Способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов или их частей

Способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов или их частей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: органический растворитель с растворимостью в водеО.1-2,85 г/100 г, вязкостью при 20°С 0,455-7,0 сП, температурой кипения 77,6-205,2°С используют в качестве жидкой гелеобразующей среды, которая не оказывает вредных воздействий на клешни микроорганизмов или их части. К суспензии спор Streptomyces savendulae АТСС 12950 добавзяют водный раствор агара , полученную смесь вводят по каплям в холодный органический растворитель с помощью насоса в присутствии азотз с целью предупреждения слипания гелевых шариков друг с другом. Гелевые шарики формируют из полученной смеси со скоростью осаждения капель 0,05-10 см/с. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12 N 11/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОГКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4614585/13 (22) 26.07,89 (31) 3987/88 (32) 27.07.88 (33) Н0 (46) 07.09.92. Бюл. М 33 (71) Реанал Финомведьсердьяр (HU) (72) Зоотан Бенде, Андреа Эгреши, Илона

Харшаньи, Бела Саяни и Чаба Шишак (H0) (56) 1. Иммобилизованные ферменты /Под ред. И.В.Березина и др. М., МГУ, 1976,т. 1, с. 243-259.

2. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы /Под ред. Дж.Вудворда, 1988, М.: Мир, с. 157 — 160.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к усовершенствованному способу иммобилизации микроорганизмов или их частей, используемых в процессах ферментации, в составе геля.

Известны многочисленные способы иммобилизации клеток микроорганизмов Я.

Недостатки этих способов заключаются в сложности формирования частиц геля, а также невозможности разложения клеток в этих гелях.

Наиболее близким к предложенному способу является способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов, включающий суспендирование клеток в растворе полисахарида и получение частиц геля путем внесения суспензии в растительное масло. Недостатком способа Ж» 1760985 А3 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

ИЛИ ИХ ЧАСТЕЙ (57) Использование: биотехнология. Сущность изобретения: органический растворитель с растворимостью в воде 0,1 — 2,85 г/100 г, вязкостью при 20 С 0,455 — 7,0 сП, температурой кипения 77,6 — 205,2 С используют в качестве жидкой гелеобразующей среды, которая не оказывает вредных воздействий на клешни микроорганизмов или их части. К суспензии спор Streptomycea iavendvfae

АТСС 12950 добаввяют водный раствор агара, полученную смесь вводят по каплям в холодный органический растворитель с помощью насоса s присутствии азота с целью предупреждения слипания гелевых шариков друг с другом. Гелевые шарики форми. руют из полученной смеси со скоростью осаждения капель 0,05-10 см/с. 2 табл. является ингибирующее действие растительного масла на процессы размножения клеток и на их способность продуцировать различные соединения (2).

Целью изобретения является повышение продуцирующей способности клеток или их частей, а также увеличение роста клеток.

Способ заключается в суспендировании клеток микроорганизмов или их частей в водном растворе агара, введении суспензии в органический растворитель для образования частиц геля с включенными клетками или их частицами, отделении и промывке частиц геля. В качестве органического растворителя используют растворители со следующими параметрами: растворимостью в воде 0,1-4,0 г на 100 r воды, вязкостью

1760985

0,455-7,0 сП при 20 С и температурой кипения 77,6 — 205,2 "С. Введение суспензии в охлажденный до 0 — 10 С органический растворитель осуществляют по каплям при скорости оседания капель от 0,5 до 3,4 см/сек.

Способ позволяет значигельно увеличить продуктивность иммобилизованных клеток (продуцирование антибиотиков клетками продолжается в течение 13 дней с трехкратной сменой культуральной среды), а также повысить эффективность роста клеток.

Способ иллюстрируется следующими примерами осуществления.

Пример 1, Обоазуют суспензию спор, содержащую 5 х 10 спор/см, с помощью з стерильной дистиллированной воды из 7 — 8дневной культуры на скошенном агаре

Streptomyces lavendulae АТСС 12950, Добавляют l0 мл полученной суспензии спор з к 90 см водного раствора агара с концентз рацией 4 мас.%, стерилизованного ранее при 121 С втечение 30 минут и затем охлажо денного до 50 С. Полученную смесь вводят по каплям с помощью перистальтического насоса в 1000 см холодного (5"С) изооктанола (2-этилгексанол). В этих операциях используются стерилизованные инструменты, Азот пропускают через изооктановую среду медленным потоком с целью предупреждения слипания гелевых шариков друг с другом, Введение азота продолжа.от в течение 4-5 минут после завершения выкапывания, а затем гелевые шарики отфильтровывают и промывают до удаления растворителя стерильной дистиллированной водой, содержащей 0,02 мас,% Tween

80. Гелевые шарики правильной сферической формы диаметром 1 — 5 мм получены в результате этого.

