ, оказывающих влияние на генетический аппарат водорослей, Пример 4. Культуру водорослей

СЫогеИа vulgaris, растущую на среде Успенского в люминостате с освещенностью 2000 люкс при температуре 20 С, разделяли на отдельные пробы, в каждую из которых вносили соответственно 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 и

1,0 мг/л кадмия. Спустя 30 минут после внесения токсиканта в каждую из проб вносили по 2,97 Мбк Н -тимидина и через 30 мин з культуру охлаждали и клетки осаждали хлорной кислотой, после чего определяли удельную радиоактивность ДНК.

Таким образом, предлагаемый способ оценки генотоксичнОсти позволяет в короткое время дать ответ о влиянии испытуемых веществ на функцию генетического аппарата тест-объектов, 1755194

Таблица 1

° Продолжение табл.1

Таблица 2

Пример 5, 3-суточную культуру инфузорий Tetrahymena pyriformls, растущую на пептонной среде, разделяли на отдельные пробы, в каждую из которых вносили соответственно 0,1; 0,5 и 1,0 мг/л ионов меди. 5

Спустя 30 мин после внесения токсиканта вносили по 2,97 МБк Н -тимидина и НУТФ. После 60 минут инкубации культуру охлаждали и клетки осаждали хлорной кислатой, после чего определяли удельную ра- 10 диоактивность ДНК и РНК, Медь в концентрации 0,1 мг/л снижает удельную радиоактивность ДНК в клетках инфузорий на 34, а увеличение концентрации до 0,5 и 1,0 мг/л уменьшает этот 15 показатель на 65 и 5Я% соответственно, Удельная радиоактивность тотальной PHK при внесении 0,1 мг/л меди понизилась на

50 по сравнению с контролем. Увеличение концентрации меди в среде в 5 и 10 раз не 20 приводило к дальнейшему изменению удельной радиоактивности PHK клеток инфузорий. Инкубация клеток с ионами меди в концентрации 0,1 мг/л снижало численность инфузорий на 60 через 24 ч после ее 25 внесения в культуральную среду. Дальнейшее увеличение концентрации меди в среде не влияло на интенсивность размножения инфузорий.

Таким образом, медь обладает генотоксичностью и преДлагаемый способ оценки генотоксичности:позволяет в короткое время дать ответ о влиянии испытуемых веществ на функцию генетического аппарата инфузорий.

Формула изобретения

Способ определения генотоксичности водорастворимых веществ, включающий внесение исследуемых веществ в культуральную среду инфузорий Tetrahymena

pyriformis и экспозицию их с исследуемым веществом,отл ича ю щи йс я тем,что,c целью повышения чувствительности и достоверности определения и расширения области использования, после внесения исследуемого вещества в культуральную среду дополнительно через 20-30 мин производят инкубацию инфузорий в течение

30-60 мин с меченным предшественником, после чего определяют удельную радиоактивность тотальных ДНК и PHK в клетках инфузорий, а о генотоксичности исследуемых веществ судят йо оценке их влияния на удельную радиоактивность нуклеиновых кислот инфузорий, 2. Способ поп,1,отличающийся тем, что культуральная среда дополнительно содержит водоросли Chlorella vulgar! s