Подобные результаты получают, когда изооктанол по вышеприведенному процессу заменяют на этилацетат, циклогексанол, н-амиловый спирт, бензиловый спирт, этилацетоацетат или н-бутилацетат. Параметры растворителей даны в таблице I.

П р и M е р 2. Суспензию спор

Streptomyces agrillaceurn АТСС 12956, культивируемых на среде со скошенным агаром, содержащей 0,5 мс7с,% поро:.!I а сои, 1,0 мас.% глюкозы и 2,0 мас.% rпло..нистсго

arapa, применяют для инокуляции культуральной среды, простерилизованной для этого при 121 С в течение 20 минут и затем охлажденной до комнатной температуры, следующего состава, мас.%:

Мука из лесного ореха 2,0

Гидролизованный казеин 0,2

Глицерин 4,0

Хлорид натрия 0,3

0,1

0,1

0,2

Зх10.

1.0

0,713

0,363

Культуральную среду состава, мас.%.

Холестерин 21,0

Сахар 0,5

Соевая мука 0,7

Сырой лецитин подсолнечника 0,5

Tween и 60 0,2

КН2РО4 0,1

СаСОз 0,1

NaCl 0,1

Mg S04 7Н: 0

0,05

Struktol В 0 0 0,1 стерилизуют при 121 С в течение 25 минут и затем охлаждают до комнатной темпераКарбонат кальция 0.5 (Величина рН культуральной среды, заполненной водопроводной водой, составляет до стерилизации 7,0).

5 Культуру встряхивают в течение 48 часов при 32 С на качалке со скоростью

360 об!мин, добавляют 10 смз полученной вегетативной культуры к 90 см 4%-ного водного раствора агара с температурой

10 45 С, и гелевые шарики формируют из полученной смеси, как описано в примере 1, П ример3.

Streptomyces diastatochomogenes, разновидность PO-31/M 6 00366/спорулируют

15 на среде скошенного агара следующего состава, мас.%;

Дрожжевой экстракт

Мясной экстракт

Триптон

20 Fe04

Глюкоза

Na2HP04

КН2Р04

Промытый волок25 нистый агар 2,0 (Величина рН культуральной среды, дополненной водопроводной водой, до стерилизации составляет 7,0), Спорулированную примерно в течение

30 7 — 8 дней культуру отмывают стерильной дистиллированной водой или физиологическим раствором и регулируют концентрацию суспензии спор до 3 х 10 спор/см .

Полученную суспензию спор затем обраба35 тывают так, как описано в гримере 1, для получения шариков из агарового геля.

Пример 4, Клеточную суспензию, содержащую 8 х 10 клеток/см стерильной

6 з дистиллированной воды, готовят из 4-днев40 ной культуры со скошенным агаром

Rhodococcus sp. NCAlM 8001003. Добавляют 10 см суспензии спор к 90 см стерильз з ного теплового (45 С) водного раствора

arapa и формируют гелевые шарики из сме45 си так, как описано в примере 1.

:1760985 туры (величина рН культуральной среды до стерилизации составляет 6,0). Культуральную среду инокулируют гелевыми шариками, полученными по вышеописанному, и затем встряхивают на плоском шейкере в течение 3 дней при 30 С со скоростью 300 об/мин. Уровень холестеролоксидаэы в полученном бульоне определяют методом

АИа!п и др.

Пример 5. Штамм Streptomyces

rubibaclens спорулируют на среде со скошенным агаром с составом, описанным в примере 1. Примерно 4 — 5-дневную спорулированную культуру отмывают стерильной дистиллированной водой или физиологическим соляным раствором и регулируют концентрацию суспензии спор до примерно 5 х 10 спор/см . Шарики из б агарового геля формируют из полученной суспензии спор так, как описано в примере 1, .Культуральную среду состава, мас,%;

Дрожжевой экстракт 0,1

Мясной экстракт 0,1

Триптон 0,2

FeSQ4 Зх10

Глюкоза 1,0

Агар 2,0 стерилизуют при 121 С в течение 25 минут и затем охлаждают до комнатной температуры. (Величина рН культуральной среды составляет 7,2 до стерилизации). Культуральную среду инокулируют гелевыми шариками, полученными согласно вышеописанному примеру и культуру встряхивают на плоском шейкере в течение 5-6 дней при

28 С со скоростью 280 об/мин. Полученный антибиотикдетектируютизвестным методом тон кослойной хроматографии, Пример 6. Штамм Micromonospora

inyoensis ATCC 27600 спорулируют на среде со скошенным агаром состава, приведенного в примере 3.

Примерно 7 — S дневную культуру отмывают стерильной дистиллированной водой или физиологическим соляным раствором и суспензия спор с концентрацией примерно

6 х 10 спор/см образована. Шарики из э агарового геля формируют из этой суспензии спор так, как описано в примере 1.

Полученные гелевые шарики используют для инокуляции стерильной жидкой культуральной среды состава, данного в примере 5, и кугьтуру встряхивают на плоском шейкере в течение 5 — б дней при 28 С со скоростью 280 об/мин, Полученный антибиотик может быть детектирован известным методом, с использованием Bacillus subtilis в качестве измерительного микроорганизма, 5

20 ле, Полученные результаты приведены в

30

Пример 7. 10 см вегетативной культуры Streptnmyces argillaceus ATCC 12956 описанной в примере 2, добавляют к 90 CM

4%-ного раствора агара и иэ половины этой смеси получают частицы геля по способу в соответствии с примером 1. Вторую половину приготовленной смеси добавляют по каплям к стерильному подсолнечному маслу, охлажденномудо 0 — 10 С, Частицы геля промывают, как это описано в примере 1, для удаления растворителя, соответственно масла (следует отметить, что растворитель при промывке удаляется полностью, тогда как масло при аналогичной обработке остается на поверхности частиц в виде тонкой пленки), Культуральную среду, описанную в примере 2, засевают промытыми частицами и контролируют рост и продуцирующую способность клеток, иммобилизированных в гетабл. 2.

Из приведенных в табл. 2 данных видно, что в то время, как при использовании частиц геля, осажденных по способу в соответствии с настоящим изобретением, иммобилизированные на них клети прекрасно размножаются и продуцируют антибиотики (интенсивное продуцирование антибиотиков позволяет трижды осуществлять смену культуральной среды), микроорганизмы, иммобилизированные на частицах геля, осажденных растительным маслом, размножаются медленно и слабо и вообще не продуцируют антибиотиков. Это одно-, значно подтверждает ингибирующее действие растительного масла, используемого по известному способу.

Пример 8. 10 см суспензии остатков клеток Mlcrococcus lysodeistus, продуцирующих полинуклеотид фосфорилаэу, с удаленными стенками смешивали с 90 см

4%-ного раствора агара при температуре

50 С. Частицы геля получали из этой смеси таким же образом, как это описано в примере 1.

Способ позволяет повысить продуктивность клеток в процессе синтеза антибиотиков, а также увеличить рост клеток.

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов или их частей, включающий -успендирование в водном растворе полисахарида, введение суспензии в органическую среду для образования частиц геля с включенными клетками или их частями, отделение и промывку частиц геля, отличающийся тем, что. с целью повышения продуцирующей способности

1760985 клеток или их частей, а также увеличения роста клеток, в качестве полисахарида используют агар, а в качестве органической среды — органические растворители с растворимостью в воде 0,1 — 2,85 г/100 г воды, 5

Таблица 1

Характеристики растворителей

Логарифм константы распределения каждого растворителя, измеренной в смеси Н-октан:вода

Таблица 2

Свойства клеток, иммобилизованных известным и предложенным способами

Осаж ение аство ителем

Осаж ение по солнечным маслом рост рост продуцирование продуцирование смена к ль альной с е ы смена к ль альной с е ы l0

11

12 смена к ль альной с е ы смена к ль альной с е ы

Составитель В. Муронец

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор О, Юрковецкая

Редактор

Заказ 3195 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

П родолжительность встряхивания, дни

4

6

7 вязкостью 0,455 — 7,0 cll при 20 С и температурой кипения 77,6 — 205,2 С, а суспензию вводят в органическую среду, охлажденную до 0-10 С, по каплям при скорости оседания капель 0,5-10,0 см/с.